автореферат диссертации по безопасности жизнедеятельности человека, 05.26.02, диссертация на тему:Клинико-экспериментальное обоснование применения интерлейкина-1β для профилактики и терапии поражений при радиационных авариях

На правах рукописи

ТИМОШЕВСКИЙ Александр Анатольевич

КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ИНТЕРЛЕЙЬСИНА-1(3 ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ТЕРАПИИ ПОРАЖЕНИЙ ПРИ РАДИАЦИОННЫХ АВАРИЯХ

05.26.02 - безопасность в чрезвычайных ситуациях 03.00.01 - радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург - 2009

003468593

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени A.M. Никифорова» МЧС России и Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ.

Научные консультанты: Заслуженный врач РФ

доктор медицинских наук профессор Алексанин Сергей Сергеевич доктор медицинских наук профессор Гребенюк Александр Николаевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор

Суворов Игорь Михайлович доктор медицинских наук профессор Легеза Владимир Иванович доктор медицинских наук профессор Баринов Владимир Александрович

Ведущая организация: Государственный институт усовершенствования

врачей Министерства обороны РФ

Зашита состоится «» Ь> -f— 2009 года в 7/ часов на заседании диссертационного совета Д 205.001.01 при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени A.M. Никифорова» МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 4/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени A.M. Никифорова» МЧС России

Автореферат разослан ч . 009 г.

Ученый секретарь .

диссертационного совета / кандидат медицинских наук

М.В. Санников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Одной из актуальных проблем обеспечения безопасности в чрезвычайных ситуациях природного, техногенного, биолого-социального и военного характера является разработка и внедрение в практическую деятельность принципиально новых средств, в том числе медицинских, позволяющих сохранить жизнь и здоровье людей в экстремальных условиях, в частности, при радиационных авариях и катастрофах.

В настоящее время источники ионизирующих излучений широко используются во всех сферах деятельности человека, что резко повышает вероятность возникновения чрезвычайных ситуаций радиационного характера и возможность поражения людей факторами радиационной природы. По сравнению с прошлым значительно расширился перечень источников радиационной опасности: потенциальную угрозу жизни и здоровью людей в настоящее время создает не только ядерное оружие, но и объекты атомной энергетики, медицинские, научные, промышленные и другие источники ионизирующих излучений [Ильин Л.А. и др., 1996; Mettler F.A. et al., 1990]. В то же время только на территории России в организациях, использующих источники ионизирующих излучений, работают более 220 тысяч человек персонала категорий «А» и «Б» [Онищенко Г.Г., 2008]. Более разнообразными стали и условия радиационного воздействия на человека, а, следовательно, и формирующиеся при этом формы лучевой патологии: не только острые, но и хронические поражения, лучевые реакции, стохастические эффекты облучения [Гуськова А.К., 1997; Цыб А.Ф. и др., 2002; Алексанин С.С., 2008].

Актуальность проблемы обусловлена и тем, что XX век, особенно его вторая половина, характеризуется неуклонным ростом числа и масштабов аварий и катастроф, в том числе на предприятиях ядерно-энергетического комплекса [Никифоров А.М. и др., 1997; Nenot J.C., 1990]. Не считая аварии на Чернобыльской АЭС, в мире произошло более 420 крупных радиационных инцидентов, в ходе которых не менее 3000 человек были значительно облучены, 133 из них со смертельным исходом [IAEA, 2003]. Наиболее значимыми радиационными авариями являются: Чернобыльская катастрофа (Украина, 1986), аварии в Гойянии (Бразилия, 1987), Сан-Сальвадоре (Сальвадор, 1989), Таммику (Эстония, 1994), Токай-Мура (Япония, 1999). К сожалению, эта печальная тенденция сохраняется и в XXI веке: аварии в Самарской области (Россия, 2000), Лиа (Грузия, 2001), Билыстоке (Польша, 2001) и др.

Согласно данным регистра Федерального медицинского биофизического центра им. А.И. Бурназяна ФМБА России, за время существования атомной энергетики на территории бывшего СССР и России произошло 349 радиационных инцидентов с серьезным облучением людей. При этом, у 753 пострадавших имели место клинически значимые острые радиационные поражения, у 349 человек была диагностирована острая лучевая болезнь, а 71 погиб в результате радиационного воздействия в первые 3-4 месяца после

облучения. Только за последнее десятилетие (1998-2007 гг.) в России произошло 36 аварийных ситуаций с источниками ионизирующих излучений с вовлечением в них более 80 человек, 48 из которых получили острые лучевые и комбинированные поражения [Котенко К.В., Бушманов А.Ю., 2008].

