автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.16, диссертация на тему:Методы и средства спектрофотометрии и спектральной нефелометрии для исследования жидких биоорганических сред

На правах рукописи

ЛЕВИН Александр Давидович

МЕТОДЫ И СРЕДСТВА СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ И СПЕКТРАЛЬНОЙ НЕФЕЛОМЕТРИИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЖИДКИХ БИООРГАНИЧЕСКИХ СРЕД

05.11.16 Информационно-измерительные и управляющие системы

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание } ченои степени доктора технических наук

Москва- 2007

003069471

Работа выполнена в Федеральном Государственном Унитарном предприятии Всероссийский научно-исследовательский институт оптико-физических измерений (ФГУП ВНИИОФИ)

Научный консультант - доктор технических наук Е М Рукин

Официальные оппоненты

доктор технических наук, профессор В И Саприцкий доктор физико-математических наук, профессор Г П Голубев доктор технических наук М А Карабегов

Ведущая организация -Институт биоорганической химии им М М. Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Защита состоится « % 3» ¿7 ¿Г 2007 г в 14 час на заседании диссертационного совета Д 308 006 01 при Всероссийском научно-исследовательском институте оптико-физических измерений по адресу 119361, г Москва, ул Озерная, 46

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП ВНИИОФИ Автореферат разослан « б »_О ^_2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор технических наук ~

ГН Вишняков

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИС — интерференционный светофильтр

ИФА - иммуно-ферментный анализ

ЛПК - лампа с полым катодом

МК - микроконтроллер

МНК — метод наименьших квадратов

МОА - микропланшетный оптический анализатор

MP — малоугловое рассеяние

МЭ - математический эталон

ОЕФ - относительная единица флуоресценции

ОП - оптическая плотность

ПО - программное обеспечение

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СКО — среднеквадратическое отклонение

СПЭЯ - спектральная плотность энергетической яркости

PLS - partial least squares (дробный метод наименьших квадратов)

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность темы

Оптико-спектральные методы и основанная на них аппаратура широко применяются для исследования веществ, в частности жидких сред различного происхождения

В качестве основных тенденций, характеризующих развитие этих методов в последние десятилетия, можно отметить повышение чувствительности и избирательности анализа, увеличение его производительности, совершенствование способов извпечения информации из результатов спектральных измерений и возможность анализировать все более сложные пробы и образцы Существенный стимул для развития оптико-спектральных методов дают задачи, возникающие при изучении жидкостей, содержащих объекты биологического происхождения (молекулы, клетки, микроорганизмы) и (или) биологически значимые органические вещества Такие задачи приходится решать при научных исследованиях, в клинической лабораторной диагностике, при контроле биотехнологических процессов, лекарственных препаратов и некоторых пищевых продуктов

Жидкие биоорганические среды представляют собой, как правило, достаточно сложные системы, содержащие различные вещества как в растворенном, так и во взвешенном состоянии В зависимости от решаемой задачи, в качестве информативных оптических характеристик исследуемой пробы могут использоваться спектры поглощения (пропускания), флуоресценции, хеми и биолюминесценции, индикатрисы рассеяния, параметры поляризации излучения и т п

В последнее время все чаще выделяют спектроскопию (спектрофотометрию) биологических и биологически значимых сред и объектов как самостоятельное научно-техническое направление

К биоспектроскопии примыкают и исследования воздействия на биологические объекты оптического излучения различного спектрального состава

Приборы, предназначенные для исследования биоорганических сред, должны удовлетворять ряду специфических требований Прежде всего, это совместимость с тест-системами, необходимыми для реализации требуемых аналитических технологий (биохимического анализа, иммуно-ферментного или иммуно-флуоресцентного анализа, различных методов исследования ДНК и т п) Причем эта совместимость должна обеспечиваться как на аппаратном уровне, так и на уровне программного обеспечения (ПО)

Очень существенны также возможности прибора по обеспечению высокой производительности анализа и автоматизации процесса измерений, а также по анализу малых (десятки микролитров и менее) объемов жидкости Такие возможности предоставляют микропланшетные оптические анализаторы (MOA), получившие распространение в последние 10-15 лет При исследовании биоорганических сред оказались весьма эффективными флуоресцентные методы, позволяющие обнаруживать следовые содержания веществ (на уровне сотых и тысячных долей пикомоля) и обладающие, благодаря использованию специфичных меток (флуорофоров), высокой избирательностью Это требует оснащения лабораторий доступными и надежными приборами с соответствующим методическим и метрологическим обеспечением При этом необходимо решить вопросы калибровки MOA, поддержания стабильности этой калибровки и обеспечения сопоставимости результатов, получаемых на юоветных и микропланшетных приборах

Большой интерес представляют жидкие среды, содержащие различного" рода дисперсные частицы С такими средами приходится сталкиваться, например, при анализе клеточных и бактериальных культур, белковых суспензий, контроле растворимости лекарственных препаратов Существующие методы определения параметров дисперсных частиц, основанные на измерении экстинкции или индикатрис рассеяния, не позволяют четко разделить вклад поглощения и рассеяния в общее ослабление света дисперсной средой, определять соотношение между взвешенными и растворенными в жидкости частицами

Необходима разработка методик и средств контроля метрологических характеристик приборов при испытаниях, поверке и эксплуатации Отдельного исследования требуют вопросы о соответствии характеристик точности, получаемых на контрольных образцах и на реальных пробах биоорганических сред

Современные спектральные приборы, работающие совместно с персональным компьютером (ПК), способны за короткое время получать большие массивы данных, поэтому существенно возрастает значение используемых методов обработки информации Для восстановления по зарегистрированным спектрам состава и свойств исследуемых образцов в последнее время используются методы анализа многомерных данных Они позволяют перед построением многомерной градуировки осуществлять сжатие

данных без потери полезной информации, т е понижать размерность задачи путем перехода к новым, более «содержательным» переменным Использование подобных алгоритмов дает эффективные статистические методы решения обратных задач Однако возможности этих методов реализованы к настоящему времени далеко не полностью, в частности они еще не применялись при определении параметров дисперсных систем и для обработки данных по светорассеянию

Таким образом, задачи, связанные с разработкой новых и развитием существующих оптико-спектральных методов и средств измерений параметров жидких биоорганических сред и их метрологическим обеспечением, являются весьма актуальными

1.2 Цель работы

Целью диссертационной работы является разработка приборов, методик и программного обеспечения, ориентированных на исследование жидких биоорганических сред методами флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии и нефелометрии, а также методов контроля, испытаний и метрологического сопровождения соответствующих средств измерений Поставленная цель достигается решением следующих задач: Разработкой

• микропланшетного фотометра-флуориметра для исследования биологических жидкостей,

• двулучевого спектрофотометра УФ, видимого и ближнего ИК диапазона и его модификацией для измерений спектров малоуглового рассеяния (МР),

• алгоритмов совместной обработки спектров пропускания и МР,

• методики определения параметров взвеси частиц по спектрам МР, ее математическим моделированием и экспериментальной апробацией,

® методики абсолютных измерений светового потока слабых источников оптического излучения на основе ламп с полым катодом, применяемых в спектральной фототерапии, на отдельных спектральных линиях,

• методических указаний по применению разработанного микропланшетного прибора для детекции продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуно-ферментного анализа (ИФА)

Проведением теоретических и экспериментальных исследований источников

погрешности измерений в МОА, разработкой способов выявления и

минимизации этих погрешностей

1.3 Научная новизна работы

Впервые

• 'предложен, теоретически обоснован и экспериментально опробован метод определения концентрации и размеров дисперсных частиц, взвешенных в поглощающей жидкости, основанный на совместном анализе спектров МР и пропускания света,

• оптическая схема двулучевого спектрофотометра модифицирована для измерения спектров МР,

• методы анализа многомерных данных (хемометрики) применены для

обработки спектров рассеянного из пучения и решены возникающие при этом методические вопросы,

• проведен количественный анализ специфических составляющих погрешности при измерении абсорбции и флуоресценции микропланшетными анализаторами,

• проведены систематические измерения абсолютных значений светового потока для различных спектральных линий ламп с полым катодом (ЛПК)

1.4 Практическая значимость работы

Впервые в отечественной практике создан MOA, работающий в режимах флуоресценции и абсорбции

Разработанный в рамках данной работы микропланшетный фотометр-флуориметр ФФМ-01 прошел испытания с целью утверждения типа, клинические испытания и используется в 16 организациях, как для научных исследований, так и для клинических анализов Прибор включен в Госреестр средств измерений и зарегистрирован в качестве изделия медицинской техники

Проведены клинические апробации прибора с тест-системами для ПЦР, ИФА, для биохимического и микробиологического анализа

Разработаны, согласованы, утверждены Лабораторным советом Рспотребнадзора и введены в действие методические рекомендации по применению ФФМ-01 для детекции продуктов ПЦР и ИФА

На основании проведенного анализа источников систематических погрешностей MOA выработаны рекомендации по контролю их метрологических характеристик, использованные при испытаниях с целью утверждения типа и поверки

Разработан двулучевой спектрофотометр УФ, видимого и ближнего ИК диапазона для лабораторных анализов и использования в учебном процессе, прибор прошел испытания с целью утверждения типа и включен в Госреестр средств измерений РФ, помимо регистрации спектров поглощения и пропускания, прибор был адаптирован для измерения спектров МР и эмиссионных спектров источников излучения

1.5 Апробация работы

Основные положения и результаты исследований докладывались и обсуждались на следующих научных конференциях и семинарах

1 XII Конференция «Датчики и преобразователи систем измерения, контроля и управления - Датчик 2000», Судак, май 2000 г

2 Всероссийский научно-технический семинар «Проблемы метрологического обеспечения в здравоохранении и производстве медицинской техники», Москва. 2000 г

3 II научно-практическая конференция «Идентификация качества и безопасность алкогольной продукции», Пущино, июль 2000 г

4 13 Всероссийская научно-техническая конференция «Обеспечение единства измерений в фотометрии и радиометрии оптического излучения», Москва, 2001 г

5 I Всероссийская конференция «Аналитические приборы», Санкт-Петербург, июнь 2002 г

6 I Всероссийский научно-технический семинар «Метрологическое обеспечение исследований в клинико-диагностических лабораториях», Москва, февраль 2003 г

7 IV Всероссийский научно-технический семинар «Проблемы метрологического обеспечения в здравоохранении и производстве медицинской техники», Сочи, сентябрь 2003 г

8 Дни лабораторной медицины России, Москва, октябрь 2003 г

9 Пленум Лабораторного совета государственной санитарно-эпидемеологической службы Российской Федерации, Москва, декабрь 2003 г

10 XIV научно-техническая конференция «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение», Москва, март 2004 г

11 Вторая Всероссийская научная конференция «Проектирование инженерных и научных приложений в среде МаНаЬ», Москва, май 2004 г

12 VI Международная конференция «Прикладная оптика», Санкт-Петербург, октябрь 2004 г

13 V Всероссийский научно-технический семинар «Проблемы метрологического обеспечения в здравоохранении и производстве медицинской техники», Сочи, сентябрь 2004 г

14 XV научно-техническая конференция «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение», Москва, апрель 2005 г

15 VI Всероссийский научно-технический семинар «Проблемы метрологического обеспечения в здравоохранении и производстве медицинской техники», Сочи, сентябрь 2005 г

1.6 Публикации

По теме диссертации опубликовано 35 работ , в том числе 10 статей в ведущих научных журналах из перечня ВАК

1 7 Объем и структура работы

Работа состоит из введения, шести глав, заключения, списка литературы, включающего 177 наименований Общий объем работы составляет 270 страниц, включая 20 таблиц и 60 рисунков

1.6 Основные положения, выносимые на защиту.

1 Для микропланшегных оптических анализаторов (МОА) кинематический режим движения планшета, при котором ускорение не превышает пороговой вечичины, зависящей от вязкости пробы, минимизирует случайную погрешность, обусловленную колебаниями жидкости

В режиме измерения абсорбции

- использование сходящегося светового пучка, диаметром не более одной трети диаметра лунки, минимизирует систематическую погрешность, обусловленную влиянием мениска,

- систематическая погрешность, обусловленная особенностями интерференционного светофильтра (ИС), возрастает с уменьшением отношения полосы попощения пробы и полосы пропускания ИС

2 Для калибровки микропчаншетных флуориметров в относительных единицах флуоресценции (ОЕФ) и оперативной коррекции этой калибровки в условиях эксплуатации прибора следует использовать образцы сравнения (ОС), состоящие из флуоресцирующего цветного оптического стекла и светофильтра, корректирующего интенсивность или спектральный состав излучения флуоресценции

3 Нелинейный алгоритм сравнительной градуировки позволяет обеспечить сопоставимость результатов измерения флуоресценции на кюветном и микропланшетном приборах, корректируя расхождения, обусловленные разными схемами возбуждения флуоресценции

4 Модифицированная оптическая схема двулучевого спектрофотометра позволяет регистрировать для анализируемой пробы, наряду со спектрами пропускания, спектры малоуглового рассеяния (МР)

5 Совместная обработка спектров МР и пропускания по предложенным в диссертации алгоритмам позволяет определять концентрации взвешенных и растворенных в жидкости частиц, а для монодисперсных взвесей— также и размеры взвешенных частиц

При этом для мутных окрашенных жидкостей появляется возможность разделить составляющие общего ослабления света (экстинкции), связанные с поглощением и рассеянием

6 Из спектров МР может быть извлечена, с использованием алгоритмов многомерной градуировки, информация о параметрах распределения взвешенных частиц по размерам, позволяющая контролировать процессы растворения и коагуляции

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность выбранного направления исследований, сформулированы цель и основные задачи работы, а также основные положения, выносимые на защиту, рассмотрены научная новизна и практическая значимость диссертации

Первая глава содержит обзор основных методов и средств измерений, применяемых при оптико-спектральных исследованиях биоорганических сред, там же обсуждается специфика этих сред при их исследованиях спектральными и фотометрическими методами

Кратко рассмотрены основные задачи, решаемые с помощью оптико-спектральных методов

- для атомно-абсорбционной спектрометрии -анализ токсичных элементов и микроэлементов (в том числе на уровне следов) в различных биологических образцах [3-9],

- для молекулярной абсорбционной спектрофотометрии - прямое определение биологических молекул - белков и нуклеиновых кислот, учет результатов ИФА и микробиологического анализа,

- для флуоресцентной и люминесцентной спектрометрии — биохимический анализ с повышенной чувствительностью, учет результатов ПЦР, микробиологический анализ,

- для нефелометрии и турбидиметрии - исследование клеточных и бактериальных культур, биохимический анализ, определение растворимости лекарственных препаратов

Особое внимание уделено MOA, которые во многих случаях являются предпочтительными по сравнению с кюветными спектральными приборами, поскольку минимизируют расход пробы и существенно повышают производительность анализа. Микропланшетный формат предъявляет особые требования к построению оптических схем приборов, процедурам измерений спектральных характеристик образцов и контролю точности измерений Для интерпретации результатов, получаемых с помощью микропланшетных флуориметров, необходимы калибровка прибора в ОЕФ и обеспечение ее стабильности в процессе эксплуатации прибора На момент начала работы диссертанта над тематикой, связанной с MOA (2001 год), отечественной промышленностью выпускались только микропланшетные фотометры, предназначенные для учета результатов ИФА Микропланшетные приборы, поддерживающие работу в флуоресцентном режиме, выпускаемые зарубежными фирмами (Perkin Elmer Life Science, Thermo Electron, Bio Teck Instruments, Tecan) достаточно дороги (25 -50 тысяч долларов) и недоступны многим клиническим и исследовательским лабораториям

Весьма актуальными являются задачи улучшения и контроля метрологических характеристик MOA в режимах абсорбции и флуоресценции и проблема воспроизводимости результатов, получаемых на реальных биоматериалах

Для обеспечения единства измерений необходимы как теоретическое и экспериментальное изучение источников погрешности, возникающих при

измерении абсорбции и флуоресценции с помощью MOA, так и выработка способов минимизации этих погрешностей при разработке MOA и их выявления при испытаниях и поверке этих приборов

При проведении исследовательских работ требуется во многих случаях сопоставлять между собой результаты, полученные на юоветных и микропланшетных приборах. Для решения этой задачи в абсорбционном режиме в MOA фирм Bio Teck Instruments и Thermo Electron предусмотрена функция прибора и ПО «коррекция длины пути» (pathlength correction), позволяющая «конвертировать» между собой результаты, полученные в юоветном и микропланшетном форматах Для флуоресцентного режима такие возможности в существующих MOA отсутствуют.

При изучении биоорганических сред приходится определять параметры дисперсных частиц, взвешенных в жидкости (прежде всего их концентрацию и размеры) Это требуется при решении многих задач как исследовательского, так и прикладного характера Примеры таких задач — контроль мутности питьевой воды, растворимости лекарственных препаратов, изучение клеточных и бактериальных культур, белковых суспензий, растворов полимеров Существующие методы исследования таких систем основаны на измерении угловой зависимости рассеяния монохроматического излучения (индикатрисы рассеяния) для определения размеров частиц и экстинкции, те ослабления проходящего света, для определения концентрации взвешенных частиц (мутности). Одной из нерешенных проблем является разделение вкладов в экстинкцгао поглощения света жидкостью и рассеяния на взвешенных в ней частицах. Поглощение также может оказывать искажающее влияние при измерении индикатрис рассеяния

Для извлечения максимальной информации из спектров сложных объектов оказываются эффективными современные методы анализа многомерных данных, приложение этих методов для анализа состава веществ составляет содержание хемометрики Один из основных принципов хемометрики предполагает увеличение числа переменных в одном эксперименте вместо проведения повторных анализов (параллельных определений), для уменьшения случайных составляющих погрешности Затем производится сжатие данных, осуществляемое путем перехода к новым, более информативным переменным Одним из наиболее эффективных способов многомерной градуировки, основанных на таком подходе, является дробный метод наименьших квадратов (partial least squares — PLS) Имеются примеры использования многомерной градуировки для обработки молекулярных спектров поглощения в УФ области при исследовании транспорта аминокислот (использовались спектры поглощения), для идентификации бактерий и исследования процессов в живой клетке (использовались спектры флуоресценции), а также при исследовании ряда других биологических сред. В то же время возможности многомерной градуировки для извлечения информации из оптико-спектральных данных, по мнению автора, реализованы к настоящему времени далеко не полностью В частности, эти методы еще не

применялись для получения информации о дисперсных частицах из данных по светорассеянию.