Кроме того, несмотря на международные соглашения, сохраняется возможность применения ядерного оружия в современных войнах и локальных конфликтах, а угроза ядерного терроризма в последние годы неуклонно возрастает [Куценко С.А. и др., 2001; Cirincione J. et al., 2002]. Все это позволяет утверждать, что в настоящее время имеется настоятельная потребность в новых высокоэффективных медицинских средствах противорадиационной защиты, а их дальнейшее совершенствование с целью обеспечения безопасности в чрезвычайных ситуациях радиационного характера является одной из актуальных проблем современной радиобиологии и медицины.

К сожалению, в решении этой важной проблемы существуют определенные трудности. Традиционные радиопротекторы обладают высокой эффективностью для защиты организма при радиационных воздействиях, но действуют они лишь в условиях острого облучения в смертельных дозах, проявляют свой радиозащитный эффект в течение короткого промежутка времени, могут применяться только с профилактическими целями [Владимиров В.Г. и др., 1989, 1994; Giambarresi L.J., Walker R.J., 1989; Landauer M.R. et al., 1992]. Средства комплексной терапии острой лучевой болезни в полном объеме могут быть использованы только в условиях специализированного стационара, лечение требует продолжительного времени и наличия высоко-квалифицированного персонала [Селидовкин Г.Д., 1995; Гуськова А.К., 2008].

В связи с этим в течение последнего десятилетия усилия исследователей, работающих в этой области, направлены на изыскание препаратов, одновременно обладающих как профилактическим, так и лечебным действием [Легеза В.И. и др., 2001; Akiyama М., Nakamura N., 1991]. Эти средства должны быть эффективны не только при остром радиационном воздействии, но и при пролонгированном облучении, при внутреннем облучении, вызванном инкорпорацией продуктов ядерного деления, при местных, сочетанных и комбинированных радиационных поражениях. Их радиозащитное действие должно проявляться в условиях однократного применения и сохраняться в течение достаточно длительного времени. Такие препараты получили название «средств, повышающих радиорезистентность организма» [Легеза В.И., Владимиров В.Г. и др., 2000] или «средств биологической защиты» [Васин М.В., 2001]. Показано, что высокой противолучевой лечебной и профилактической эффективностью при различных вариантах радиационных воздействий обладают иммуномодуляторы и, в частности, цитокины [Антушевич А.Е. и др., 1992; Кетлинский С.А. и др., 1992, 1995; Будагов P.C. и др., 1997; Смирнов H.A. и

др., 2000; Легеза В.И. и др., 2005, 2008; Neta R., 1988, 1997; Testa N.G., 1991; Dalmau S.R. et al., 1997; Grebenyuk A. et al., 2007].

К числу наиболее перспективных противолучевых средств из группы цитокинов относят интерлейкин-1 (ИЛ-1). В экспериментальных исследованиях, проведенных на различных видах лабораторных животных, показано, что препараты ИЛ-1 при их использовании до внешнего облучения с высокой мощностью дозы обладают свойствами радиопротекторов [Neta R. et al., 1986, 1991, 1994; Schwarts G.N. et al., 1990; Constine L.S. et al., 1991]. Установлено также, что при однократном применении в течение первых часов после острого радиационного воздействия ИЛ-1 выступает в качестве эффективного средства терапии лучевых поражений [Чигарева Н.Г. и др., 1993, 2000; Рогачева СЛ. и др., 1994, 1997; Рождественский Л.М., 1995,2001; Neta R., Oppenheim J.J., 1988].

В то же время, не уточнены оптимальные сроки применения ИЛ-lß в схемах профилактики и ранней терапии радиационных поражений, практически не изучена его противолучевая эффективность при поражениях ионизирующим излучением, вызванных внешним облучением с низкой мощностью дозы, при сочетанных лучевых поражениях, а также при фракционированном облучении в больших суммарных дозах. Не в полной мере определено его влияние на показатели костномозгового кроветворения, динамику клеток периферической крови и состояние нейтрофилов у облученных животных. Требует дальнейшего уточнения вопрос о механизмах и путях реализации радиозащитного и лечебного эффекта ИЛ-lß, а также о возможности экстраполяции данных экспериментальных исследований на человека. В частности, в литературе отсутствуют сведения о переносимости ИЛ-lß и влиянии этого препарата на объективный статус, гематологические, биохимические и иммунологические показатели здоровых людей, а также о его радиозащитной эффективности в отношении человека. Все это требует проведения дальнейших исследований по изучению радиозащитных свойств ИЛ-lß с целью создания на основе этого цитокина современного патогенетического средства профилактики и терапии различных форм лучевых поражений, формирующихся при радиационных авариях и катастрофах.

Целью исследования явилось клинико-экспериментальное обоснование возможности использования интерлейкина-lß в качестве медицинского средства профилактики и терапии лучевых поражений, формирующихся при радиационных авариях и катастрофах.

Для достижения цели исследования предстояло решить следующие основные задачи:

1. Оценить противолучевую эффективность интерлейкина-lß при остром радиационном воздействии с различной мощностью дозы, при пролонгированном облучении, при сочетанием внешнем и внутреннем облучении, а также при фракционированном радиационном воздействии.

2. Определить модифицирующее влияние интерлейкина-lp на показатели костномозгового кроветворения облученных животных.

3. Изучить динамику количественного состава лейкоцитов и состояние нейтрофилов периферической крови у животных, подвергнутых острому, пролонгированному, сочетанному и фракционированному радиационному воздействию на фоне профилактического или лечебного применения интерлейкина-ip.

4. Уточнить влияние интерлейкина-lp на субъективное состояние и объективный статус здоровых людей, на их гематологические, биохимические и иммунологические показатели.

5. Выявить эффекты интерлейкина-ip, введенного здоровым людям, в отношении изменений количественных и функционально-метаболических показателей лейкоцитов, регистрирующихся после облучения проб периферической крови in vitro.

Решение поставленных задач позволило сформулировать следующие основные положения, выносимые на защиту:

1. Отечественный препарат рекомбинантного интерлейкина-ip может рассматриваться в качестве принципиально нового медицинского средства обеспечения безопасности специалистов аварийно-спасательных формирований и персонала радиационно-опасных объектов при чрезвычайных ситуациях радиационного характера, так как обладает радиозащитным действием и может использоваться для экстренной терапии радиационных поражений.

2. Лечебно-профилактическая эффективность интерлейкина-ip проявляется при различных вариантах радиационного воздействия: остром, пролонгированном и фракционированном внешнем облучении, а также при сочетанном внешнем и внутреннем облучении от инкорпорации радионуклидов, характерных для раннего периода радиационной аварии.

3. Гемостимулирующее действие интерлейкина-ip, проявляющееся в снижении выраженности постлучевых нарушений костномозгового кроветворения, сохранении жизнеспособности клеток-предшественников гемопоэза, ускорении восстановления числа лейкоцитов периферической крови, модификации функционально-метаболического статуса нейтрофилов, субпопуляционного состава лимфоцитов и характеристик цитокиновой сети после' радиационного воздействия, служит основой для реализации противолучевых эффектов препарата.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. На основании результатов экспериментальных и клинических исследований показана возможность и обоснована целесообразность использования интерлейкина-ip в качестве принципиально нового медицинского средства обеспечения безопасности людей при чрезвычайных ситуациях радиационного характера.

Установлено, что ИЛ-1р обладает лечебно-профилактическим действием, проявляя наибольшую радиопротекторную активность при введении за 24 ч до облучения и оказывая выраженный лечебный эффект при использовании в течение первого часа после радиационного воздействия. Выявлено, что профилактическое и раннее терапевтическое применение препарата позволяет увеличить выживаемость лабораторных животных в условиях острого у- и рентгеновского облучения, пролонгированного радиационного воздействия с низкой мощностью дозы, сочетанного внешнего и внутреннего облучения за счет инкорпорации радионуклидов, характерных для раннего периода радиационной аварии.

- Показано, что введение ИЛ-1(3 за 24 ч до облучения или через 1 ч после радиационного воздействия способствует снижению выраженности постлучевых нарушений костномозгового кроветворения и увеличению пролиферативной активности гемопоэтических клеток.

Обнаружено, что при различных вариантах радиационного воздействия ИЛ-1(3 оказывает позитивное влияние на динамику количества лейкоцитов периферической крови и качественное состояние нейтрофилов. Выявлено, что при остром облучении с высокой мощностью дозы, при пролонгированном радиационном воздействии, при сочетанном внешнем и внутреннем облучении, при фракционированном радиационном воздействии применение ИЛ-lp способствует ускорению восстановления общего числа лейкоцитов, абсолютного количества и относительного содержания нейтрофилов и лимфоцитов периферической крови, стимуляции функциональных свойств и метаболической активности нейтрофильных гранулоцитов.