Вторая глава диссертации посвящена метрологии МОА. Произведен анализ специфических источников погрешности, которые возникают при измерении абсорбции и флуоресценции с помощью МОА, предлагаются и обосновываются методы контроля этих погрешностей и требования к оптическим схемам приборов для их минимизации [12-14,18-19,21,26]

При измерениях оптической плотности (ОП) и флуоресценции жидких проб на микропланшетных анализаторах появляются дополнительные (по сравнению с юоветными спектрофотометрами) источники как систематической, так и случайной погрешности, связанные со смещением поверхности жидкости в лунке из-за движения микропланшета и с искривлением этой поверхности за счет капиллярных эффектов Эти составляющие необходимо учитывать для совершенствования оптических схем и при выборе методов контроля метрологических характеристик приборов

Показано, что в результате движения микропланшета в процессе проведения измерений в его лунках возникают колебания жидкости с характерным временем затухания (уменьшения амплитуды в е раз)

16у g

Здесь с! —внутренний диаметр лунки, V - кинематическая вязкость жидкости; а — ускорение, с которым движется планшет, g — ускорение свободного падения

Таким образом, чем больше вязкость жидкости и чем меньше диаметр лунки микропланшета, тем быстрее будут затухать колебания и тем больше предельно допустимое значение ускорения а Оценки по формуле (1) показывают, что при ускорении 1 м/с2 и при диаметре лунки 6 мм для воды характерное время затухания т ~ 20-25 мс При измерении ОП колебания поверхности жидкости приводят к отклонениям луча, прошедшего через лунку Эти отклонения могут вызвать либо срезание луча боковой поверхностью лунки или последующими диафрагмами, либо его попадание на разные участки светочувствительной площадки фотоприемника Во всех случаях это вызовет дополнительные шумы и ухудшит воспроизводимость результатов измерений При измерениях флуоресценции колебания жидкости влияют на диаграмму направленности выходящего из лунки излучения, что также приводит к дополнительным шумам.

Данный эффект необходимо учитывать при выборе кинематических режимов движения планшета и режима регистрации сигнала Желательно, чтобы ускорение планшета можно было устанавливать программным путем в зависимости от диаметра лунки и вязкости исследуемой жидкости Кроме того, при сканировании планшета регистрация сигнала должна начинаться по истечении определенного времени задержки, в течение которого колебания поверхности жидкости в основном затухнут Длительность времени задержки должна в 3-4 раза превышать значение т, оцененное по формуле (1)

Существенный вклад в систематическую погрешность измерения ОП вносит составляющая, обусловленная мениском, который возникает из-за капиллярных явлений в лунках

Проведено количественное рассмотрение искривления поверхности жидкости вследствие капиллярных эффектов. Внутренний диаметр лунки в наиболее распространенных 96- луночных планшетах составляет 6 мм При таких диаметрах возникают капиллярные явления, в том числе искривление поверхности жидкости за счет ее взаимодействия с боковыми стенками лунки Поверхность принимает форму вогнутого мениска (рис 1), в результате чего сильно изменяется ход лучей при их прохождении через лунку Это может в той или иной степени (в зависимости от оптической схемы прибора) повлиять на измеряемое значение ОП, внося тем самым заметную систематическую погрешность Влияние мениска на погрешность измерений в микропланшетных фотометрах отмечалось и ранее, однако количественное рассмотрение этого эффекта не проводилось

\ Г 1 / */ \ / / 1 |

1 1 1 %

1

Рис.1 Виньетирование пучка боковыми стенками лунки

й -внутренний диаметр лунки, Я - радиус кривизны мениска, /? -угол отклонения мениском, луча,

параллельного оси лунки; Н — высота столба жидкости по краю лунки, И -высота жидкости в точке падения на мениск рассматриваемого луча, г — расстояние от оси лунки до луча

Капиллярные явления, в том числе искривление поверхности жидкости, становятся существенными, если радиус трубки меньше т н капиллярной постоянной, определяемой поверхностным натяжением и плотностью жидкости. Для воды капиллярная постоянная равна 3,8 мм, а внутренний радиус лунки 96 - луночного планшета составляет 3 мм

Пусть щ и г] - доли мощности излучения, теряемые из-за виньетирования соответственно в лунке сравнения и в лунке с анализируемой пробой (если ОП измеряется относительно воздуха, то т]а=0) Тогда измеренное значение ОП

о = 18™^ = ■°о + 'еО - %) -18(1 -»?)«А + 0,434(>7 - %) (2)

Здесь /о и I - интенсивности излучения, прошедшего, соответственно, через лунку сравнения и лунку с исследуемой пробой

В качестве приближенной оценки можно оценить значения Г| при падении на мениск параллельного пучка

Несложно показать, что

При г>гтах г) = ((г~г™(3)

г

При Г<Гтах 7]=0

Здесь г,„а:г -максимальное значение радиуса падающего пучка, при котором не происходит виньетирования боковыми стенками лунки

Как видно из проведенного рассмотрения, значение ДБ=0,434(г|-Г1о) для конкретной лунки зависит от высоты столба жидкости в ней и условий смачивания Поэтому нереально корректировать эту погрешность путем введения априорной поправки и влияние мениска следует устранять аппаратным путем Расчеты траекторий лучей с помощью компьютерной программы [15] показывают, что для устранения виньетирования необходимо, чтобы световой пучок, проходящий через лунку, был сходящимся

Если виньетирование имеет место, то г) растет с увеличением высоты Н столба жидкости в лунке (см рис 1), в результате чего при измерении ОП относительно воздуха нарушается линейность зависимости ЩН) Следовательно, линейность этой зависимости может быть критерием правильности выбора и настройки оптической схемы микропланшетных фотометров На практике для контроля нечувствительности оптической схемы к влиянию мениска удобнее измерять зависимость ОП не от Н, а от объема жидкости в лунке V

При измерениях ОП на реальных пробах воспроизводимость результатов, полученных на разных приборах, зависит от различий в спектральном составе источников излучения и функций пропускания интерференционных светофильтров (ИС), используемых для выделения необходимых спектральных интервалов Показано, что если в пределах потосы пропускания ИС

Гпр (?,) ~сопэ1, (4)

то В~1/Тпр, и результат измерения ОП практически не зависит от аппаратной функции ИС и других особенностей прибора

Многие окрашенные вещества, образующиеся при биохимических реакциях, имеют полосу пропускания шириной ДА.пр ~ 30 нм В этом случае соотношение (4) будет выполняться лишь при одновременном соблюдении следующих условий

а) должны примерно совпадать длины волн, соответствующие максимуму полосы поглощения пробы и середине полосы пропускания ИС

4Г-АУ, (5)

б) ширина полосы пропускания ИС по уровню 0,1 от максимума должна быть значительно меньше ширины полосы поглощения пробы

АЛф01«/1Л„р (6)

В реальных микропланшетных фотометрах условия (5-6) можно выполнить лишь приближенно Условие (5) может нарушаться из-за различий в положении полос поглощения окрашенных веществ при использовании разных тест-систем и разброса в свойствах ИС, обусловленного, в частности, старением фильтров, в результате разность -Ц может достигать нескольких нанометров Для выполнения условия (6) наиболее подходящими являются ИС с прямоугольным профилем аппаратной функция, с АЯф0 / <6-8 нм В реальных ИС, применяемых в микропланшетных фотометрах, АЯф01 может достигать 30 нм при ширине аппаратной функции на уровне 0,5 от максимума ЛХФ05 ~ 8 нм В этом случае для одной и той же пробы, полученной в результате ИФА реакции, возможны заметные различия значений ОП, измеренных на разных приборах, связанные с индивидуальными особенностями ИС

В настоящее время для контроля метрологических характеристик микропланшетных фотометров часто используются наборы нейтральных светофильтров, аттестованных по значениям ОП на нескольких длинах волн, представляющих интерес для ИФА (405 , 450 , 492 и 630 нм) Для нейтрального светофильтра изменение ОП в пределах 30 нм крайне незначительно, условие (4) выполняется с очень хорошей точностью, следовательно, систематическая погрешность, связанная с особенностями ИС проверяемого прибора, проявляться не будет. Это иллюстрируется рис 2 Видно, что среднее пропускание нейтрального светофильтра, измеренного с помощью исходного ИС и ИС со смещенным максимумом, различаются незначительно Для реальной пробы, пропускание которой заметно меняется в пределах полосы пропускания ИС, результаты измерений с помощью двух ИС существенно различаются.

Проведенное в главе 2 теоретическое рассмотрение источников погрешности МОА доказывают первое научное положение, выносимое на защиту

Рис 2 Влияние смещения максимума полосы ИС на

результаты пропускания

измерений

1 - исходное пропускание ИС, 2

о —-—^—->------

410 420 430 440 450 460 470 480 490 пш

- смещенное пропускание (например, из-за старения ИС) 3 - пропускание реальной пробы, 4 -пропускание нейтрального поверочного светофильтра

При измерении флуоресценции с помощью МОА регистрируемый сигнал зависит от функции пропускания ИС и эффективности сбора излучения в

предметном и опорном каналах, определяемой особенностями оптической схемы прибора Поэтому интенсивность сигнала измеряется в ОЕФ, которые будут различными для каждого из типов приборов Проведенный анализ факторов, влияющих на интенсивность сигнала, регистрируемого в микропланшетном флуориметре, показал, что зависимость Ф(с) этого сигнала от концентрации с флуорофора в лунке будет линейной только в том случае, когда

с« 1/[Ъ*к(А]), (7)

где /г -толщина слоя жидкости в лунке, к(Л) — показатель поглощения флуорофора на длине волны Л.

При концентрациях, сравнимых с 1/[к *к(Л]), на зависимости Ф(с) появляется загиб, вызванный поглощением в образце как возбуждающего излучения, так и излучения флуоресценции Подобный загиб наблюдается и при измерениях на юоветных флуориметрах и обусловлен так называемым «эффектом внутреннего фильтра» Влияние данного эффекта на флуоресцентный сигнал существенно зависит от оптической схемы регистрации флуоресценции. Поэтому при сопоставлении результатов измерений для одной и той же серии проб, проведенных на юоветном и микропаланшетном анализаторах, следует иметь в виду, что ход зависимости Ф(с) в нелинейной области, определенный по результатам измерений на сравниваемых приборах, будет разным Для минимизации эффекта внутреннего фильтра желательна фокусировка пучка в верхней части столба жидкости в лунке. Показано, что в микропланшетном флуориметре, при перекрытии полос пропускания ИС в каналах возбуждения и регистрации флуоресценции, за счет света, диффузно отраженного от дна лунки, возможно нарушение линейности зависимости Ф(с) также в области малых значений с. Это также необходимо учитывать при сопоставлении показаний юоветного и микропланшетного приборов

Для калибровки прибора в ОЕФ необходимо использовать флуоресцентные образцы сравнения (ОС), в литературе их часто называют флуоресцентными стандартами Проанализированы возможности создания таких стандартов на основе растворов красителей, полимерных материалов, легированных молекулами красителя, квантовых точек (полупроводниковых наночастиц), неорганических стекол Флуоресцентные ОС, использующие красители (либо в виде растворов, либо в виде молекул, введенных в полимер), имеют недостаточную стабильность Создание таких образцов на основе квантовых точек весьма перспективно, но пока не решена задача имплантации квантовых точек в твердую матрицу без ухудшения их свойств. Разработка флуоресцентных стандартов является одной из задач по созданию простых и достаточно стабильных источников слабого оптического излучения. Ранее для этих целей исследовались возможности использования различных квантовых эффектов, в том числе свечения, возникающего за счет рекомбинации электронов и ионов вблизи поверхности твердого тела [2]

Флуоресцентные ОС должны удовлетворять следующим требованиям

1) Спектры возбуждения и флуоресценции должны быть близки к соответствующим спектрам красителей, используемых в качестве флуоресцентных меток

2) Интенсивность флуоресцентного сигнала от ОС должна быть близка к интенсивности сигнала от раствора соответствующего красителя при его концентрации у верхней границы диапазона, используемого при исследованиях с данной флуоресцентной меткой

Для одновременного выполнения этих требований в диссертации предлагается использовать в качестве флуоресцентного ОС набор, состоящий из флуоресцирующего и поглощающих цветных оптических стекол Поглощающие цветные стекла могут потребоваться для корректировки спектрального состава излучения флуоресцирующего стекла таким образом, чтобы обеспечить выполнение требования 1 Наряду с цветными стеклами, выделяющими требуемый спектральный интервал, в такую систему могут войти нейтральные светофильтры, ослабляющие возбуждающее излучение и излучение флуоресценции до уровня, соответствующего требованию 2 Если Т - пропускание такого светофильтра в используемом спектральном интервале, то он вызовет общее ослабление флуоресцентного сигнала в (1/Т)2раз (в (1/Т) раз ослабится интенсивность возбуждающего излучения и во столько же раз интенсивность собственно флуоресценции) В табл. 1 указаны марки флуоресцирующих цветных оптических стекол, пригодных для использования в флуоресцентных ОС, эквивалентных некоторым красителям, применяемым в качестве флуоресцентных меток при исследовании биообъектов Один и тот же ОС может быть использован для нескольких красителей, имеющих сходные флуоресцентные спектры Таблица 1.

Цветные флуоресцирующие оптические стекла, которые могут быть

рекомендованы для флуоресцентных ОС

№ п п Красители Марка цветного стекла

1. Р1ТС, 5-РАМ, 6-ТЕТ ЖС-19

2. 4-МеЦ СЗС-17

3. 5-ТАМЛА ОС-12

Флуоресцентные ОС на основе неорганических стекол предложено использовать в условиях эксплуатации прибора для оперативной коррекции флуоресцентного сигнала перед каждым сеансом измерений. В этом случае в каждом сеансе измерений регистрируется флуоресцентный сигнал от ОС Р„ и сравнивается с его номинальным значением Р„ „ом Получаемое при измерениях значение сигнала для каждой пробы 7*/ заменяется на его скорректированное значение

(8)

Таким образом компенсируется изменение чувствительности регистрирующей системы прибора

С помощью флуоресцентных ОС можно также обеспечить единую калибровку приборов в ОЕФ, учитывая при этом нелинейность отклика регистрирующей системы на флуоресцентный сигнал Для этого следует провести измерения флуоресцентного сигнала для нескольких ОС, номинальные значения флуоресценции которых лежат в пределах динамического диапазона прибора Затем методом наименьших квадратов подобрать зависимость Рнони.=/(Ри1М1), функция / может быть аппроксимирована квадратичной или кубической параболой. Коэффициенты этой параболы запоминаются компьютерной программой; при проведении измерений проб с помощью функции / вычисляется «приведенное» значение сигнала, те выраженное в ОЕФ, использованных при калибровке Если по описанной процедуре откалибровать микропланшетные флуориметры разных типов, то при измерении одних и тех же проб должны получаться совпадающие (с точностью до инструментальной погрешности) результаты Более сложная ситуация возникает при необходимости сопоставления результатов, полученных на кюветных и микропланшетных флуориметрах Выше указывалось, что эффект внутреннего фильтра, который действует за пределами области малых концентраций, по-разному изменяет зависимость флуоресцентного сигнала от концентрации для кюветных и микропланшетных приборов Поэтому для обеспечения сопоставимости результатов в этом случае следует производить измерения на кюветном и микропланшетном приборах для растворов сравнения, близких по составу к исследуемым пробам, а затем получить для одного из приборов «функцию приведения» / указанным выше способом

Третья глава диссертации посвящена разработке и исследованию микропланшетного фотометра- флуориметра ФФМ-01 [9-11,20] При этом были использованы способы минимизации систематических и случайных составляющих погрешности, предложенные и обоснованные в главе 2 Оптическая схема прибора, обеспечивающая работу в режимах абсорбции и флуоресценции, приведена на рис 3

Для фокусировки возбуждающего излучения и сбора излучения флуоресценции целесообразно использовать одну и ту же линзу, а разделение соответствующих световых пучков осуществлять с помощью светоделительной пластины Подобная схема используется, в частности, в флуоресцентной микроскопии, в этом случае ее называют схемой регистрации эпи-флуоресценции Схема, примененная в данном приборе является достаточно светосильной — относительное отверстие ~ 1.

013 12

Поворот на 6 позиции

1 I3 1 1 I т _11 101 - , '1 ■ \ _ 1 Поворот на 6 позиции л' 5 .в

-==гнн---«--- 4 ---

V ьЛ— 4 < 1 8

Лунка планшета

± 14а □ 15

Рис 3 Оптическая схема фотометра-флуориметра ФФМ-01 1 — галогенная лампа, 2,3- коллиматорные линзы, 4 - турель с ИС осветительного канала; 4а- линза, 5 - светоделительная пластина, 6,11,14, 14а-фокусирующие линзы, 7, 15 - фотодиоды, 8-линза; 9 - лунка планшета, 10-турель с ИС канала регистрации флуоресценции, 12-диафрагма, 13-фотоэлектронный умножитель (ФЭУ)

В процессе сканирования микропланшет перемещается таким образом, что его лунки последовательно оказываются в фокальной области светового пучка, сформированного осветительной системой

Галогенная лампа 1 находится в фокусе коллиматорной линзы В качестве коллиматорной в пучке может находиться одна из линз 2 или 3, в зависимости от требуемого размера фокального пятна в плоскости планшета (линза 2 обеспечивает диаметр фокального пятна около 4 мм, а линза 3 - порядка 2 мм) Для работы с планшетами, содержащими до 96 лунок включительно, рекомендуется диаметр фокального пятна 4 мм, для планшетов с 192 или 384 лунками - 2 мм Выходящий из коллиматорной линзы параллельный пучок проходит через один из ИС, закрепленных в гнездах турели 4 Смена ИС производится путем поворота турели 4 с помощью шагового двигателя

Прошедший через ИС пучок светоделительной пластиной 5 делится на две части Проходящее излучение линзой 6 фокусируется на фотоприемник 7 опорного сигнала Отраженное излучение направляется на лунку планшета Характер фокусировки этого излучения различается для режимов абсорбции и флуоресценции В режиме флуоресценции точка фокусировки находится в верхней части столба жидкости в лунке, а при измерении в режиме абсорбции (для минимизации рассмотренного выше влияния мениска) - ниже дна лунки

При работе в режиме измерения абсорбции используются прозрачные планшеты Прошедшее через лунку 9 излучение линзами 14 и 14а фокусируется на фотодиод 15 Световые диаметры линз 14 и 14а выбирались таким образом, чтобы все излучение, прошедшее через лунку 9, было сфокусировано на светочувствительной площадке фотоприемника 15

При работе в режиме измерения флуоресценции используются непрозрачные планшеты В пробе, находящейся в лунке, возбуждается излучение флуоресценции, сбор которого осуществляется линзой 8 Параллельный пучок, вышедший из линзы 8, проходит через один из ИС, закрепленных в турели 10. Смена ИС осуществляется путем поворота этой турели После прохождения через ИС излучение флуоресценции линзой 11 фокусируется на диафрагму 12, а затем попадает на ФЭУ13

Возможность работы в УФ области спектра (230 -300 нм) предусматривается только для режима абсорбции В этом случае в состав прибора в качестве дополнительного источника излучения вводится дейтериевая лампа с полым катодом, прибор комплектуется ИС, выделяющими необходимые линии в УФ диапазоне, а все линзы и светоделительная пластина 5 изготавливаются из кварцевого стекла.