Установлено, что при внутривенном введении рекомбинантный ИЛ-ip хорошо переносится здоровыми людьми и, за исключение кратковременного повышения температуры до субфебрильных цифр, не оказывает отрицательного влияния на самочувствие и объективный статус людей, а также на биохимические показатели крови. В тоже время, препарат обладает гемо- и иммуностимулирующим действием, которое проявляется развитием умеренного нейтрофильного лейкоцитоза, повышением функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов, увеличением количества клеток, синтезирующих и продуцирующих провоспалительные цитокины.

Показано, что ИЛ-1(5 обладает выраженной радиозащитной активностью по отношению к лейкоцитам периферической крови и цитокиновой сети, что дополняет представления о механизмах радиопротекторного действия данного цитокина. Выявлено, что у здоровых людей максимальный радиозащитный эффект препарата, оцененный по количественным и функционально-метаболическим показателям лейкоцитов периферической крови, наблюдается через 24 ч после его парентерального введения. Установлено, что введение ИЛ-10 за 24 ч до облучения проб периферической крови людей in vitro отменяет радиационно-индуцированное снижение различных субпопуляций лимфоцитов, нормализует функционально-метаболический статус

нейтрофилов, измененный вследствие облучения, снижает выраженность пострадиационных нарушений цитокиновой сета.

Сформулированы и экспериментально обоснованы возможные механизмы радиозащитного действия ИЛ-ip, связанные с его способностью предотвращать постлучевую депрессию кроветворения, ускорять восстановление гемопоэза, уменьшать выраженность процесса апоптоза, а также стимулировать иммунитет и неспецифическую резистентность организма.

Практическая значимость. Разработана и экспериментально обоснована возможность применения ИЛ-1(3 при различных видах лучевого воздействия (острое, пролонгированное, фракционированное, сочетанное облучение) в качестве средства профилактики и ранней терапии радиационных поражений.

Уточнены оптимальные сроки и схемы применения ИЛ-ip для профилактики и лечения различных форм радиационных поражений. Показано, что введение препарата рекомбинантного ИЛ-1(3 испытуемым здоровым людям по субъективным, клиническим и лабораторным данным не приводит к ухудшению состояния их здоровья и дееспособности.

Разработана и на примере ИЛ-1р апробирована экспериментальная модель, позволяющая оценить эффективность радиозащитных препаратов в отношении человека, в основе которой лежит исследование реакций количественного состава различных субпопуляций лейкоцитов, параметров клеточного иммунитета, характеристик цитокиновой сета и морфофункциональных показателей нейтрофилов, развивающихся после введения здоровым людям исследуемого препарата и последующего облучения проб их периферической крови in vitro.

Реализация результатов исследования. Рекомендации, разработанные на основании полученных результатов, используются в научно-исследовательской и лечебно-диагностической деятельности сектора клинического лабораторно-диагностического Всероссийского центра экстренной и радиационной медицины им. А.М.Никифорова МЧС России, лаборатории иммунофармакологии Государственного научно-исследовательского института особо чистых биопрепаратов ФМБА России, в научной работе и учебном процессе на кафедре военной токсикологии и медицинской защиты Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, на кафедре военной токсикологии и медицинской защиты и кафедре гражданской обороны Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова.

Результаты диссертационного исследования использовались при подготовке учебного пособия «Цитохимия нейтрофилов» (СПб.: ВМедА, 1999).

В процессе выполнения диссертационного исследования подано и принято к использованию 5 рационализаторских предложений.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены и обсуждены на III, IV и V съездах по радиационным исследованиям (Москва,