Для перемещения относительно светового пучка исследуемый планшет помещается в рамку-держатель, в которой, помимо крепления планшета, предусмотрены 4 вспомогательных гнезда, из которых 3 используются для помещения флуоресцентных ОС, а одно гнездо является сквозным, через него производится обнуление при измерении ОП относительно воздуха

Привод перемещения позволяет устанавливать в световой пучок (на место лунки 9) любую лунку планшета и любое вспомогательное гнездо Каждой паре ИС, используемой в режиме измерения флуоресценции, ставится в соответствие определенный флуоресцентный ОС, сигнал от которого измеряется перед началом очередного сканирования планшета Полученное значение используется при обработке данных для оперативной корректировки чувствительности прибора в соответствии с формулой (8)

Управление прибором, прием, обработка и интерпретация данных полностью осуществляются от ПК с помощью специализированного ПО. Кроме того, ПО поддерживает цифровую фильтрацию входных сигналов и математическую коррекцию систематической погрешности в режиме измерения абсорбции, обусловленную нелинейностью фотоприемной системы Для обеспечения сопоставимости результатов, полученных на приборах разных типов, в ПО предусмотрен нелинейный алгоритм сравнительной градуировки, проводящейся путем измерения сигналов флуоресценции от нескольких образцов на сравниваемых приборах и вычисления для одного из них упоминавшейся выше нелинейной функции приведения.

Таким образом, в приборе реализованы обоснованные в главе 2 способ поддержания стабильности градуировки в ОЕФ с помощью ОС на основе цветных стекол и нелинейный алгоритм сравнительной градуировки кюветного

и микропланшетного приборов Это доказывает второе и третье научные положения, выносимое на защиту

Для контроля метрологических характеристик ФФМ-01 при испытаниях и поверке прибора предусматривается использование аттестованных смесей флуоресцеина натрия с концентрациями, лежащими в диапазоне от 0,01 пмоль/100 мкл до 100 пмоль/100 мкл Процедура приготовления смесей регламентирована так, чтобы обеспечить значение водородного показателя рН= 9, при котором квантовый выход фл> оресценции для флуоресцеина натрия максимален и достигает 93% При определении характеристик прибора в режиме измерения абсорбции наряду со стандартными операциями с использованием стеклянных светофильтров для контроля чувствительности к влиянию мениска производилось измерение зависимости D(V) (оптической плотности от объема жидкости в лунке), необходимость которого была обоснована в главе 2

Прибор имеет следующие метрологические характеристики В режиме флуоресценции

Спектральный диапазон, нм 350 -700

Предел обнаружения по флуоресцеину, пмоль, не более 0,01

Время анализа планшета с 96 лунками, с, не более 100

Динамический диапазон не менее 104.

Относительное среднеквадратическое отклонение (СКО)

при концентрации флуоресцеина 1 пмоль/100 мкл, % не более 1,5

В режиме абсорбции

Спектральный диапазон, нм 350-700

(имеется возможность расширения на УФ область, 230 -350 нм) Диапазон измеряемых значений оптической плотности, Б, 0-3.

В диапазоне от 0 до 0,5 Б

СКО, Б не более 0,002

Систематическая составляющая погрешности, Б не более 0,01

В диапазоне от 0,5 до 3 Б

Относительное СКО, % не более 0,5

Относительная систематическая составляющая

погрешности, % не более 2,5

Примечание Приведенные арактеристики систематической и случайной погрешности для режима абсорбции определены по стеклянным светофильтрам

Прибор прошел испытания с целью утверждения типа и клинические испытания, он включен в Госреестр средств измерений и зарегистрирован в

Рос здрав надзоре РФ в качестве изделия медицинской техники. ФФМ-01 представляет собой первый отечественный МОА, поддерживающий работу в режиме измерения флуоресценции. Общий вид прибора показан на рис.4.

Рис.4 Микропланшетнын фотометр-флуориметр ФФМ-01.

В четвертой главе изложены результаты апробаций прибора с реальными биологическими пробами при учете результатов ПЦР, ИФА, биохимического и микробиологическог о анализа [23,27,29,31].

В ходе этих апробаций результаты, получаемые с помощью прибора ФФМ-01, сравнивались с данными, получаемыми на тех же пробах с помощью Других (референтных) методов или приборов- Такие сравнительные испытания необходимы для того, чтобы выяснить, насколько полно имеющиеся средства контроля позволяют определить все существенные источники инструментальной погрешности, встречающиеся при работе с реальными биологическими пробами.

Для получения полной информации о результатах сравнительных испытаний необходимы следующие данные:

- сопоставление количественных результатов по контрольным образцам, входящим в состав тест-систем;

- сопоставление количественных результатов по пробам пациентов (во многих случаях такое сопоставление следует вести отдельно по группам кормы и патологии);

- сопоставление интерпретаций результатов по превышению контролируемых пороговых уровней.

Апробация прибора в качестве ИФА анализатора (абсорбционный режим) производилась на базе лаборатории особо опасных бактериальных инфекций Федерального центра гигиены и эпидемиологии (ФЦГЭ) Рос потреб надзора. В процессе апробации производилось исследование сывороток крови обследуемых лиц на наличие вирусных инфекций. Результаты, полученные с использованием ФФМ-01 в режиме абсорбции, сравнивались с данными, полученными на тех же пробах с использованием фотометра «Multiscan ЕХ» фирмы «Thermo Lab systems» (ныне входит в корпорацию «Thermo Electron»).

Фотометры МиШБсап указанной и других моделей в течение ряда лет применяются в клинических лабораториях России и других стран При испытаниях использовались зарегистрированные в Минздраве России и пригодные к употреблению тест-системы с диагностическими и подтверждающими тестами на ВИЧ, гепатиты В и С. Всего было проанализировано 255 проб обследуемых лиц и 21 контрольный образец, входивший в состав диагностических наборов По всем проанализированным пробам зафиксировано совпадение диагностических результатов Наряду со сравнением диагностических результатов было произведено сопоставление значений ОП, полученных на сравниваемых приборах по всем проанализированным пробам Для сопоставления результатов были построены уравнения линейной регрессии и вычислены коэффициенты корреляции В качестве примера на рис 5, а и б, приведены графики регрессионных зависимостей между значениями ОП, пол; чгчп.,!"" на сравниваемых приборах Обращают на себя внимание высокие значения коэффициентов корреляции (И2>0,99)

Рис 5 Регрессионная зависимость между значениями ОП, измеренными на ФФМ-01 и фотометре «Мультискан» а) подтверждающий тест на вирусный гепатит В, б) подтверждающий тест на вирусный гепатит С

Результаты сравнения позволяют сделать следующие выводы

1) Для всех проб, по которым было проведено сопоставление, характерны высокие значения коэффициентов корреляции, что свидетельствует о преобладании систематической составляющей погрешности над случайной

2) Для реальных ИФА проб различия между значениями ОП, полученными на сравниваемых приборах, больше, чем при сопоставлении показаний этих приборов на поверочных нейтральных светофильтрах

Сопоставляя это с результатами теоретического рассмотрения, проведенного в главе 2, можно заключить, что основными источниками различий в значениях ОП являются особенности ИС; возможно также разное влияние мениска поверхности жидкости в лунке, связанное с различиями в оптических схемах сравниваемых приборов

Апробация прибора для детекции продуктов ПЦР (режим флуоресценции) проводилась в Институте иммунологии РАМН и ФЦГЭ Роспотребнадзора. Результаты, полученные на приборе ФФМ-01 с использованием гибридизационно-флуоресцентного метода детекции на отечественных тест-наборах серии ПЛАТАН (разработаны научно-производственной фирмой «ЛИТЕХ»), сравнивались с данными, полученными на тех же пробах с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза Кроме того, в Институте иммунологии для сравнения использовались данные, полученные гибридизационно-флуоресцентным методом с использованием тест-систем FLASH (разработаны фирмой «ДНК-технология») и флуоресцентного детектора ДЖИН В качестве объекта испытаний в ФЦГЭ использовались урогенетальные мазки на наличие хламидий, микоплазмы, уреоплазмы от 52 пациентов, а в Институте иммунологии - 13 пациентов на хламидии и вирусный гепатит В. По всем проанализированным пробам было зарегистрировано совпадение результатов качественного анализа

Были также проведены пробные измерения по учету с помощью ФФМ-01 результатов ПЦР для проб, находящихся в пробирках, поскольку на такую детекцию рассчитаны некоторые из тест-систем с гибридизационно-флуоресцентным детектированием по конечной точке. Детекция в пробирках обеспечивает большую достоверность анализа, поскольку позволяет избежать получения ложно-положительных результатов за счет переноса по воздуху фрагментов ДНК из одной лунки в другую (так называемой контаминации). Был изготовлен специальный держатель, рассчитанный на 96 пробирок, который помещается в прибор вместо планшета Использовались стандартные ПЦР пробирки емкостью 200 мкл с прозрачными крышками В НПФ «ЛИТЕХ» были проведены сравнительные измерения флуоресцентных сигналов, полученных от проб пациентов (ПЦР анализ на гепатит В) на приборах ФФМ-01 по конечной точке и ПЦР анализаторе реального времени фирмы Applied Biosystems по окончании всех циклов амплификации Была выявлена достаточно высокая корреляция между результатами, полученными на сравниваемых приборах (R2 =0,85) Это указывает на возможность использования прибора с ПЦР пробирками, однако для установления погрешности таких измерений требуются специальные исследования

По результатам испытаний в ФЦГЭ были разработаны Методические рекомендации «Учет результатов иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции с помощью фотометра-флуориметра микропланшетного ФФМ-01» В мае 2006 г по рекомендации Лабораторного совета Роспотребнадзора они были утверждены и введены в действие [31]

Была также проведена клиническая апробация прибора для флуоресцентной детекции при определении фенилаланина в сухих пятнах крови новорожденных [27] Это специфический вид биохимических анализов, он проводится в рамках обследования (скрининга) новорожденных на наследственное заболевание - фенилкетонурию (ФКУ) Соответствующие тест-системы рассчитаны на микропланшетный формат и флуоресцентную

детекцию, поскольку требуются низкие пределы обнаружения при минимальном количестве пробы В настоящее время для скрининга новорожденных на ФКУ и последующего контроля широко используется набор есФА-флуор», разработанный ООО «Инновационные биотехнгологии» при Институте биохимии РАН Принцип его работы заключается в образовании флуоресцирующих комплексов фенилаланина с веществами, входящими в состав набора По флуоресцентным сигналам определяется концентрация фенилаланина в анализируемых пробах. Детекция флуоресценции производится с возбуждением на длине волны 390 нм и регистрацией на длине волны 485 нм. Клиническая апробация прибора производилась в Федеральном центре неонатального скрининга на базе Детской психиатрической больницы № б В ходе апробации сравнивались результаты, полученные от одних и тех же проб на приборах ФФМ-01 и Р1иого5сап

Проводилось сопоставление результатов, полученных как по протоколу первоначального контроля (скрининга) на ФКУ (1 лунка на обследуемого), так и по протоколу подтверждения диагноза (2 лунки на обследуемого) Всего в ходе апробации были сравнены пробы 2594 пациентов, в том числе 2491 пациента в режиме скрининга и 103 пациента в режиме подтверждения диагноза. Для наглядного сопоставления полученных результатов на рис 6 приведены примеры регрессионных зависимостей между значениями концентрации фенилаланина, полученными на названных приборах в режимах скрининга (а) и подтверждения диагноза (б), а на рис. 7 - разностные диаграммы

Примечание Разностные диаграммы используются при сопоставлении результатов, полученных разными методами как альтернатива вычислению коэффициентов корреляции и построению регрессионных зависимостей. По оси абсцисс разностной диаграммы откладывается определяемая величина (например, концентрация или оптическая плотность), а по оси ординат — разность между значениями этой величины, найденными для одних и тех же образцов с помощью сравниваемых методов или приборов Этот метод сравнения отличается наглядностью, он позволяет, в частности, определить, насколько различие результатов, полученных сравниваемыми методами, укладывается в допустимые пределы

При количественном определении содержания фенилаланина в пробах средние значения коэффициента корреляции между данными, полученными с помощью приборов ФФМ-01 и Флуороскан, составили при скрининге 0,77 и при подтверждении диагноза 0,98 По всем проанализированным пробам зафиксировано совпадение диагнозов, полученных с помощью испытуемого прибора ФФМ-01 и прибора Р1иогозсап Корректность результатов подтверждается также хорошей корреляцией между значениями концентраций фенилаланина в контрольных образцах и флуоресцентными сигналами, полученными от этих образцов

Рис 6 Сравнение концентраций фенилаланина, полученных на приборах ФФМ и Ркюгозсап а) режим скрининга, б) режим подтверждения диагноза

0 25 -л

02 J

0 15 ч 0 1 ,

0 05 -

0 -I

-0 05 I -о 1 -" -0 15 --02 --0 25 -

- - г;

** ~ Ч — io--* —. ♦—.---

номер лунки

Рис 7. Разностная диаграмма режим скрининга

Средний коэффициент вариации для концентраций фенилаланина, определенных на сравниваемых приборах, CV=8-10 %, что существенно ниже значения, полученного при сравнительных испытаниях с ПЦР тест-системами ПЛАТАН (СУплатан = 15-25%) Это связано с тем, что в тест системе ФА-флуор, в отличие от системы ПЛАТАН, предусматривается определение не интенсивностей флуоресценции, а концентраций, рассчитанных по градуировочному графику, причем стандартные образцы, используемые для его построения, помещаются в лунки того же планшета, что и анализируемые пробы

Была также проведена апробация прибора с целью выявления возможности его использования в микробиологическом анализе [29] В отличие от ИФА, при микробиологическом исследовании идентификацию проводят по совокупности результатов измерений ОП на нескольких (до 8) длинах волн, сравнивая их с результатами, полученными на обучающем наборе бактериальных культур и хранящимися в базе данных компьютера В настоящее время единственными анализаторами, применяемыми для микробиологического анализа с использованием стандартных 96-луночных микропланшетов, являются планшетные фотометры «iEMS-Reader» и «Multiscan Accent», выпускаемые уже упоминавшейся выше фирмой «Thermo Labsystems». Вопрос о применимости для этих целей других микропланшетных анализаторов остается открытым. При испытаниях для учета результатов ИФА

было показано, что для МОА разных моделей при совпадении значений ОП, измеренных на поверочных планшетах с нейтральными светофильтрами с погрешностью до 2+3 %, возможно существенное (более 10 %) различие этих значений для реальных ИФА проб. В связи с этим представляло интерес провести сравнительные испытания микропланшетных фотометров с использованием некоторых тест-систем для микробиологического анализа. Такие испытания были проведены на базе Бактериологической лаборатории Городской клинической больницы № ] 5 имени О.М. Филатова .

В ходе испытаний использовались наборы ЭНТЕРОтеет ] 6 для идентификации микроорганизмов семейства Enter obacteriac гае, СТАФИтест 16 для идентификации стафилококков и СТРЕПТОтест 16 для идентификации стрептококков, производства фирмы «Лахема» (Чехия), а также штаммы соответствующих микроорганизмов.

Измерения оптической плотности относительно воздуха выполнялись на стрипах 96-луночных планшетов на длинах волн 405, 450 и 492 нм на каждом из приборов, а также при 620 нм на приборе «iEMS-Reader» и при 630 нм на приборе ФФМ-01.

При работе с реальными пробами была подтверждена хорошая сходимость результатов при повторных измерениях для каждого из сравниваемых приборов, (результаты повторных измерений для каждой лунки отображены разными цветами) (рис. 8), Случайная составляющая погрешности была порядка 1 %

г

s IS

I и

5..

ШЛ I язи=реыие

НМ iaJHfJtiHste

llllilll

Е1 FI СИ H1

Рис. 8. Сходимость значений оптической плотности: а) прибор ФФМ-01, СТАФИтест 16, стрип ¡; б) прибор «iEMS-Reader», СТАФИтест 16, с трип I.

Па длинах волн 450 и 492 нм по всем исследованным тест-системам -средние значения коэффициентов вариации tie превышали 10%. На длине волны 405 нм среднее значение коэффициента вариации доходит до 36,5 % на тест-;истеме СТАФИтест 16, на тест-системах СТРЕПТОтест 16 и ЭНТЕРОтеет 16 эти значения составили соответственно 27,5% и 20%, При сопоставлении результатов, полученных на «iEMS-Reader» для длины волны 620 нм и на ФФМ-01 для длины волны 630 нм, среднее значение коэффициента вариации доходит до 21,2% на тест-системе СТАФИтест 16. Различие в результатах измерения ОП на длине волны 405 нм для приборов

«1ЕМ5-Кеас1ег» и ФФМ-01 объясняется, скорее всего, различием в оптических характеристиках ИС на эту длину волны, установленных в приборах. В главе 1 было показано, что особенности ИС влияют на результат тем сильнее, чем уже полоса поглощения пробы [см. неравенство (6)]. Полученные данные являются дополнительным доказательством этой закономерности ( первое научное положение, выносимое на защиту).

На рис. 9 приведены разностные диаграммы, на которых по оси абсцисс отложены значения ОП, измеренные на приборе «¡ЕМ$-11еас!ег», который принят в качестве образцового, а по оси ординат - разность значений ОП для одного и того же образца, измеренная на сравниваемых приборах. Разные стрипы соответствуют разным биохимическим реакциям. Видно, что для реакций в стрипах 2 и 4 результаты на двух приборах совпадают гораздо лучше, чем в стрипах 1 и 3. Скорее всего, это связано с шириной полосы поглощения соответствующих окрашенных веществ. В результате испытаний получена хорошая линейная корреляция (коэффициенты К" не менее 0,8) даже для длины волны 405 нм, где наблюдаются значительные расхождения между измеренными значениями ОП.

Полученные результаты показывают, что для использования анализаторов ФФМ-01 в микробиологическом анализе необходимо произвести дополнительные измерения ОП на обучающем наборе штаммов различных микроорганизмов на тех длинах волн, где были зарегистрированы значимые отличия между показаниями ФФМ-01 и <«ЕМ5-Кеа<1ег». Полученные результаты должны быть добавлены в базу данных, используемую для идентификации микроорганизмов. Линейная зависимость между результатами измерения ОП на сравниваемых приборах даст возможность свести к минимуму число необходимых дополнительных измерений.

т «>

£ ^

ш

Т В.М

I о

0 '00$

«А

Л Л ♦

Ш (ОП!

1

Ш$ (ОП)

Рис.9. Разностные диаграммы значений оптической плотности, измеренных на сравниваемых приборах {диагностический набор СТАФИтест 16):

а) на длине волны 450 нм, б) на длине волны 492 нм.

Обобщая результаты проведенных клинических апробаций, можно заключить, что во флуоресцентном режиме лучшая воспроизводимость результатов измерений на разных приборах получается, если сопоставляются не сигналы флуоресценции, выраженные даже в одних и тех же ОЕФ, а

концентрации флуоресцентной метки, рассчитанные по градуировочному графику, построенному с помощью калибровочных стандартов, размещенных в лунках того же планшета, что и анализируемые пробы В абсорбционном режиме при измерениях с реальными пробами как при иммуноферментном, так и при микробиологическом анализе, получаются более существенные различия в значениях ОП, чем при сопоставлении показаний этих приборов при использовании поверочных нейтральных светофильтров Основными источниками этих различий являются факторы, проанализированные в главе 2, т.е особенности интерференционных светофильтров и неодинаковое влияние мениска поверхности жидкости в лунке, связанное с различиями в оптических схемах сравниваемых приборов

В пятой главе описан разработанный в диссертации двулучевой спектрофотометр УФ, видимого и ближнего ИК диапазона, предназначенный, в частности, для анализа биоорганических сред [17,24,28].

В спектрофотометре используется схема монохроматора с вогнутой дифракционной решеткой (ДР), причем ось вращения решетки проходит через ее центр, а угол между падающим и дифрагированным лучами является постоянным Использована голографическая дифракционная решетка, имеющая 800 штр /мм Применение топографической решетки, адаптированной к конкретной оптической схеме, позволило свести к минимуму аберрации, свойственные сферической ДР. Привод ДР не содержит классического синусного механизма, часто используемого в дифракционных монохроматорах Управление шаговым двигателем (ТПД), осуществляющим вращение привода, осуществляется от ПК через микроконтроллер (МК) Для заданного значения длины волны X ПК вычисляет соответствующее число шагов ШД - N и передает его в МК Это дает возможность свести настройку (калибровку) по шкале длин волн к подбору параметров зависимости ЩЯ) и вводу этих параметров в МК монохроматора При этом появляется возможность в необходимых случаях осуществлять корректировку настройки программным путем

Для реализации описанного способа настройки монохроматора используются бальмеровские линии дейтериевой лампы (656,1 нм и 486,0 нм), а также линии ртути и неона, излучаемые ртутной ЛПК с неоном в качестве газа-наполнителя Для спектральной калибровки и контроля метрологических характеристик в условиях эксплуатации используется ртутная ЛПК с полым катодом, которая имеет те же габариты и цоколевку, что и дейтериевая лампа, используемая в этом приборе в качестве штатного источника излучения для УФ области спектра. При проведении процедур калибровки или контроля погрешности прибора по спектральной шкале ртутная лампа устанавливается в корпус прибора на место дейтериевой Полый катод изготовлен из сплава ртути и серебра, в качестве газа-наполнителя используется неон при давлении в несколько миллиметров ртутного столба В спектре излучения лампы присутствуют как линии паров ртути, так и линии неона Благодаря использованию разряда в полом катоде присутствует целый ряд линий неона, которые не удается наблюдать в дуговых ртутных лампах, обычно

используемых для калибровки спектральных приборов Особенно это относится к диапазону длин волн от 750 до 900 нм Помимо спектральной калибровки, лампа может использоваться для контроля спектрального разрешения прибора в различных участках спектрального диапазона Спектрофотометр УСФ-01 прошел испытания с целью утверждения типа и включен в Госреестр средств измерений РФ

Одним из новых приложений спектрофотометра явилось его использование для измерений потока излучения на отдельных спектральных линиях облучателей для спектральной фототерапии «Спекто-Р» Возможность таких измерений имеется потому, что ламповый отсек спектрофотометра допускает установку вместо штатной дейтериевой лампы другого источника излучения, размеры которого могут варьироваться в достаточно широких пределах Облучатели «Спекто-Р» предназначены для воздействия на биологически активные точки излучением с линейчатым спектром, они выполнены на основе ЛПК, их спектр излучения состоит из атомных спектральных линий

В литературе имеется очень мало данных об абсолютных значениях мощности излучения ЛПК на отдельных спектральных линиях. Для их измерения у излучателей «Спекто-Р» был выбран метод сравнения с образцовым источником При выборе образцового источника и всей схемы измерений приходилось учитывать, что излучение ЛПК на отдельно взятых спектральных линиях является достаточно слабым

Поскольку тело свечения ЛПК является протяженным источником излучения, входной щелью монохроматора спектрофотометра вырезается только часть его изображения Для корректности пересчета данных от образцового излучателя к исследуемому необходимо, чтобы пространственные распределения мощности излучения в плоскости входной щели монохроматора совпадали Поэтому в качестве образцового лучше брать источник излучения на основе ЛПК При этом желательно, чтобы образцовый и исследуемый излучатели имели одинаковую геометрию полого катода и ЛПК в целом Другим требованием к образцовому излучателю является наличие четко разрешаемых спектральных линий в спектральном диапазоне от 350 до 750 нм, поскольку именно в этом диапазоне находятся спектральные линии, используемые в облучателях «Спекто-Р» Кроме того, спектральные и энергетические параметры образцовых излучателей должны быть как можно более стабильными Исходя из изложенных требований, был использован образцовый источник на основе ЛПК на ванадий Поскольку геометрия всех ЛПК, используемых в облучателях «Спекто-Р», одинакова, то при единообразной установке образцового источника и исследуемого облучателя в ламповом отсеке спектрофотометра будут вырезаться одинаковые доли светового потока

В спектре выбранного образцового источника присутствуют линии как ванадия, так и газа наполнителя ЛПК — неона В качестве опорных были выбраны линии ванадия 369,5 , 411,2 , 439,5 , 487,0 нм и линии неона 585,2 , 639,2 и 703,2 нм Для этих линий на вторичном эталоне единицы спектральной

плотности энергетической яркости (СПЭЯ) С И Аневским и О А Минаевой были проведены абсолютные измерения мощности Полученные данные позволили проградуировать спектрофотометр в абсолютных единицах мощности Градуировка проводилась путем измерения сигнала в опорном канале спектрофотометра для каждой из линий при спектральной ширине щели 5 нм Значения градуировочной функции А(Х) определялись для указанных выше длин волн, как отношения абсолютного значения мощности излучения на данной спектральной линии Ф(Я), измеренного с помощью вторичного эталона единицы СПЭЯ, к числу отсчетов АЦП в опорном канале спектрофотометра ЩЛ)

А(Х)=Ф(Х)/ЩХ) (9)

Для большинства элементов резонансные линии, которые обычно используются у ЛПК в спектральных приборах, лежат при длинах волн короче 350 нм, те. полностью или частично подавляются линзами из стекла К-8, которые устанавливаются на выходе облучателей «Спекто-Р» Поэтому для всех типов облучателей пришлось заново провести выбор спектральных линий, по которым целесообразно нормировать их выходную мощность

Результаты измерений на выбранных линиях по методике, изложенной выше, приведены в табл 2.

Таблица 2

Элемент Длина волны, нм Мощность, мкВт

Алюминий 396,1 0,099

Барий 553,6 0,062

Бериллий 332,1 0,033

Бериллий 332,1 0,029

Ванадий 439,5 0,065

Железо 371,9 1,521

Калий 766,5 0,174

Кальций 422,7 0,089

Кобальт 387,3 0,211

Литий 670,7 1,617

Магний 518,4 0,097

Марганец 403,1 1,588

Элемент Длина Мощность,

волны, мкВт

нм

Медь 324,7 0,168

Натрий 588,9 0,238

Никель 352,4 0,790

Ртуть 546,1 0,028

Свинец 405,8 0,461

Серебро 338,3 0,880

Стронций 460,7 0,030

Сурьма 352,0 0,082

Титан 430,6 0,319

Фосфор 602,4 0,072

Хром 425,4 0,090

Цинк 481,1 0,052

Цинк 481,1 0,0525

Самая яркая из исследованных линий примерно в 60 раз превышает по интенсивности самую слабую Для бериллия и цинка измерения проводились на двух экземплярах облучателей, результаты этих измерений хорошо согласуются между собой

Шестая глава диссертации посвящена разработке методов определения параметров дисперсных частиц, взвешенных в жидкости, по спектрам МР [30,32-34].

Существующие методы исследования таких систем основаны на измерении либо индикатрис рассеяния, либо спектров экстинкции с последующим решением обратных задач, как правило, численными методами В обоих случаях результаты измерения существенно зависят от поглощения (абсорбции) света жидкостью, в которой взвешены рассеивающие частицы

Предлагаемая методика основана на измерении на одном приборе (модифицированном спектрофотометре) спектров МР и пропускания и их совместной обработке с целью разделения влияния рассеяния и поглощения

Для выяснения предсказательных возможностей спектров МР была построена компьютерная модель, позволяющая рассчитывать эти спектры в заданных диапазонах углов и длин волн при варьировании параметров ансамбля рассеивающих частиц

Использовались уравнения теории Ми и приближение однократного рассеяния, справедливое либо при малой концентрации рассеивающих частиц, либо в слоях малой толщины Форма частиц предполагалась сферической Из теории Ми следует, что в прозрачной среде при неполяризованном падающем излучении дифференциальное сечение рассеяния определяется формулой

— = -4-т*[М2+И!] (10)

(¡О. 8 кгп) 1 " 1 21 4 '

Здесь Я - длина волны света в вакууме, пг — показатель преломления среды, в которой находятся рассеивающие частицы, 5/ и & - амплитудные функции рассеяния, соответствующие поляризации рассеянного излучения в плоскости рассеяния и в перпендикулярной к ней плоскости, которые вычисляются по формулам теории Ми и выражаются через а, Х- и

относительный показатель преломления т = ■ ( пчаст и пжидк —

показатели преломления рассеивающей частицы и жидкости, соответственно) Показатели преломления пчаст и пжш)к в общем случае считаются комплексными, их мнимая часть позволяет учесть поглощение света и его зависимость от длины волны

Для рассеяния в поглощающей среде следует учитывать поглощение как падающего, так и рассеянного излучения Для МР, возбуждаемого параллельным пучком, интенсивность рассеяния I~ Т*[\ 5712 +111 ], где Т-коэффициент пропускания среды

Для системы, состоящей из N рассеивающих частиц, неупорядоченно распределенных в пространстве, результирующая интенсивность поля является суммой интенсивностей полей, рассеянных отдельными частицами Учитывалось также поглощение как падающего, так и рассеянного излучения средой и взвешенными в ней частицами Если рассеивающие частицы находятся в кювете с длиной оптического пути / и просвечиваются параллельным световым пучком, то интенсивность рассеяния под малыми углами в (с учетом того, что со5 в ~1)

I(Я в)~с*1*ехр[(-/*(кср + *„ *с)]*|5

(П)

Здесь с -массовая концентрация взвешенных частиц, кср- линейный показатель поглощения среды, кеч -массовый показатель поглощения взвешенной частицы,

N- общее число взвешенных частиц, а, —радиус г —ой частицы; f(aj — функция распределения частиц по радиусам

На основе изложенного подхода были составлены программы в вычислительной среде Matlab 6 и проведено математическое моделирование светорассеяния взвесью частиц в жидкости Модель позволяет при расчете 1(A) варьировать а т, границы и в2 интервала углов рассеяния и СКО, характеризующее разброс частиц взвеси по радиусам (полидисперсность) Расчеты проводились для углов рассеяния, не превышающих 10° Результаты моделирования показали, что для частиц, радиусы которых находятся в интервале 0,4 < а < 30 мкм при 1,2 < т <1,4 на зависимости 1(A) в диапазоне 190 -1100 нм имеются характерные участки, достаточно чувствительные к изменениям а Положение таких участков определяется средними размерами рассеивающих частиц - чем больше а, тем в более длинноволновой области расположен соответствующий характерный участок. Расчеты показали также, что для взвесей частиц с малой полидисперсностью на этих участках имеются колебания зависимости 1(A) , число которых N возрастает с увеличением а , а амплитуда убывает с увеличением СКО

Рис 10 Результаты расчета спектров рассеяния Ми

а) для монодисперсных взвесей рассеивающих частиц радиусом 1- 0,5 мкм, 2- 0,9 мкм, 3- 1,25 мкм б) для взвесей частиц радиусом 1,25 мкм с различными СКО полидисперсности 1- 0,01 мкм, 2- 0,1 мкм, 3 -0,2 мкм

Из результатов моделирования следует, что для получения информации о свойствах взвешенных в жидкости частиц представляет интерес зависимость от длины волны эффективности малоуглового

¡5 (Л,в)( +|52(Л,0,а,)|2], (12)

лг

а

б

рассеяния, при этом подходящей для регистрации величиной является отношение

= (13)

I Р0(Х)

где Р3] з - мощность излучения, рассеянного в интервале малых углов рассеяния в!<в<в2, Ро - мощность падающего излучения, / -длина оптического пути в кювете (толщина рассеивающего слоя) К представляет собой приведенный (к единичной длине) коэффгщиент рассеяния в заданный интервал углов Для этого коэффициента получено простое соотношение

Я(Д) = 5~Г(Я)*и, (14)

где п- число дисперсных частиц в единице объема, аа - сечение рассеяния

в интервале телесных углов П|< О <Г)2, усредненное по всем частицам Введенный таким образом приведенный коэффициент рассеяния зависит от концентрации и свойств рассеивающих частиц в образце, и диапазона углов сбора рассеянного излучения, существенно, что он не зависит от других параметров прибора и от поглощающих свойств исследуемой жидкости, т е является весьма информативной оптической характеристикой рассеивающей среды

Измерения спектров МР в диапазоне 190-1100 нм проводились с помощью описанного в главе 5 спектрофотометра УСФ-01. Для измерения спектров рассеяния оптическая схема прибора была модифицирована, прохождение лучей показано на рис 11

Для отделения проходящего света на пути предметного луча на выходе из кюветного отделения устанавливался узкий экран 3 шириной 2 мм В результате на линзу 2 попадало излучение, рассеянное под малыми углами находящейся в кювете жидкостью, а также излучение, дифрагировавшее на краях экрана 3 В опорный канал помещалась такая же кювета, заполненная дистиллированной водой

Рис 11 Ход лучей в измерительном плече спектрофотометра при измерении спектров МР - вид сверху 1- исследуемая жидкость в кювете, 2- фокусирующая линза, 3 - экран, 4 - фотоприемник

Рис 12 Ход лучей при измерении поглощения (экстинкции)- вид спереди 1- исследуемая жидкость в кювете, 2- фокусирующая линза, 3 - диафрагма, 4 - фотоприемник

Перед началом измерений кварцевые кюветы с дчиной оптического пути 10 мм, заполненные дистиллированной водой, помещались в оба плеча спектрофотометра (опорное и предметное), и проводилась процедура «автонуль» (ашогего), те выравнивания чувствительностей опорного и предметного каналов для спектрального диапазона, в котором предполагалось производить измерения Затем в кювете 1 (рис 11), находящейся в предметном плече, дистиллированная вода заменялась на исследуемый образец (взвесь) и измерялась зависимость от длины волны отношения Трасс(Я) сигналов в предметном и опорном каналах

При такой схеме измеряется дополнительное рассеяние образца по сравнению с дистиллированной водой в интервале углов от в1г=аг^(Ы2Ь) до $2 =аг^(с1/2Ь), где к -ширина экрана, Ь - расстояние от центра кюветы до экрана, ¿- световой диаметр линзы

Меняя положение кюветы 1 в кюветном отделении и ширину экрана (те варьируя параметры Ь и к), можно регулировать диапазон углов, в котором производится регистрация рассеянного излучения

При удалении экрана спектрофотометр легко перестраивается в обычный режим, при котором измеряются спектры пропускания образца Тпрап(Л) Для устранения попадания на фотоприемник излучения, рассеянного взвешенными в жидкости частицами, необходимо использовать пространственную фильтрацию изтучения с помощью диафрагмы 3, помещаемой в фокальную плоскость линзы 2 (рис 12 )

По изложенной методике были произведены измерения спектров МР следующих образцов

-взвесей формазина, мутность которых варьировалась в интервале от 0,1 до 1000 ЕМФ (единиц мутности по формазину);

-взвесей монодисперсных частиц полистирольного латекса диаметрами 1,36 ,2,5 и 5 мкм,

-суспензий фибриногена (растворимого белка плазмы крови) с различной степенью окисления

На рис 13-14 приведены некоторые спектры МР, полученные для суспензий полистирольного латекса При биомедицинских измерениях эти суспензии применяются, например, для калибровки цитометров и других приборов, предназначенных для определения дисперсных частиц в жидкостях Суспензии латекса представляют также самостоятельный интерес, так как используются в качестве носителей для антител и антигенов во многих биомедицинских приложениях На рис 13 сопоставляются спектры рассеяния, полученные после вычитания базовой линии, для взвесей частиц с диаметрами 1,36 мкм и 2,5 мкм, соответственно Видна четкая корреляция между диаметром частиц и числом колебаний Вычитание базовой линии позволило более четко и наглядно наблюдать эти колебания Приведенные результаты подтверждают пригодность предложенной оптической схемы для регистрации спектров малоуглового рассеяния, доказывая таким образом четвертое научное положение, выносимое на защиту

Рис 13 Спектры рассеяния для взвесей частиц монодисперсного латекса после вычитания базовой линии, диаметры частиц а)1,36 мкм, б) 2,5 мкм

Приведенный коэффициент рассеяния ЩЯ), введенный в соответствии с формулой (14), может быть найден путем совместной обработки спектров рассеяния и пропускания по формуле

Здесь Рдиф (X) - мощность излучения, дифрагировавшего на экране 3 (рис 11) Для оценки возможностей предлагаемого метода при анализе окрашенных (поглощающих) жидкостей исследовались взвеси частиц латекса как в воде, так и в растворах КМпО.) На рис 14 а приводится спектр рассеяния, зарегистрированный для одного из таких образцов, а на рис 14 6-зависимость Я(Л), найденная путем совместной обработки спектров рассеяния и пропускания с помощью формулы (15) На этой зависимости четко видны колебания, характерные для взвесей монодисперсных частиц

1 Р (Я)

Ш) = 7-^тг^ № -Тпро„ (1)]

(15)

а) б)

Рис 14 Результаты регистрации спектров рассеяния для взвеси частиц монодисперсного латекса диаметром 2,5 мкм концентрацией 2*10"3 % в растворе КМп04 а) исходный спектр, б) зависимость И(7-), определенная по формуле (15)

Из спектров МР, зарегистрированных по изложенной методике, может быть извлечена информация как качественного, так и количественного характера. Можно, в частности, наблюдать кинетику процессов растворения и коагуляции Регистрируя спектры рассеяния и поглощения с определенным временным интервалом, можно отслеживать изменение соотношения между растворенными и взвешенными частицами, а также объединение частиц в более крупные образования.