1997, 2001, 2006), Юбилейной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 200-летию ВМедА (Санкт-Петербург, 1998), Всероссийских научных конференциях «От materia medica к современным медицинским технологиям» (Санкт-Петербург, 1998), V научно-практической конференции «Радиационные поражения, перспективы развития средств индивидуальной защиты от ионизирующих излучений» (Санкт-Петербург, 2000), Российской научной конференции «Медицинские аспекты радиационной и химической безопасности» (Санкт-Петербург, 2001), Юбилейной научно-технической конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы биотехнологии и медицины» (Санкт-Петербург, 2001), I и III съездах военных врачей медико-профилактического профиля ВС РФ (Санкт-Петербург, 2002, 2006), III съезде по радиационным исследованиям (радиобиология и радиоэкология) (Киев, 2003), Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты» (Санкт-Петербург, 2004), международной научной конференции «The peculiarities of medical Support of armed forces in contemporary conditions» (Ереван, 2004), научно-практической конференции «Актуальные проблемы обитаемости и медицинского обеспечения личного состава ВМФ» (Санкт-Петербург, 2004), Всероссийской конференции «Механизмы стресса в экстремальных условиях» (Москва, 2004), международной научной конференции «Радиобиологические эффекты: риски, минимизация, прогноз» (Киев, 2005), Российской научной конференции с международным участием «Современные проблемы военной и экстремальной терапии» (Санкт-Петербург, 2005), XXX World Congress on Military Medicine (St. Petersburg, 2005), Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии» (Санкт-Петербург, 2008), международной научно-практической конференции «Актуальные психолого-педагогические и медико-социальные проблемы социума и безопасности жизнедеятельности» (Санкт-Петербург, 2009).

Связь диссертационного исследования с плановой тематикой научно-исследовательской работы учреждения. Исследование выполнялось в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ ВоеннЬ-медицинской академии им. С,М. Кирова (темы НИР № 4.01.030.п2 шифр «Беталейкин», № 4.01.034.п2 шифр «Протектор», № 03.02.012.0808/0292 шифр «Гемопоэз», № 02.02.02.0810/0192 шифр «Цитокин»).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 45 научных работ, том числе 12 статей в научных журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 228 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. В диссертации приведены 45 таблиц и 19 рисунков. Список литературы содержит 333 библиографических источника, из них 162 отечественных и 171 иностранных публикаций.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Оценку эффективности шгтерлейкина-ip в качестве средства профилактики и ранней терапии радиационных поражений проводили в экспериментах на мелких лабораторных животных (мышах и крысах) и в исследованиях с облучением проб периферической крови здоровых людей in vitro. В целом с использованием радиобиологических, гематологических, биохимических, иммунологических и цитохимических методов исследования было изучено более 80 клинико-лабораторных показателей.

Экспериментальные исследования выполнены на 2224 мышах-самцах (1852 белых беспородных, 124 линии BALB/c, 248 гибридах СВА х С57В1 первого поколения) массой 18-20 г и 180 белых беспородных крысах-самцах массой 180-220 г разводки питомника РАМН «Рапполово» (Ленинградская обл.). Содержание, питание, уход за животными и их выведение из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к Приказу Минздрава СССР от 12.08.1977 г. № 755).

Рентгеновское облучение мышей осуществляли на установке РУМ-17 при напряжении 180 кВ, силе тока 15 мА, фильтре 0,5 мм Си + 1,0 мм А1, фокусном расстоянии 70 см, мощности дозы 54 Р/мин, направлении облучения: спина-грудь. Внешнее острое у-облучение мышей осуществляли на установке ИГУР-1 с изотопом 13 Cs; мощность экспозиционной дозы составляла 130 Р/мин, кожно-фокусное расстояние 1 м, облучение двухстороннее боковое.

Внешнее пролонгированное (мощность дозы - 1 Р/мин, время экспозиции - 16 ч) у-облучение в дозе 10 Гр проводилось с помощью у-установки с источником 60Со, расположенном на расстоянии 161 см от поверхности тела лабораторных животных. Сочетанное внешнее и внутреннее радиационное воздействие проводили путем инкорпорации крысам Pu, 137Cs и ^Sr сразу после окончания внешнего пролонгированного у-облучения в дозе 8 Гр. Суммарная удельная активность вводившихся крысам радионуклидов позволила обеспечить формирование к 30 сут опыта дозы внутреннего облучения 2 Зв, а эффективная доза сочетанного облучения составила 10 Зв.

Моделирование фракционированного радиационного воздействия осуществляли на установке РУМ-17. Животных облучали один раз в сутки в дозе 0,5 Гр в течение 50 дней до набора суммарной дозы облучения 25 Гр.

Дозиметрический контроль условий облучения осуществлялся расчетным и ферросульфатным методом с последующей оценкой результатов на спектрофотометре. Кроме того, в ходе каждого облучения животных проводилась физическая дозиметрия с помощью индивидуального дозиметра ИД-11 с последующей оценкой показаний прибора на аппарате ГО-32.

Наблюдение за животными, подвергнутыми острому рентгеновскому и у-облучению, пролонгированному у-облучению, сочетанному внешнему и

внутреннему облучению, фракционированному облучению осуществляли в течение 30 сут после окончания радиационного воздействия.