Концентрации рассеивающих и поглощающих частиц могут быть определены по градуировочным зависимостям, построенным по спектрам пропускания и рассеяния образцов сравнения Из формулы (11) следует, что при

с<1/(1*квч,) (16)

зависимость Щс) монотонно возрастает, на ней имеется линейный участок В зависимости от требуемого диапазона концентраций частиц подбирается толщина кюветы, при которой условие (16) выполняется При анализе систем, содержащих рассеивающие и поглощающие частицы нескольких сортов, следует использовать методы многомерной калибровки

Для взвесей частиц с высокой монодисперсностью можно оценить их размеры по зависимости ЩЯ) Результаты моделирования показали хорошую предсказательную способность градуировки при выборе в качестве объясняющей (независимой) переменной числа N колебаний (биений) этой зависимости N может быть легко определено с погрешностью, не превышающей четверть колебания Для приближенных оценок размеров частиц градуировочную зависимость можно построить без привлечения экспериментальных данных, по спектрам математических эталонов (МЭ), полученных расчетным путем с помощью описанной выше компьютерной модели

В таблице 3 приведены в качестве примера значения N. определенные для нескольких МЭ, синтезированных расчетным путем для микросфер

полистирольного латекса различного диаметра, при этом предполагалось, что рассеянное излучение собирается в интервале углов рассеяния 1°<6<10°

Таблица 3 Построение градуировки по МЭ

Диаметр частиц, мкм Число колебаний,N

1,0 1,8

1,5 зд

2,0 4,1

2,5 5,0

3,0 6,0

Оценки, проведенные с помощью построенной таким образом градуировки и зарегистрированных спектров рассеяния для взвесей частиц латекса, дали вычисленное значение 1,16 мкм при фактическом 1,36 мкм и 2,05 мкм при фактическом 2,5 мкм. Перед подсчетом числа колебаний для каждого из спектров производилось вычитание базовой линии Оба значения получились заниженными, причем занижение составило менее 20 %

Изложенные результаты показывают возможность извлечения информации о параметрах взвешенных частиц путем совместной обработки спектров пропускания и МР, доказывая пятое положение, выносимое на защиту

Рассмотрена возможность объединения данных об угловой и спектральной зависимости эффективности рассеяния и их совместной обработки Сводные данные могут быть представлены в виде прямоугольной матрицы, строки которой соответствуют разным длинам волн, а столбцы ~ разным углам рассеяния Тогда каждую строку можно рассматривать как индикатрису рассеяния при определенной длине волны, а столбец - как спектр при определенном угле рассеяния В эту же матрицу может быть включен столбец, соответствующий прямому пропусканию (т е нулевому углу рассеяния), однозначно связанному с экстинкцией Можно сказать, что такая матрица отображает спектральную индикатрису рассеяния

Построенная математическая модель позволяет рассчитывать соответствующие матрицы и отображать их в виде трехмерных графиков зависимости <т (а, в) Экспериментальная регистрация спектральных индикатрис МР возможна на двулучевом спектрофотометре при использовании в качестве фотоприемника фотодиодной или ПЗС матрицы На рис 15 (а-в) приведены спектральные индикатрисы рассеяния, рассчитанные для микросфер полистирольного латекса радиусом 0,5 , 1,0 и 1,5 мкм

а)

б)

Рис. 15. Спектральные индикатрисы рассеяния, рассчитанные для микросфер полистирольного латекса радиусом: а) 0,5 мкм, б) ¡,0 мкм, в) 1,5 мкм.

в)

Их сравнение показывает, что вид индикатрис очень чувствителен к изменению размеров частиц. Видно, что на разных длинах волн угловая зависимость интенсивности рассеяния может существенно различаться (при сохранении общей закономерности уменьшения рассеяния с ростом угла). Эволюция спектральных индикатрис во времени позволяет проследить за изменением состояния дисперсной системы. Спектральные индикатрисы дают возможность определить те длины волн, на которых угловая зависимость рассеяния в наибольшей степени чувствительна к изменению размеров частиц. Видно, в частности, что для частиц латекса, радиусы которых лежат в интервале 0,5 мкм<я<1,5 мкм, это имеет место на длинах волн порядка 340 — 350 нм. В связи с этим появляется возможность выбора длин волн, на которых зависимость о (в) является более информативной. На каждой из выбранных длин волн можно произвести независимое определение распределения частиц по размерам, а затем усреднить полученные результаты.

Показаны возможности многомерной градуировки методом Р15 (см. стр. 10 автореферата) для извлечения информации о полидисперсных взвесях частиц из спектров и индикатрис рассеяния.

Для построения многомерной градуировки необходим обучающий набор, состоящий из N калибровочных образцов, для каждого из которых

измеряется эффективность светорассеяния на К длинах волн Результаты таких измерений могут быть представлены в виде спектральной матрицы (матрицы аналитических сигналов) X размерностью Ы*К, строки которой соответствуют различным калибровочным образцам, а столбцы — различным длинам волн Взвесь дисперсных частиц будем характеризовать двумя параметрами - средним размером а и СКО, показывающим полидисперсность, тогда параметры взвесей, входящих в обучающий набор, представляются матрицей объектов У, имеющей N строк и 2 столбца Связь между матрицей аналитических сигналов и матрицей объектов, т е между спектром рассеянного излучения и параметрами взвеси частиц, может быть записана в виде

У=Х*В + Е, (17)

где В — матрица калибровочных (регрессионных) коэффициентов, имеющая К строк и 2 столбца, а Е - матрица остатков, характеризующая погрешность калибровки, т е отличие экспериментальных данных от рассчитанных по градуировочной зависимости Подбор градуировочных коэффициентов осуществляется с помощью метода наименьших квадратов (МНК) и сводится к минимизации нормы матрицы Е Алгоритм РЬБ предусматривает перед применением аппарата МНК переход к новым, линейно независимым друг от друга переменным, каждая из которых является линейной комбинацией компонент аналитического сигнала При этом выбор новых переменных обеспечивается таким образом, чтобы они в наибольшей степени коррелировали с параметрами исследуемой системы У Переход к новым переменным обычно приводит, за счет уменьшения размерности задачи, к сжатию данных без потери полезной информации

Было проведено иммитационное моделирование многомерной градуировки, по результатам упомянутых выше расчетов спектров рассеяния света взвесью частиц в жидкости были сформированы МЭ - обучающие наборы и тест-наборы По данным для обучающих Наборов были вычислены регрессионные коэффициенты по методу РЬБ, затем с помощью этих коэффициентов и спектров тест-наборов были рассчитаны параметры взвеси частиц (а и СКО) Полученные результаты сравнивались с исходными параметрами соответствующего тест-набора

Для улучшения предсказательной способности градуировки по спектрам рассеяния необходимо использовать объясняющие переменные, адекватно отображающие период и глубину модуляции интенсивности рассеянного излучения Для перехода к таким переменным перед применением алгоритмов РЬБ спектр рассеянного излучения был подвергнут преобразованию Фурье Для численных расчетов был использован алгоритм дискретного преобразования Фурье Результаты расчетов показали, что номер наиболее высокой гармоники хорошо коррелирует с размером частиц, это иллюстрируется рис 16

Полидисперсность частиц хорошо коррелирует с интенсивностями гармоник фурье-преобразования спектра, что показано на графике рис 17

Поэтому в качестве независимых переменных при обработке спектров рассеяния были использованы частоты и интенсивности высших гармоник фурье-преобразования спектра

Предсказательная способность градуировки, построенной методом РЬБ с использованием предлагаемых независимых переменных, иллюстрируется данными, приведенными в таблицах 4-5, где исходные значения параметров модельных взвесей тест-набора сопоставляются со значениями, рассчитанными по многомерной градуировке

Таблица 4 Сравнение номинальных и рассчитанных по калибровке значений радиусов частиц взвеси для одного из тест-наборов

Номинальное значение, мкм Значение, рассчитанное по калибровке, мкм Относительная погрешность, %

9,5 8,7 8,4

7,5 8,0 6,7

6,5 6,9 6,2

5,5 6,2 12,7

4,5 5,3 17,8

3,5 4,3 22,9

2,5 2,6 4,0

Таблица 5 Сравнение номинальных и рассчитанных по калибровке значений СКО, характеризующего разброс частиц тест-набора по радиусам

Номинальное значение СКО, мкм Значение СКО, рассчитанное по калибровке, мкм Относительная погрешность, %

0,02 0,017 15,1

0,03 0,021 30,5

0,07 0,071 0,9

0,09 0,087 3 3

0,12 1,224 2,0

Рис 16 Зависимость номера высшей гармоники от радиуса частиц

60-

150

Рис 17 Фурье-преобразования рассчитанных по теории Ми спектров рассеяния для взвесей частиц радиусом б мкм с различными значениями СКО полидисперсности - 7-0,025 мкм, 2 — 0,05 мкм, 3-0,075 мкм, 4 — 0,1 мкм

Метод РЬБ может быть использован и для извлечения информации о распределении дисперсных частиц по размерам из индикатрис рассеяния В качестве примера приведем результаты моделирования на математических эталонах задачи восстановления распределения частиц по размерам для взвеси, содержащей частицы полистирольного латекса трех разновидностей — с радиусами 0,5 , 1 и 1,5 мкм Для построения калибровки был использован обучающий набор, параметры которого приведены в таблице 6

Таблица 6 Параметры обучающего набора

№ 0,5 мкм 1,0 мкм 1,5 мкм

МЭ

1 1 0 0

2 0 1 0

3 0 0 1

4 0 0,5 0,5

5 0,5 0,5 0

6 0,3 0,3 0,3

Для оценки предсказательной способности калибровки был сформирован тестовый набор, который не использовался при ее построении

Для того, чтобы данные для МЭ и образцов тестового набора были приближены к условиям реального эксперимента, к вычисленным значениям эффективности рассеяния искусственно добавлялся случайный шум Добавление шума позволяет проверять решение обратной задачи на устойчивость В таблице 7 приведены результаты сравнения результатов,

дагтсгиса пигг£ег

рассчитанных по построенной методом РЬБ калибровке, с исходными значениями. Данные в скобках соответствуют расчетам с искусственным добавлением шума На рис. 18 приведен пример индикатрис рассеяния, рассчитанных с добавлением шумов различной амплитуды

а» 0 5 пИ^л ууауе1епд№ «О М

2---— -----

0 2 4 6 8 10

апд[е оед

Рис. 18 Расчет индикатрис рассеяния

1- индикатриса без добавления шумов, 2 - индикатриса с добавлением 5% шума; 3- с добавлением 10% шума; 3-е добавлением 15 % шума

Таблица 7 Сравнение исходных и определенных по калибровке _долей частиц разного сорта для тестового набора_

№ образца 0,5 мкм 1,0 мкм 1,5 мкм Относит ошибка прогноза, %

номинал расчет номинал Расчет номинал расчет

1 0,2 0,204 (0,239) (0,227) 0,1 0,105 (0,115) (0,099) 0,7 0,703 (0,684) (0,691) 1,5 (1,5) (0,2)

2 0,35 0,358 (0,353) 0,15 0,155 (0 149) 0,5 0,503 (0,497) 2,1 (0,8)

3 0,1 0,104 (0,104) 0,9 0,904 (0,877) 0 0,003 (0,012) 1,4 (0,3)

4 0,03 0,033 (,022) 0,9 0,904 (0,900) 0,07 0,073 (0,074) 1,3 (1,0)

Данные в скобках соответствуют расчетам с искусственным добавлением шума

Для каждого из тестовых образцов вычислялась относительная ошибка прогноза Я по формуле

Л = =—!- У (с~ - с""1'"" )2 (18)

Здесь с""""" и с,"*"""* -соответственно номинальное и вычисленное по калибровке значения концентрации (доли) частиц г- го сорта, входящих в тестовый образец (всего в тестовом образце N сортов частиц), с - среднее значение концентрации (доли) частиц Формула (18) следует из общего выражения для ошибки прогноза, принятого в хемометрике при контроле качества (валидации) многомерной калибровки.

Для результатов, приведенных в таблице 7, погрешность прогноза очень мала (не превышает 2,1 %), причем добавление шума эту погрешность не увеличивает, что свидетельствует об устойчивости решения обратной задачи

Таким образом, построение и использование многомерной калибровки по методу РЬ8 может быть альтернативой известным методам решения обратной задачи для индикатрис рассеяния, основанным на обращении интегральных преобразований При этом для построения многомерной калибровки могут использоваться как реальные калиборовочные образцы, так и МЭ

Приведенные результаты по извлечению из данных по МР информации о параметрах распределения взвешенных частиц по размерам с помощью методов многомерной калибровки, доказывают шестое научное положение, выносимое на защиту

Предложенный метод исследования дисперсных частиц в поглощающих жидкостях может быть назван спектральной нефелометрией и использован при исследовании биологических жидкостей, клеточных и бактериальных культур, растворов полимеров, фармацевтических препаратов

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключении сформулированы основные результаты, полученные в диссертации

1. На основе полученных в диссертации технических решений разработан МОА, работающий в режимах измерения абсорбции и флуоресценции (фотометр-флуориметр ФФМ-01) Это первый отечественный микропланшетный прибор, который может работать в режиме измерения флуоресценции. Он полностью управляется от ПК с помощью специально разработанного ПО и представляет собой открытую систему, которая может быть адаптирована к различным тест-наборам программным путем, наряду с планшетами прибор может работать также с микропробирками Метрологические характеристики прибора позволяют использовать его для исследования различных биологических сред методами флуоресцентной и абсорбционной спектрофотометрии Проведены испытания с целью утверждения типа и клинические испытания, прибор включен в Госреестр средств измерений РФ и зарегистрирован в качестве изделия медицинской техники В настоящее время приборы ФФМ-01 работают в 16 лабораториях,

осуществляющих как научные исследования, так и клинико-диагностические анализы

2 Показано, что для калибровки микропланшетных флуориметров в ОЕФ и оперативной коррекции этой калибровки в условиях эксплуатации прибора, целесообразно использовать ОС, состоящие либо из флуоресцирующего и поглощающего цветных стекол, либо из флуоресцирующего стекла и нейтрального светофильтра Нейтральный светофильтр в таком наборе осуществляет корректировку интенсивности излучения флуоресцирующего стекла, а поглощающее цветное стекло корректирует также спектральный состав этого излучения

3 Встроенный в ПО прибора ФФМ-01 нелинейный алгоритм сравнительной градуировки в ОЕФ, позволяет обеспечить сопоставимость результатов измерения флуоресценции на юоветном и микропланшетном приборах, корректируя расхождения, обусловленные разными схемами возбуждения флуоресценции

4 Проанализированы специфические источники погрешности, которые возникают при измерении абсорбции и флуоресценции с помощью МОА Источниками таких погрешностей являются колебания поверхности жидкости в лунке из-за движения микропланшета, искривление поверхности жидкости из-за капиллярных эффектов (мениск) Найдены и обоснованы требования к спектральным характеристикам ИС, геометрии светового пучка, направляемого на лунку, и кинематическому режиму движения планшета, соблюдение которых позволяет свести к минимуму названные погрешности Показано, что эти погрешности не могут быть выявлены с помощью поверочных планшетов с нейтральными светофильтрами, для их обнаружения необходимы измерения с жидкими контрольными образцами, идентичными реальным пробам по своим спектральным характеристикам и вязкости

5. Проведенные клинические испытания показали пригодность фотометра-флуориметра ФФМ-01 для различных видов клинических анализов как в режимах флуоресценции (детекция продуктов ПЦР, биохимический анализ), так и абсорбции (ИФА)

6. По результатам испытаний в ФЦГЭ Роспотребнадзора разработаны и утверждены Лабораторным советом Роспотребнадзора Методические рекомендации «Учет результатов иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции с помощью фотометра-флуориметра микропланшетного ФФМ-01»

7 Обоснованные в диссертации научно-технические решения (оптическая схема, алгоритмы программного обеспечения, методика калибровки по шкале длин волн) были использованы при разработке двулучевого спектрофотометра УСФ-01 для спектрального диапазона 190 -1100 нм Прибор прошел испытания с целью утверждения типа и включен в Госреестр средств измерений РФ

8 Предложен и реализован метод определения концентрации и свойств взвешенных частиц в жидкостях, основанный на совместном анализе

спектров малоуглового рассеяния и поглощения излучения в диапазоне 200 -900 им Для реализации предлагаемого метода проведена модификация оптической схемы двулучевою спектрофотометра

9 За счет совместной обработки спектров пропускания и МР появляется возможность с помощью одного прибора получать информацию как о составе жидкости, так и о концентрации и размерах взвешенных в ней частиц При этом для мутных окрашенных жидкостей можно разделить составляющие общего ослабления света (экстинкции), связанные с поглощением и рассеянием, компенсировав таким образом влияние цветности при измерении мутности жидкости

Метод может быть назван спектральной нефелометрией и использован при исследовании биологических жидкостей, клеточных и бактериальных культур, растворов полимеров, фармацевтических препаратов

10 Построение многомерной калибровки с использованием дробного метода наименьших квадратов позволяет решать обратные задачи рассеяния, извлекая данные о распределении взвешенных частиц по размерам из спектров и индикатрис рассеяния

11 Совместная обработка данных об угловой и спектральной зависимости эффективности рассеяния позволяет выявить те длины волн, на которых угловая зависимость наиболее информативна для определения размеров рассеивающих частиц

12 Использование в спектрофотометре УСФ-01 ртутной ЛПК, устанавливаемой на место дейтериевой лампы, позволило увеличить точность калибровки по шкале длин волн, контролировать погрешность установки длины волны и спектральное разрешение во всем спектральном диапазоне прибора

13 Разработана и реализована методика измерения абсолютных значений мощности на отдельных спектральных линиях для источников слабого оптического излучения (характерная мощность порядка 10"8 - Ю-6 Вт) При этом используется метод сравнения с образцовым источником, для которого были предварительно произведены измерения на вторичном эталоне единицы СПЭЯ С помощью разработанной методики измерены абсолютные значения мощности выбранных линий облучателей для спектральной фототерапии, выполненных на основе ЛПК

14. В результате выполнения диссертационной работы разработаны научно обоснованные технические решения и математические модели, развивающие оптико-спектральные методы исследования биоорганических сред, создана соответствующая аппаратура Внедрение этих результатов вносит существенный вклад в расширение приборной и методической базы биотехнологических исследований

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Левин А Д , Леонов Р К , Ефимочкин И С Установка для контроля оптической однородности прозрачных материалов и рассеивающих дефектов на основе спектрометра молекулярного рассеяния // Приборы и техника эксперимента - 1985 -Т58 - № 4, С 180-183

2 Иванов В С, Макшанцев Б И , Левин А Д , Бочаров А В , Колчин К В , Малеев И Д, Перфилов С А Свечение, возникающее при электрофорезе частиц серебра в воде // Журнал экспериментальной и теоретической физики - 1996 -Т 109-№3, С 852-867

3 Левин А Д, Прибытков В А, Рукин Е М Метрологические характеристики и поверочные схемы атомно-абсорбционных спектрометров // XII научно-техническая конференция «Датчики и преобразователи информации систем измерения, контрота и управления» Материалы конференции, М, МИЭМ, 2000 С 294-295

4 Прибытков В А, Фурманский ЕА, Левин АД, Рукин ЕМ Преобразование и обработка сигналов в пламенном атомно-абсорбционном спектрометре «Квант-2А»// XII научно-техническая конференция «Датчики и преобразователи информации систем измерения, контроля и управления», Материалы конференции, М, МИЭМ, 2000 С 295-296

5 Гончаков А С , Левин А Д , Прибытков В А , Рукин Е М , Садагов Ю М Атомно-абсорбционное оборудование для контроля содержания токсичных элементов// II научно-практическая конференця и выставка «Идентификация качества и безопасность алкогольной продукции», М, Пущино, июль 2000 г

6 Левин А Д , Прибытков В А , Рукин Е М Серегина И Ф Применение атомно-абсорбционных спектрометров для элементного анализа биологических объектов// I Всероссийский научно-технический семинар «Проблемы метрологического обеспечения в здравоохранении и производстве медицинской техники», Тезисы докладов, М, 2000 С 52-53

7 Левин А Д , Прибытков В А , Рукин Е М Серегина И Ф Применение атомно-абсорбционных спектрометров для элементного анализа биологических объектов // Измерительная техника - 2001 - № 6, С 66 - 68

8 Иванов В С , Кайдалов С А , Левин А Д , Муравская Н П , Рукин Е М Методы и средства обеспечения единства измерений в атомной и молекулярной спектроскопии // XIII Всероссийская научно-техническая конференция «Обеспечение единства измерений в фотометрии и радиометрии оптического излучения», Тезисы докладов, Москва, 2001, С 19

9 Рукин Е М , Прибытков В А , Левин А Д, Широков Б С Новые спектральные приборы ООО «Кортэк» // I Всероссийская конференция «Аналитические приборы», Тезисы докладов, СПб, 2002, С 168-170

10 Волков А Ю , Левин А Д , Рукин Е М , Фурманский Е А , Широков Б С Фотометр-флуориметр для молекулярной диагностики в биологии и медицине// XII научно-техническая конференция с участием зарубежных специалистов «Датчики и преобразователи систем измерения, контроля и

управления - Датчик 2003», Материалы конференции, М, МИЭМ, 2003, С 290

11 Волков А Ю , Генерозов Э В , Левин А Д, Рукин Е М , Широков Б С Микропланшетный фотометр-флуориметр для детекции продуктов амплификации ПЦР и ИФА // Клиническая лабораторная диагностика -2003 -№ 9, С 22

12 Кайдалов С А , Левин А Д, Левитин Л В , Муравская Н П Обеспечение единства и качества оптико-физических измерений в технике иммунологических исследований // V Всероссийский научно-технический семинар «Проблемы метрологического обеспечения в здравоохранении и производстве медицинской техники», Тезисы докладов, 2003, С 37-38

13 Кайдалов С А, Левин АД Методы и средства поверки микропланшетных фотометров в условиях эксплуатации // IV Всероссийский научно-технический семинар «Проблемы метрологического обеспечения в здравоохранении и производстве медицинской техники», Тезисы докладов, 2003, С 39-41

14 Левин А Д, Метрологическое обеспечение измерений флуоресценции при исследовании биологических молекул // Измерительная техника - 2004 -№5, С 53-56

15 Левин АД Решение задач геометрической и волновой оптики в системе МаОаЬ // Труды Второй всероссийской научной конференции «Проектирование инженерных и научных приложений в среде МаЙаЬ», М, 2004, Т 1, С 234-239

16 Левин АД Алгоритмы градуировки при многокомпонентном анализе в спектрофотометрии // XIV научно-техническая конференция «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение», Тезисы докладов, М, 2004, С 101-102

17 Гущин ГВ, Егоров ММ, Баранов СВ, Кайдалов С А, Левин АД, Муравская НИ, Рукин ЕМ Эталонные источники атомно-эмиссиоьного изтучения с использованием спектральных ламп с полым катодом //, XIV научно-техническая конференция «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение», Тезисы докладов, М, 2004, С 95-96

18 Левин А Д Требования к методам и средствам контроля метрологических характеристик иммуно-ферментных анализаторов // V Всероссийский научно-технический семинар «Проблемы метрологического обеспечения в здравоохранении и производстве медицинской техники», Тезисы докладов, 2004, С 37-39

19 Левин АД Источники погрешности при измерении оптической плотности микропланшетными фотометрами // VI Международная конференция «Прикладная оптика», Сборник трудов, Т 1(1), Санкт-Петербург, 2004, С 20-24

20 Левин А Д, Рукин Е М , Широков Б С , Микропланшетный оптический анализатор для ПЦР и ИФА диагостики // Материалы пленума Лабораторного Совета Государственной санитарно-эпидемеологической службы Российской Федерации, М, 2004, С"141-145

21. Левин АД Особенности измерения оптической плотности микропланшетными фотометрами // Измерительная техника - 2005 - № 2, С 40-42

22 Левин А Д Микропланшетные оптические анализаторы и их применение в биомедицинских измерениях // Измерительная техника - 2005 -№3, С 5863

23 Левин А Д. Сравнительные испытания спектральных приборов медицинского назначения // XV научно-техническая конференция «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение», М, 2005, С 126-128

24 Баранов С В , Левин А Д, Рукин ЕМ// Спектральная калибровка и контроль метрологических характеристик спектрофотометров с помощью ртутной лампы с полым катодом, XV научно-техническая конференция «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение», М, 2005, С. 121 -122

25 Левин А Д, Прибытков В А , Рукин Е М, Широков Б С Новые приборы для атомного и молекулярного спектрального анализа // Вторая Всероссийская конференция «Аналитические приборы», Тезисы докладов, Санкт-Петербург, 2005

26. Левин А Д Метрология абсорбционных и флуоресцентных микропланшетных анализаторов // Вторая Всероссийская конференция «Аналитические приборы», Тезисы докладов, Санкт-Петербург, 2005

27 Байков А Д , Левин А Д, Мамчур Г И Микропланшетный анализатор ФФМ-01 для скрининга и диагностики фенилкетонурии // ФКУ новости, 2005, № 8, С 11

28 Баранов С В , Левин А Д, Прибытков В А , Рукин Е М, Садагов Ю М Обеспечение единства измерений в аналитической спектрофотометрии// Измерительная техника, 2005, № 11, С 65-68

29 Левин А Д, Муртазина Н Р , Скала Л 3 Возможность использования микропланшетных оптических анализаторов для микробиологических исследований// VI Всероссийский научно-технический семинар «Проблемы метрологического обеспечения в здравоохранении и производстве медицинской техники», Тезисы докладов, Москва, 2005, С 41-43

30 Левин А Д Определение характеристик взвеси частиц по спектрам малоуглового рассеяния света // Измерительная техника - 2006 - №1, С 5760

31 Брагина И В, Зароченцев М В , Опочинский Э Ф , Воронцова Т.В , Левин А Д , Муртазина Н Р Учет результатов иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции с помощью фотометра-флуориметра микропланшетного ФФМ-01 Методические рекомендации // М Федеральное государственное учреждение здравоохранения «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2006 - 17 с

32. Левин АД Модечь многомерной град\ ировки для определения параметров дисперсных частиц по спектрам мало\пового рассеяния // Измерительная техника - 2006 - №9 , С 34-36

33 Левин А Д Определение параметров дисперсных частиц по спектрам м&тоуглового рассеяния, измеренным на двулучевом спектрфотометре // Труды оптического общества им Д С Рождественского, VII Международная конференция «Прикладная оптика», Сборник трудов, , Санкт-Петербург, 2006, том 1, С 252-256

34 Левин А Д, Исследование дисперсных частиц в биологических жидкостях методом спектральной нефелометрии // VII Всероссийский научно-технический семинар «Проблемы метрологического обеспечения в здравоохранении и производстве медицинской техники», Тезисы докладов, М,2006

35 Левин А Д , Мчравская Н П , Кайдалов С А , Крылова Е В Тенденции развития спектральных измерений биологических жидкостей // VII Всероссийский научно-технический семинар «Проблемы метрологического обеспечения в здравоохранении и производстве медицинской техники», Тезисы докладов, М , 2006

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Основные оптико-спектральные методы и средства измерений, применяемые при исследовании жидких биоорганических сред.

1.1 Атомная спектроскопия.

1.2 Молекулярная абсорбционная спектрофотометрия.

1.3 Флуоресцентная спектроскопия.

1.4 Нефелометрия и турбидиметрия.

1.5 Применение методов анализа многомерных данных в спектроскопии

1.6 Микропланшетные оптические анализаторы.

1.7 Выводы к главе 1.

Глава 2. Теоретические и экспериментальные исследования особенностей измерения абсорбции и флуоресценции микропланшетными анализаторами

2.1. Колебания поверхности жидкости в лунке из-за движения микропланшета.

2.2 Искривление поверхности жидкости вследствие капиллярных эффектов

2.3. Влияние характеристик интерференционных светофильтров.

2.4 Факторы, влияющие на флуоресцентный сигнал.

2.5 Калибровка прибора в относительных единицах флуоресценции.

2.6 Основные виды флуоресцентных образцов сравнения.

2.7 Флуоресцентные образцы сравнения на основе цветных оптических стекол.

Глава 3. Основы обеспечения единства измерений микропланшетными оптическими анализаторами (на примере разработки фотометра-флуориметра ФФМ-01).

3.1 Обоснование основных технических требований, предъявляемых к разрабатываемому МОА.

3.2 Оптическая схема ФФМ-01.

3.3 Электронная система и механизм перемещения микропланшета.

3.4 Основные алгоритмы обработки сигналов для ФФМ-01.

3.5 Программное обеспечение ФФМ-01.

3.6 Контроль метрологических характеристик ФФМ-01.

3.7 Выводы к главе 3.

Глава 4. Опыт использования ФФМ-01 при исследовании биологических жидкостей.

4.1 О сравнительных испытаниях средств измерений медицинского назначения.

4.2 Детекция продуктов ПЦР.

4.3 Учет результатов ИФА.

4.4 Разработка методических рекомендаций по применению прибора ФФМ-01 для ИФА и ПЦР.

4.5 Флуоресцентный биохимический анализ.

4.6 Микробиологический анализ.

4.7 Выводы к главе 4.

Глава 5. Разработка спектрофотометра УСФ-01 и мтодического обеспечения для него.

5.1 Спектрофотометр УСФ-01.

5.2 Методика измерения потока излучения слабых источников линейчатого спектра на отдельных спектральных линиях.

5.3 Выводы к главе 5.

Глава 6. Определение характеристик взвеси частиц по спектрам малоуглового рассеяния света.

6.1 Теоретическое исследование зависимостей спектров рассеянного излучения от параметров взвеси частиц.

6.2 Разработка методики измерения спектров малоуглового рассеяния для взвеси мелкодисперсных частиц.

6.3 Результаты измерения спектров малоуглового рассеяния.

6.4 Обработка экспериментальных данных по малоугловому рассеянию

6.5 Выводы к главе 6.

Актуальность темы

Оптико-спектральные методы и основанная на них аппаратура широко применяются для исследования веществ, в частности жидких сред различного происхождения.

В качестве основных тенденций, характеризующих развитие этих методов в последние десятилетия, можно отметить повышение чувствительности и избирательности акциза, увеличение его производительности, совершенствование способов извлечения информации из результатов спектральных измерений и возможность анализировать все более сложные пробы и образцы. Существенный стимул для развития оптико-спектральных методов дают задачи, возникающие при изучении жидкостей, содержащих объекты биологического происхождения (молекулы, клетки, микроорганизмы) и (или) биологически значимые органические вещества. Подобные жидкие среды могут быть названы биоорганическими. Задачи по их анализу приходится решать в ходе научных исследованиях, при клинической лабораторной диагностике, контроле биотехнологических процессов, лекарственных препаратов и некоторых пищевых продуктов.

Жидкие биоорганические среды представляют собой, как правило, достаточно сложные системы, содержащие различные вещества как в растворенном, так и во взвешенном состоянии. В зависимости от решаемой задачи, в качестве информативных оптических характеристик исследуемой пробы могут использоваться спектры поглощения (пропускания), флуоресценции, хеми и биолюминесценции, индикатрисы рассеяния, параметры поляризации излучения и т.п. 7

В последнее время все чаще выделяют спектроскопию спектрофотометрию) биологических и биологически значимых сред и объектов как самостоятельное научно-техническое направление.

К биоспектроскопии примыкают и исследования воздействия на биологические объекты оптического излучения различного спектрального состава.

Приборы, предназначенные для исследования биоорганических сред, должны удовлетворять ряду специфических требований. Прежде всего, это совместимость с тест-системами, необходимыми для реализации требуемых аналитических технологий (биохимического анализа, иммуно-ферментного или иммуно-флуоресцентного анализа, различных методов исследования ДНК и т.п.). Причем эта совместимость должна обеспечиваться как на аппаратном уровне, так и на уровне программного обеспечения (ПО).

Очень существенны также возможности прибора по обеспечению высокой производительности анализа и автоматизации процесса измерений, а также по анализу малых (десятки микролитров и менее) объемов жидкости. Такие возможности предоставляют микропланшетные оптические анализаторы (МОА), получившие распространение в последние 10-15 лет. При исследовании биоорганических сред оказались весьма эффективными флуоресцентные методы, позволяющие обнаруживать следовые содержания веществ (на уровне сотых и тысячных долей пикомоля) и обладающие, благодаря использованию специфичных метек (флуорофоров), высокой избирательностью. Это требует оснащения лабораторий доступными и надежными приборами с соответствующим методическим и метрологическим обеспечением. При этом необходимо решить вопросы калибровки МОА, поддержания стабильности этой калибровки и обеспечения сопоставимости результатов, получаемых на кюветных и микропланшетных приборах.

Большой интерес представляют жидкие среды, содержащие различного рода дисперсные частицы. С такими средами приходится сталкиваться, 8 например, при анализе клеточных и бактериальных культур, белковых суспензий, контроле растворимости лекарственных препаратов. Существующие методы определения параметров дисперсных частиц, основанные на измерении экстинкции или индикатрис рассеяния, не позволяют четко разделить вклад поглощения и рассеяния в общее ослабление света дисперсной средой, определять соотношение между взвешенными и растворенными в жидкости частьцами.

Необходима разработка методик и средств контроля метрологических характеристик приборов при испытаниях, поверке и эксплуатации. Отдельного исследования требуют вопросы о соответствии характеристик точности, получаемых на контрольных образцах и на реальных пробах биоорганических сред.

Современные спектральные приборы, работающие совместно с персональным компьютером (ПК), способны за короткое время получать большие массивы данных, поэтому существенно возрастает значение используемых методов обработки информации. Для восстановления по зарегистрированным спектрам состава и свойств исследуемых образцов в последнее время используются методы анализа многомерных данных. Они позволяют перед построением многомерной градуировки осуществлять сжатие данных без потери полезной информации, т.е. понижать размерность задачи путем перехода к новым, более «содержательным» переменным. Использование подобных алгоритмов дает эффективные статистические методы решения обратных задач. Однако возможности этих методов реализованы к настоящему времени далеко не полностью, в частности они еще не применялись при определении параметров дисперсных систем и для обработки данных по светорассеянию.

Таким образом, задачи, связанные с разработкой новых и развитием существующих оптико-спектральных методов и средств измерений параметров жидких биоорганических сред и их метрологическим обеспечением, являются весьма актуальными.

Цель работы

Целью диссертационной работы является разработка приборов, методик и программного обеспечения, ориентированных на исследование жидких биоорганических сред методами флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии и нефелометрии, а также методов контроля, испытаний и метрологического сопровождения соответствующих средств измерений. Поставленная цель достигается решением следующих задач: Разработкой:

• микропланшетного фотометра-флуориметра для исследования биологических жидкостей; двулучевого спектрофотометра УФ, видимого и ближнего ИК диапазона и его модификацией для измерений спектров малоуглового рассеяния (MP); алгоритмов совместной обработки спектров пропускания и MP;

• методики определения параметров взвеси частиц по спектрам MP, ее математическим моделированием и экспериментальной апробацией;

• методики абсолютных измерений светового потока слабых источников оптического излучения на основе ламп с полым катодом, применяемых в спектральной фототерапии, на отдельных спектральных линиях; методических указаний по применению разработанного микропланшетного прибора для детекции продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуно-ферментного анализа (ИФА).

Проведением теоретических и экспериментальных исследований источников погрешности измерений в МОА, разработкой способов выявления и минимизации этих погрешностей.

10

Научная новизна работы

Впервые:

• "предложен, теоретически обоснован и экспериментально опробован метод определения концентрации и размеров дисперсных частиц, взвешенных в поглощающей жидкости, основанный на совместном анализе спектров MP и пропускания света;

• оптическая схема двулучевого спектрофотометра модифицирована для измерения спектров MP;

• методы анализа многомерных данных (хемометрики) применены для обработки спектров рассеянного излучения и решены возникающие при этом методические вопросы;

• проведен количественный анализ специфических составляющих погрешности при измерении абсорбции и флуоресценции микропланшетными анализаторами;

• проведены систематические измерения абсолютных значений светового потока для различных спектральных линий ламп с полым катодом (ЛПК).

Практическая значимость работы

Впервые в отечественной практике создан МОА, работающий в режимах флуоресценции и абсорбции.

Разработанный в рамках данной работы микропланшетный фотометр-флуориметр ФФМ-01 прошел испытания с целью утверждения типа, клинические испытания и используется в 16 организациях, как для научных исследований, так и для клинических анализов. Прибор включен в Госреестр средств измерений и зарегистрирован в качестве изделия медицинской техники.

11

Проведены " клинические апробации прибора с тест-системами для ПЦР, ИФА, для биохимического и микробиологического анализа.

Разработаны, согласованы, утверждены Лабораторным советом Рспотребнадзора и введены в действие методические рекомендации по применению ФФМ-01 для детекции продуктов ПЦР и ИФА.

На основании проведенного анализа источников систематических погрешностей МОА выработаны рекомендации по контролю их метрологических характеристик, использованные при испытаниях с целью утверждения типа и поверки.

Разработан двулучевой спектрофотометр УФ, видимого и ближнего РЖ диапазона для лабораторных анализов и использования в учебном процессе; прибор прошел испытания с целью утверждения типа и включен в Госреестр средств измерений РФ; помимо регистрации спектров поглощения и пропускания, прибор был адаптирован для измерения спектров MP и эмиссионных спектров источнуков излучения.

Апробация работы

Основные положения и результаты исследований докладывались и обсуждались на следующих научных конференциях и семинарах:

1. XII Конференция «Датчики и преобразователи систем измерения, контроля и управления - Датчик 2000», Судак, май 2000 г.

2. Всероссийский научно-технический семинар «Проблемы метрологического обеспечения в здравоохранении и производстве медицинской техники», Москва, 2000 г.

3. II научно-практическая конференция «Идентификация качества и безопасность алкогольной продукции», Пущино, июль 2000 г.

4. 13 Всероссийская научно-техническая конференция «Обеспечение единства измерений в фотометрии и радиометрии оптического излучения», Москва, 2001 г.

12

5. I Всероссийская конференция «Аналитические приборы», Санкт-Петербург, июнь 2002 г.

6. I Всероссийский научно-технический семинар «Метрологическое обеспечение исследований в клинико-диагностических лабораториях», Москва, февраль 2003 г.

7. IV Всероссийский научно-технический семинар «Проблемы метрологического обеспечения в здравоохранении и производстве медицинской техники», Сочи, сентябрь 2003 г.

8. Дни лабораторной медицины России, Москва, октябрь 2003 г.

9. Пленум Лабораторного совета государственной санитарно-эпидемеологической службы Российской Федерации, Москва, декабрь 2003 г.

10. XIV научно-техническая конференция «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение», Москва, март 2004 г.

11. Вторая Всероссийская научная конференция «Проектирование инженерных и научных приложений в среде Matlab», Москва, май 2004 г.

12. VI Международная конференция «Прикладная оптика», Санкт-Петербург, октябрь 2004 г.

13. V Всероссийский научно-технический семинар «Проблемы метрологического обеспечения в здравоохранении и производстве медицинской техники», Сочи, сентябрь 2004 г.

14. XV научно-техническая конференция «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение», Москва, апрель 2005 г.

15. VI Всероссийский научно-технический семинар «Проблемы метрологического обеспечения в здравоохранении и производстве медицинской техники», Сочи, сентябрь 2005 г.

Публикации

По теме диссертации опубликованы работы [1-35] , в том числе 10 статей в ведущих научных журналах из перечня ВАК.

13

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Для микропланшетных оптических анализаторов (МОА) кинематический режим движения планшета, при котором ускорение не превышает пороговой величины, зависящей от вязкости пробы, минимизирует случайную погрешность, обусловленную колебаниями жидкости.

В режиме измерения абсорбции:

-использование сходящегося светового пучка, диаметром не более одной трети диаметра лунки, минимизирует систематическую погрешность, обусловленную влиянием мениска;

- систематическая погрешность, обусловленная особенностями интерференционного светофильтра (ИС), возрастает с уменьшением отношения полосы поглощения пробы и полосы пропускания ИС.

2. Для калибровки микропланшетных флуориметров в относительных единицах флуоресценции (ОЕФ) и оперативной коррекции этой калибровки в условиях эксплуатации прибора следует использовать образцы сравнения (ОС), состоящие из флуоресцирующего цветного оптического стекла и светофильтра, корректирующего интенсивность или спектральный состав излучения флуоресценции.

3. Нелинейный алгоритм сравнительной градуировки позволяет обеспечить сопоставимость результатов измерения флуоресценции на кюветном и микропланшетном приборах, корректируя расхождения, обусловленные разными схемами возбуждения флуоресценции.

4. Модифицированная оптическая схема двулучевого спектрофотометра позволяет регистрировать для анализируемой

6.5 Выводы к главе 6.

6.5.1. Математическое моделирование спектров малоуглового рассеяния света в диапазоне от 200 до 900 нм взвесью частиц в жидкости показало, что в этих спектрах содержится информация о параметрах взвеси -концентрации частиц и их распределения по размерам. При постановке обратной задачи по определению этих параметров по спектрам малоуглового рассеяния выполняется требование информативности.

6.5.2. Модификация оптической схемы двухлучевого спектрофотометра позволила с его помощью наряду со спектрами поглощения и пропускания регистрировать также спектры малоуглового рассеяния. При этом в качестве информативной оптической характеристики целесообразно измерять коэффициент рассеяния в заданном интервале малых углов, приведенный к единичной толщине кюветы.

6.5.3 При совместной обработке зарегистрированных спектров пропускания и малоуглового рассеяния для извлечения информации о параметрах взвеси частиц целесообразно- использовать методы анализа многомерных данных, в частности метод PLS.

6.5.4 Предложенный подход может быть назван спектральной нефелометрией (СН). СН может быть использована для контроля питьевой воды, проверки растворимости лекарственных препаратов, при исследовании биологических жидкостей, бактериальных и клеточных культур. При этом для мутных окрашенных жидкостей появляется возможность разделить составляющие общего ослабления света (экстинкции), связанные с поглощением и рассеянием, компенсировав таким образом влияние цветности при измерении мутности жидкости.

252

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сформулируем кратко основные результаты, полученные в диссертации:

1. На основе полученных в диссертации технических решений разработан МОА, работающий в режимах измерения абсорбции и флуоресценции (фотометр-флуориметр ФФМ-01). Это первый отечественный микропланшетный прибор, который может работать в режиме измерения флуоресценции. Он полностью управляется от ПК с помощью специально разработанного ПО и представляет собой открытую систему, которая может быть адаптирована к различным тест-наборам программным путем; наряду с планшетами прибор может работать также с микропробирками. Метрологические характеристики прибора позволяют использовать его для исследования различных биологических сред методами флуоресцентной и абсорбционной спектрофотометрии. Проведены испытания с целью утверждения типа и клинические испытания; прибор включен в Госреестр средств измерений РФ и зарегистрирован в качестве изделия медицинской техники. В настоящее время приборы ФФМ-01 работают в 16 лабораториях, осуществляющих как научные исследования, так и клинико-диагностические анализы.

2. Показано, что для калибровки микропланшетных флуориметров в ОЕФ и оперативной коррекции этой калибровки в условиях эксплуатации прибора, целесообразно использовать ОС, состоящие либо из флуоресцирующего и поглощающего цветных стекол, либо из флуоресцирующего стекла и нейтрального светофильтра. Нейтральный светофильтр в таком наборе осуществляет корректировку интенсивности излучения флуоресцирующего стекла, а поглощающее цветное стекло корректирует также спектральный состав этого излучения.

3. Встроенный в ПО прибора ФФМ-01 нелинейный алгоритм сравнительной градуировки в ОЕФ, позволяет обеспечить сопоставимость результатов

253 измерения флуоресценции на кюветном и микропланшетном приборах, корректируя расхождения, обусловленные разными схемами возбуждения флуоресценции.

4. Проанализированы специфические источники погрешности, которые возникают при измерении абсорбции и флуоресценции с помощью МОА. Источниками таких погрешностей являются колебания поверхности жидкости в лунке из-за движения микропланшета, искривление поверхности жидкости из-за капиллярных эффектов (мениск). Найдены и обоснованы требования к спектральным характеристикам ИС, геометрии светового пучка, направляемого на лунку, и кинематическому режиму движения планшета, соблюдение которых позволяет свести к минимуму названные погрешности. Показано, что эти погрешности не могут быть выявлены с помощью поверочных планшетов с нейтральными светофильтрами; для их обнаружения необходимы измерения с жидкими контрольными образцами, идентичными реальным пробам по своим спектральным характеристикам и вязкости.

5. Проведенные клинические испытания показали пригодность фотометра-флуориметра ФФМ-01 для различных видов клинических анализов как в режимах флуоресценции (детекция продуктов ПЦР, биохимический анализ), так и абсорбции (ИФА).

6. По результатам испытаний в ФЦГЭ Роспогребнадзора разработаны и утверждены Лабораторным советом Роспотребнадзора Методические рекомендации «Учет результатов иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции с помощью фотометра-флуориметра микропланшетного ФФМ-01».

7. Обоснованные в диссертации научно-технические решения (оптическая схема, алгоритмы программного обеспечения, методика калибровки по шкале длин волн) были использованы при разработке двулучевого спектрофотометра УСФ-01 для спектрального диапазона 190 -1100 нм.

Прибор прошел испытания с целью утверждения типа и включен в Госреестр средств измерений РФ.

8. Предложен и реализован метод определения концентрации и свойств взвешенных частиц в жидкостях, основаннык на совместном анализе спектров малоуглового рассеяния и поглощения излучения в диапазоне 200 -900 нм. Для реализации предлагаемого метода проведена модификация оптической схемы двулучевого спектрофотометра.

9. За счет совместной обработки спектров пропускания и MP появляется возможность с помощью одного прибора получать информацию как о составе жидкости, так и о концентрации и размерах взвешенных в ней частиц. При этом для мутных окрашенных жидкостей можно разделить составляющие общего ослабления света (экстинкции), связанные с поглощением и рассеянием, компенсировав таким образом влияние цветности при измерении мутности жидкости.

Метод может быть назван спектральной нефелометрией и использован при исследовании биологических жидкостей, клеточных и бактериальных культур, растворов полимеров, фармацевтических препаратов.

10. Построение многомерной калибровки с использованием дробного метода наименьших квадратов позволяет решать обратные задачи рассеяния, извлекая данные о распределении взвешенных частиц по размерам из спектров и индикатрис рассеяния.

11. Совместная обработка данных об угловой и спектральной зависимости эффективности рассеяния позволяет выявить те длины волн, на которых угловая зависимость наиболее информативна для определения размеров рассеивающих частиц.

12. Использование в спектрофотометре УСФ-01 ртутной ЛПК, устанавливаемой на место дейтериевой лампы, позволило увеличить точность калибровки по шкале длин волн, контролировать погрешность установки длины волны и спектральное разрешение во всем спектральном диапазоне прибора.

255

13. Разработана и реализована методика измерения абсолютных значений мощности на отдельных спектральных линиях для источников слабого о с оптического излучения (характерная мощность порядка 10* - 10" Вт). При этом используется метод сравнения с образцовым источником, для которого были предварительно произведены измерения на вторичном эталоне единицы СПЭЯ. С помощью разработанной методики измерены абсолютные значения мощности выбранных линий облучателей для спектральной фототерапии, выполненных на основе ЛПК.

14. В результате выполнения диссертационной работы разработаны научно обоснованные технические решения и математические модели, развивающие оптико-спектральные методы исследования биоорганических сред, создана соответствующая аппаратура. Внедрение этих результатов вносит существенный вклад в расширение приборной и методической базы биотехнологических исследований.

256

1. Левин А.Д., Леонов Р.К., Ефимочкин И.С. Установка для контроля оптической однородности прозрачных материалов и рассеивающих дефектов на основе спектрометра молекулярного рассеяния // Приборы и техника эксперимента - 1985.-Т.58.-№ 4, С. 180-183.

2. Иванов В.С, Макшанцев Б.И., Левин А.Д., Бочаров А.В., Колчин К.В., Малеев И.Д., Перфилов С.А. Свечение, возникающее при электрофорезе частиц серебра в воде // Журнал экспериментальной и теоретической физики 1996. - Т. 109.- №3, С. 852-867.

3. Левин А.Д., Прибытков В.А., Рукин Е.М. Серегина И.Ф. Применение атомно-абсорбционных спектрометров для элементного анализа биологических объектов//Измерительная техника.- 2001.- № 6, С. 66 68.

4. Рукин Е.М., Прибытков В.А., Левин А.Д., Широков Б.С. Новые спектральные приборы ООО «Кортэк» // I Всероссийская конференция «Аналитические приборы», Тезисы докладов, СПб, 2002, С. 168-170.

5. Волков А.Ю., Генерозов Э.В., Левин А.Д., Рукин Е.М., Широков Б.С. Микропланшетный фотометр-флуориметр для детекции продуктов амплификации ПЦР и ИФА И Клиническая лабораторная диагностика.2003.-№9, С. 22

6. Левин А.Д., Метрологическое обеспечение измерений флуоресценции при исследовании биологических молекул // Измерительная техника.- 2004-№ 5, С. 53-56.

7. Левин А.Д. Решение задач геометрической и волновой оптики в системе Matlab. // Труды Второй всероссийской научной конференции «Проектирование инженерных и научных приложений в среде Matlab», М,2004, Т.1,С. 234-239.

8. Левин А.Д. Алгоритмы градуировки при многокомпонентном анализе в спектрофотометрии II XIV научно-техническая конференция «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение», Тезисы докладов, М, 2004, С.101-102.

9. Левин А.Д. Источники погрешности п'Ж измерении оптической плотности микропланшетными фотометрами // VI Международная конференция «Прикладная оптика», Сборник трудов, Т.1(1), Санкт-Петербург, 2004, С. 20-24.

10. Левин А.Д., Рукин Е.М., Широков Б.С., Микропланшетный оптический анализатор для ПЦР и ИФА диагностики // Материалы пленума Лабораторного Совета Государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации, М, 2004, С.141-145.

11. Левин А.Д. Особенности измерения оптической плотности микропланшетными фотометрами //Измерительная техника.- 2005.- № 2,1. С. 40-42.

12. Левин А.Д. Микропланшетные оптические анализаторы и их применение в биомедицинских измерениях // Измерительная техника.- 2005.-№3, С. 5863.

13. Левин. А.Д. Сравнительные испытания спектральных приборов медицинского : назначения // XV научно-техническая конференция «Фотометрия и ее метрологическое обеспечение», М, 2005, С. 126 128.

14. Левин А.Д., Прибытков В.А., Рукин Е.М., Широков Б.С Новые приборы для атомного и молекулярного спектрального анализа П Вторая Всероссийская конференция «Аналитические приборы», Тезисы докладов, Санкт-Петербург, 2005.

15. Левин А.Д. Метрология абсорбционных и флуоресцентных микропланшетных анализаторов // Вторая Всероссийская конференция «Аналитические приборы», Тезисы докладов, Санкт-Петербург, 2005.

16. Байков А.Д., Левин А.Д., Мамчур Г.И. Микропланшетный анализатор ФФМ-01 для скрининга и диагностики фенилнетонурии // ФКУ новости, 2005, №8, С. 11

17. Баранов С.В., Левин А.Д., Прибытков В.А., Рукин Е.М., Садагов Ю.М. Обеспечение единства измерений в аналитической спектрофотометрии// Измерительная техника, 2005, № 11, С.65-68.

18. Левин А.Д. Определение характеристик взвеси частиц по спектрам малоуглового рассеяния света // Измерительная техника.- 2006.- №1, С. 5760.

19. Левин А.Д. Модель многомерной градуировки для определения параметров дисперсных частиц по спектрам малоуглового рассеяния // Измерительная техника.- 2006.- №9 , С.34-36.

20. Тезисы докладов, М., 2006.

21. Analytical biotechnology, Thomas G.M. Schalhamer Т. ed, Birkhauser,

22. Basel Boston -Berlin, 2002, 344 p.

23. Сидоренко B.M. Молекулярная спектроскопия биологических сред, М,1. Высшая школа», 2004.

24. Сердюк Н.И. Физические методы в структурной молекулярной биологии в начале XXI века. Успехи биологической химии, т.42, 2002, С.3-28.

25. Воздействие на организм человека опасных и вредных экологических факторов Метрологические аспекты В 2-х томах, Под ред. Исаева JI.K., М, ПАИМС, 1997, 496 с.

26. Varian Australia Pty Ltd. Publication No. 85 -100848-00, Sept. 1988, 193 c.

27. Analytical methods for blood lead measurements; Wisconsite state laboratory of hygiene, July 21, 1997.

28. Ермаченко JI.A. , Ермаченко B.M. Атомно-абсорбционный анализ с графитовой печью М, ПАИМС, 1999, 220 с.

29. Welz В. и др. Continuum-source Atomic Absorption Spectrometry What Can We Expect ? // Journal of the Brazilian Chemical Society, 2003, Vol. 14, No. 2, P. 220-229.

30. Welz В. и др. High-Resolution Continuum Source AAS The Better Way to Do Atomic Absorption Spectrometry, Wiley, New-York, 2005

31. Томпсон M., Уолш Д.Н. Руководство по спектрометрическому анализу с индуктивно связанной плазмой. М., Недра, 1988, 287 с.

32. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия: Применение физико-химических методов в биохимии и молекулярной биологии: Пер. с англ. /; Под ред. З.А. Шабаровой. М. : Мир, 1980. - 582с. : илл.

33. Анализаторы биологических жидкостей медицинские. Термины и определения ГОСТ 18996-80.

34. Овчинников М.М., Подгорный Г.Н., Балаховский И.С. Количественный спектрофотометрический анализ в ультрафиолетовой,видимой и ближней инфракрасной областях, Клиническая лабораторная диагностика, 2002, № 2, С. 6 -11.

35. Бернштейн И.Я., Каминский Ю.Л., Спектрофотометрический анализ в органической химии, изд-во «Химия», Ленинградское отд. 1986, 200 с.

36. Тиноко И., Зауэр К., Иэнг Дж., Пуглиск Дж., «Физическая химия. Принципы и приложения к биохимии и молекулярной биологии», в 2 томах, изд-во «Техносфера», М, 2004.

37. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноанализа,, Москва , «Высшая Школа», 1991.

38. Самуилов В.Д., Иммуноферментный анализ, Соросовский образовательный журнал, 1999, № 12, С. 9-15.

39. Борисов И.А., Гаврилова Е.М., Андреева И.П., Егоров А.М, Решетилов А.Н Моделирование калибровочных зависимостей в иммуноферментном анализе с помощью искусственных нейронных сетей// Сенсорные системы, 2000, т. 14, № 4, С. 343-349

40. Скала Л.З., Сидоренко С.В., Нехорошева А.Г., Лукин И.Н., Грудинина С.А. Практические аспекты современной клинической микробиологии, Москва, 2004.

41. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии, М, «Мир», 1986

42. Christian Mayer, Thomas G.M. Schalhamer Fluorescence Techniqes, Analytical biotechnology, Basel Boston -Berlin, 2002, P. 44-92.

43. Карнаухов B.H. Люминесцентный анализ клеток. // Электронное издательство «Аналитическая микроскопия», Пущино, 2002.

44. Chen W., Westerhoff P., Leencher J.,Booksh К. Fluorescence Excitation-Emission Matrix Regional Integration to Quantify Spectra for Dissolved Organic Matter // Environment science and technology, 2003, vol. 37, P. 5701-5710.

45. Франк-Каменецкий М.Д. Век ДНК. Изд.-во «Книжный дом «Университет», М, 2004

46. Момыналиев К.Т., Говорун В.М. Перспективы применения методов ДНК диагностики в лабораторной службе// Клиническая лабораторная диагностика, 2000, №5, С. 25-32.

47. Еремин С. А. Поляризационный иммуноанализ физиологически активных веществ Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук, М, 2004

48. Harma Н., Souka Т., Lovgren Т. Europium nanoparticles and time-resolved fluorescence for ultrasensitive detection of prostare-specific antigen//, Clinical Chemistry, 2001, vol.3, P. 561-568.

49. Долгов B.B., Ованесов E.H., Щетникович K.A. Фотометрия в лабораторной практике, Издательство: СПб., Витал Диагностике, 2004, 192 с.67. ; Фридрихсберг Д.А. Курс коллоидной химил.-Л.:Химия, 1984, 317 с.

50. Campbel R. How are McFarland Units related to Nephelometry Turbidity Units? // MadSci Network, Environment & Ecology, 2003, October http ://www.madsci.org/posts/archives/2003-12/1070415611 .En.r.htm 1

51. Шифрин K.C. Рассеяние света в мутной среде. M.-JL: Гостехиздат,1951.

52. Ван де Хюлст. Рассеяние света малыми частицами. М. ИЛ. 1961.

53. Исимару А. Распространение и рассеяние волн в случайно-неоднородных средах. М.: Мир, 1981, ч.1, 280 е., ч.И, 317 с.

54. Борен К.,.Хафмен Д. Поглощение и рассеяние света малыми частицами -М.: Мир, 1986.

55. Шифрин К.С. Изучение свойств вещества по Однократному рассеянию

56. В книге «Теоретические и прикладные проблемы рассеяния света», Минск, изд.-во «Наука и техника», 1971, С.228-244

57. Тихонов А.Н. Об устойчивости обратных задач, Доклады АН СССР, -1943, том 39, №5, С. 195-198.

58. Тихонов А.Н., Арсенин В.Я., Методы решения некорректных задач //М: Наука, 1986.

59. Лаврентьев М.М., Романов В.Г., Шишатский С.П. Некорректные задачи математической физики и анализа //М: Наука, 1980.

60. Турчин В.Ф., Козлов В.П., Малкевич М.С. Использование методов математической статистики для решения некорректных задач. // Успехи физических наук 1970, т. 102, № 2, С. 345-38С.

61. Ferri F., Bassini A., Paganini E.Modified version of the Chachine algorithm to invert spectral extinction data for particles sizing//Applied Optics, 1995, vol. 34, No 25, P. 5829- 5839.

62. Ferri F., Bassini A., Paganini E. Commercial spectrophotometer for particles sizing// Applied Optics, 1997, vol. 36, No 4, P. 885-891.

63. Hespel L. Delfour A. Mie light-scattering granulometer with an adaptive numerical filtering method I. Theory // Applied Optics, 2000, vol.39,.P. 6897-691

64. Hespel L., Delfour A., Guillame B. Mie light-scattering granulometer with an adaptive numerical filtering method. II. Experiment, //Applied Optics, 2001, vol.40, No.6, P. 974-985.

65. Jones R.M. Particle size analysis by laser diffraction // American laboratory, 2000, P. 44-47.

66. ISO 13320-1:1999 Particle size analysis Laser diffraction methods84: Лебедев А.Д. Левчук Ю.Н., Ломакин А.В., Носкин Л.А.Лазерная корреляционная спектроскопия в биологии и медицине. Киев: Наукова думка, 1987

67. Панченко М.В., Свириденков М.А., Терпугова С.А., Козлов B.C. Активная спектронефелометрия в исследовании микрофизических характеристик субмикронного аэрозоля // Оптика атмосферы и океана. 2004. Т. 17. № 5-6. С. 428-436.

68. Тучин В.В. Исследование биотканей методами светорассеяния // Успехи физических наук, 1997, том 167, № 5, С. 517-539

69. Лопатин В.Н., Приезжев А.В. Методы светорассеяния в анализе дисперсных биологических сред, М: Физ.-кат. лит., 2004. — 384 с.

70. Шайтан К.В., Лобков А.Б., Тимофеев И.В. Чижов А.А., Лисовская Л.И., Терешкин И.В. Метод лазерного цитомониторинга и его применениедля определения размеров эритроцитов // Биологические мембраны,2002, том 19, №3, С. 209-218.

71. Аверьянов К.П., Кельбалиханов Б.Ф., Трубников Б.Н., Чудновский В.С, Чудновский J1.C. Методы и прибор!., мониторинга абиотических и биотических экологических факторов // Экологические системы и приборы, 2001, №6, С. 11- 17

72. Яковлев С.А., Аверьянов К.П., Зеленчук B.C. и др. Лазерная диагностика онкологических заболеваний // 1 Международный конгресс «Экология и дети», Тезисы докладов, Сочи, 1999.

73. Яковлев С.А., Аверьянов К.П., Зеленчук B.C. и др. Лазерная диагностика онкологических заболеваний // Энергоинформационная визуализация нозологического диагноза, М, МАСИ, 2000.

74. Ma X, Lu Q.J, Brock R.S., Jacobs К.М., Yang P., Ни X. Determination of complex refractive index of polylystyrene microsphers from 370 tO 1610 nm//, Physics in medicine and biology,2003, V. 48, P.4165-4172

75. Эсбенсен Ким., Анализ многомерных данных, пер. с англ, Барнаул,2003.

76. Аналитическая химия. Проблемы и подходы (в 2-х т.), под. ред. Кельнер Р., Мерме Ж.-М., Отто М., Видмер Г.М., пер. с анг., М., Мир ACT, 2004.

77. Родионова О.Е., Померанцев А.Л. Хемометрика : достижения и перспективы, Успехи химии, 2006, том 75, вып.4, С.302-321.

78. Mignani A.G., Smith P.R., Ciaccheri L., Cimato A. , Sani G. Spectral nephelometry for the measurement of extra-virgin olive oil fingerprints IEEE Sensors 2002, № 602.

79. Mignani A.G., Ciaccheri L., Cimato A., Attilic» C. and Smith P.R. Spectral nephelometry for the geographic classification of Italian extra virgin olive oils//Sensors and Actuators B: Chemical, 2005, P. 363-369

80. Manne Rolf , 1987. Analysis of two partial-least-squares algorithms for multivariate calibration Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 1987, vol.2; P. 187-197.

81. Andersen C.A., Bro R. The N-way Toolbox for MATLAB. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 2000, vol.52; p.p. 1-4.

82. Gourvenec S., Tomasi G., Durvillec C., Crescenzo E.Di, Saby С.А/, D.L. Massarta D.L., Bro R., Oppenheim G. CuBatch, a MATLAB® interface for n-mode data analysis// Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems 2005 ,№77, P. 122-130

83. Nahomiak M.L. and Booksh K.S. Optimizing the implementation of the PARAFAC method for near-real time calibration of excitation emission fluorescence analysis // Journal of Cemometrics, 2003, vol.17, P. 608-616.

84. Antunes A.M., Ferreira Marcia M. C.and Volpe Pedro L. O. A chemometric study of amino acid transport through liquid membranes using UV-VIS spectroscopy// Journal of Econometrics, 2002, vol.16, P. 111-116.

85. Giana H. E., Silveira L. Zangaro R. A., Pacheco M. T. Rapid Identification of

86. Bacterial Species by Fluorescence Spectroscopy and Classification Through Principal Components Analysis, //Journal of Fluorescence, 2003, vol. 13 (6), P.489-493.109. , Shirakawa H. and Miyazaki S. Blind Spectral Decomposition of Single

87. Cell Fluorescence by Parallel Factor Analysis // Biophysical Journal, 2004, vol. 86 P. 1739-1752

88. Sena M.M., Poppi R.J. N-way PLS applied to simultaneous spectrophotometric determination of acetybalicylic acid, paracetamol and caffeine// Journal of pharmaceutical and biomedical analysis,2004, vol.34, №1, P.27-34.

89. Rinnan O., Booksh K.S., Bro R. First order Rayleigh scatter as a separate component in the decomposition of fluorescence landscapes,// Analytica Chimica Acta, 2005, V. 537, Iss. 1-2, P. 349-358

90. Engelena S., Mollerb S., Huberta M. Automatically Identifying Scatter in Fluorescence Data using Robust Techniques// Preprint submitted to Elsevier Science 4 August 2006

91. Wang Jia, Boelens Hans F. M., Thathagar Mehul B. and Rothenberg Gadi266

92. Situ Spectroscopic Analysis of Nanocluster Formation 11 ChemPhysChem, 2004, vol.5, P.93-98.

93. Cortese Jorge D. Well Read //The Scientist, 2^ JO, vol. 14 iss.:24,

94. Malik T. Microplate Reader Madness. The Scientist, 2003, vol.17, iss.22 ■

95. Manns R.L. The history of microplates //Business briefing Future drug discovery, June, 2003.

96. ANSI-SBS 1 -2004. Footprint dimensions for Microplates.

97. ANSI-SBS 2-2004.Height dimensions for Microplates.

98. ANSI-SBS 3-2004 Bottom Outside Flame Dimensions for Microplates

99. ANSI-SBS 4-2004 Well Positions for Microplates121 .SBS Recommended Microplate Specification, Revised April 1999.

100. Малышев В.И., Введение в экспериментальную спектроскопию, изд.-во, «Наука», М, 1978, 480 с.

101. Левшин Л.В., Салецкий М.А. Оптические методы исследования молекулярных систем 1. Молекулярная спектроскопия, изд.-во МГУ, М, 1994,320 с.

102. Алешкевич В.А., Деденко Л.Г., Караваев В.А. Механика сплошных сред, изд-во физического факультета МГУ, М, 1998.

103. Ландау Л.Д., Лифшиц Е.М., Гидродинамика, М, «Наука», 1986, 736 с.

104. Современная теория капиллярности. К 100-летию теории капиллярности Гиббса. Под ред. проф. А.И. Русанова (СССР), проф. Ф.Ч. Гудрича (США) Л.: Химия, 1980; 344 е., илл.

105. Запрягаева Д.А., Свешникова И.С. Расчет и проектирование оптических систем, М., Логос, 2000.

106. ZEMAX . Software for optical design. Zemr,x Development Corporation, 2004.

107. Борн M., Вольф Э. Основы оптики, Пер. с англ., М.: Наука, 1973, 720 с

108. Лёвшин Л.В, Салецкий A.M. Люминесценция и ее измерения. Молекулярная люминесценция.- М, изд.-во МГУ, 1989, 272 с.

109. Паркер С. Фотолюминесценция растворов, М, Мир, 1972

110. Handbook of Fluorescent Probes and Research Products,. Web edition, Molecular probes, Inc-Eugen, 2003.267

111. Matech fluorescence reference standards, Проспекты фирмы «Matech», 2002.

112. Knight Alex, Gaunt Joe, Davidsor Tim, Chechik Victor, and Windsorn Stuart // Evaluation of the Suitability of Quantum Dots as Fluorescence Standards, National Physical Laboratory, Report DQL-AS 007, September, 2004.

113. ГОСТ 9411-91 Стекло оптическое цветное.

114. Каталог цветного стекла, изд-во «Машиностроение», М, 1967.

115. SCHOTT GLAS Optics for devices. Fluorescence of optical glass Technical information TIE-36, September 2004.

116. Бутусов M.M., Галкин С.Д., Оробинский С.П., Пак Б.П. Волоконная оптика и приборостроение, JL, Машиностроение, 1987, JL, Машиностроение, 1987,- 327 с.

117. Тгап Р.Т. and Fred Chang Transmitted Light Fluorescence Microscopy Revisited// Biological Bulletin, 2001, vol.201, P. 235 236

118. Иванов B.C., Золотаревский Ю.М., Котюк А.Ф. и др. Основы оптической радиометрии, под ред. проф. А.Ф. Котюка, М, Физматлит, 2003, 544 с.

119. Дёрфель К. Статистика в аналитической химии, М, «Мир», 1994, 272 с.

120. Geibeler R,McGown Е., French Т., Owiski J.C. //Performance validation for microplate fluorimeter// Journal of fluorescence, 2005, vol.15, №3. P.363-375.

121. МИ2334-96, ГСИ, Смеси аттестованные, общие требования к разработке.

122. Золин ■П.П., Киреева В.Н., Никитина Н.В., Штерн Э.Т, Первый российский биохимический анализатор-автомат «АЛБ-УОМЗ»: Сравнительная оценка качества исследований, // Депонировано в ВИНИТИ № 748-В 2002, Омск, 2002

123. James О. Vestgard Use and interpretation of Common Statistical Test in Method Comparison Studies// Clinical Chemistry, 1973, vol.19, №1, P.49-57.

124. Dietmar Sto'ckl, Katy Dewitte, and Linda M. Thienpont Validity of linear regression in method comparison studies: it is limited by the statistical model of the quality of the analytical input data ? //Clinical chemistry, 1998, vol.44,№11, P.2340-2346.

125. Hyltoft Petersen et al. Graphical interpretation of analytical data from a comparison of a field method with a reference method by use of difference plots. Clinical Chemistry 1997; vol. 43, P:2039-2046

126. Guidelines for evaluating and expressing the uncertainty of measurements results Руководство по выражению неопределенности измерения.// Перевод и публикация ГП ВНИИМ им. Д.И. Менделеева, 1999.

127. Krouwer Jan S. Uncertenity in Measurement Method of Estimating and Reporting Uncertainty in Diagnostic Assays // Clinical Chemistry, 2003, vol. 49, № 11, P. 1818-1821.

128. Kristiansen Jesper The Guide to Expression of Uncertainty in Measurement Approach for Estimating Uncertainty in Diagnostics Assays// Clinical Chemistry, 2003, vol. 49, № 11, P. 1822-1829.

129. Баженов Ю.В., Демин A.M., Темиргазеева JI.K., Чугунов Ю.П., Малогабаритный монохроматор с вогнутой дифракционной решеткой, Оптический журнал, 2002, том 69, № 12, С.53-55.

130. Тарасов К.И., Спектральные приборы, изд.-во «Машиностроение», Л, 1977, 368 с.154., Нагибина И.М., Москалев В.А., Полушкина Н.М., Рудин В.Л. Прикладная физическая оптика, изд.-во «Высшая школа», М, 2002, 568 с.

131. Сергиенко А.Б. Цифровая обработка сигналов, СПб, изд-во «Питер», 2002

132. Papousek D., Pila J. Mathematical resolution of overlapping spectrum lines by the method of damped least squares. Collection Chechoslov.Chem. Commun,. 1965, vol. 30, № 9, P. 3007 - 3015.

133. Spectrophotometer calibration filters. Сайт фирмы Thomas Scientific http://www.thomassci.com/product/4043

134. Тонкоструктурный абсорбционный светофильтр TAC-1. Руководство по эксплуатации, M, НИФХИ, 1989

135. Pencil style calibration lamps, проспект фирмы ORIEL INSTRUMENTS, 2004

136. Спектрофотометры для ультрафиолетовой/видимой области Lambda EZ301 и Lambda 25/35/45. Проспект фирмы Perkin Elmer, 2004

137. Эпштейн М.И. Измерения оптического излучения в электронике, Москва, Энергоатомиздат, 1990, 256 с.

138. Сидоренко В.М. Механизм влияния слабых электромагнитных полей на живой организм // Биофизика, 2001, т.46, bf л.З, С. 500 -504.

139. Василенко A.M., Рукин Е.М. Шмыгов В.А.Спектральная фототерапия, сообщение 1: биофизические и медико-технические основы метода, Рефлексотерапия, 2004, № 3(10), С. 36-42269

140. Сайт ЗАО «Опто-технологическая лаборатория» http://www.optotl.rn/BK7Rus.htm 165. Сайт фирмы Hamamatzu Photonics.

141. Liger V., Zybin A., Y. Kuritsyn, K. Niemax Diode-laser atomic-absorption spectrometry by the double-beam—double-modulation. technique// Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy 1997 vol. 52, № 8, P. 11251138

142. Зайдель A.H., Прокофьев B.K., Райский C.M., Славный В.А., Шрейдер Е.Я., Таблицы спектральных линий, Справочник, изд.-во «Наука», М, 1977, 800 с.

143. Кленин В.И., Щеголев С.Ю., Лаврушин В.И. Характеристические • функции светорассеяния дисперсных систем, изд.-во Саратовскогоуниверситета, 1977, 177 с

144. Шифрин К.С., Салганик И.Н. Таблицы по светорассеянию. Рассеяние света моделями морской воды т.5., Л. Гидрометеоиздат,1973.

145. Дейрменджан Д., Рассеяние электромагнитного излучения сферическими полидисперсными частицами. М.: Мир, 1971

146. Matzler С. MATLAB Functions for Mie Scattering and Absorption Reaserch Report No. 2002-08 June 2002 //Institut fur Angewandte Physik, Bern

147. Rich T.C., Pinnow D.A. Total optical attenuation in bulk fused silica// Applied Physics Letters, 1972, vol. 20, iss.7, P.264-266.

148. Ритус A.M. Труды ФИАН, 1982, т. 137, № 3.

149. ООО «Диафарм» Полистирольные латексы для калибровки, http ://www.macro .m/DiapharrMatex/index.html

150. Ройтман E.B., Азизова О.А., Морозов Ю.А., Асейчев А.В. Окислительно-модифицированный фибриноген влияет на реологические свойства крови Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2004, Том 138, № 11. С. 527-529.

151. Васильев В.Н., Гуров И.П. Компьютерная обработка сигналов в приложении к интерферометрическим системам. СПб, БХВ, Санкт-Петербург, 1998, 240 е., с илл.

152. Грибов Л.А„ Баранов В.И., Эляшберг М.Е. Безэталонный молекулярной спектральный анализ Теоретические основы Эдиториал УРСС, М., 2002270