В работе использовался стандартный фармакопейный препарат "Беталейкин" - ампулированный лиофилизированный рекомбинантный HJl-lß человека с добавлением в качестве стабилизатора человеческого сывороточного альбумина, созданный и выпускаемый Государственным научно-исследовательским институтом особо чистых биопрепаратов (г. Санкт-Петербург). Рекомбинантный интерлейкин-lß, представляющий собой точную копию эндогенного ИЛ-lß человека, прошел все требуемые Фармакологическим комитетом МЗ РФ испытания и приказом Министра здравоохранения РФ № 51 от 18.02.1997 г. разрешен к клиническому применению. Использованная в работе серия препарата прошла биотест и по своей биологической активности была идентична предыдущим сериям.

Мышам препарат, разведенный на физиологическом растворе в объеме 0,2 мл, вводился внутрибрюшинно в дозе 50 мкг/кг (1 мкг/особь) однократно. Крысам препарат, разведенный в 0,2 мл физиологического раствора, вводился внутрибрюшинно в дозе 1 мкг/кг (200 нг/особь) однократно. Животные контрольных групп вместо препарата ИЛ-lß получали физиологический раствор в том же объеме и в те же сроки, что и животные опытных групп.

Оценку радиомодифицирующих свойств рекомбинантного ИЛ-lß проводили по разработанной нами схеме, которая включала последовательное изучение критериев выживаемости облученных животных, параметров радиочувствительности гемопоэтических клеток костного мозга, количества клеток циркулирующего пула периферической крови, показателей функционально-метаболического статуса нейтрофильных гранулоцитов крови.

Изучение выживаемости и средней продолжительности жизни экспериментальных животных проводили общепринятыми методами. По полученным результатам оценки выживаемости при дозах СД50/зо рассчитывали фактор изменения дозы (ФИД) и процент защиты препарата интерлейкина-lß.

Оценку числа и функциональной активности стволовых кроветворных клеток осуществляли методами эндогенного и экзогенного колониеобразования [Till J.E., McCulloch Е.А., 1961] по количеству колоний, выросших на селезенках мышей на 9 сут после облучения. Общее количество лейкоцитов определяли меланжерным методом с последующим подсчетом клеток в камере Горяева. Для исследования лейкоцитарной формулы применяли способ быстрой окраски мазков крови краской Романовского [Альтгаузен А.Я., 1964]. Суммарное цитохимическое выявление катионных белков в нейтрофилах проводили с использованием лизосомально-катионного теста [Пигаревский В.Е., 1988]. Определение уровня липидов осуществляли с использованием Судана черного Б [Sheehan H.L., Storey G.W., 1947]. Оценку щелочной фосфатазы проводили методом азосочетания [Kaplow L.S., 1955]. Цитохимическое выявление миелопероксвдазы осуществляли методом R.C. Graham, M.J. Karnovsky (1966).

Кроме того, в исследовании приняли участие 6 практически здоровых мужчин в возрасте 27-32 года, пробы периферической крови которых использовались для изучения реакций лейкоцитов при облучении in vitro после введения им препарата рекомбинантного интерлейкина-ip. Исследования на здоровых людях выполнялись с информированного согласия испытуемых и соответствовали этическим нормам Хельсинской декларации 2000 года. Фармакопейный препарат ИЛ-ip «Беталейкин», предварительно разведенный физиологическим раствором, вводился людям внутривенно капельно в дозе 5 нг/кг в течение 3-х часов. Оценку реакций лейкоцитов у испытуемых проводили до введения препарата, через 3,6 и 24 ч после начала введения ИЛ-10.

Облучение проб периферической крови людей in vitro проводилось на установке РУМ-17 при напряжении 180 кВ, силе тока 15 мА, фильтре 0,5 мм Си + 1,0 мм А1, фокусном расстоянии 70 см, мощности дозы 35,5 Р/мин. Лейкоциты периферической крови обследованных людей исследовали до облучения и непосредственно после радиационного воздействия. Дозиметрический контроль осуществляли расчетным методом и с помощью дозиметра ИД-11.

Состояние здоровья добровольцев оценивали по данным анамнеза (отсутствие острых и хронических заболеваний), субъективным показателям (отсутствию жалоб на состояние здоровья), в ходе физикального клинического (термометрия, показатели артериального давления, пульса, тоны сердца, частота дыхания и др.) и лабораторного исследования. Общеклиническое лабораторное исследование крови включало определение общего количества лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов и ретикулоцитов, изучение лейкоцитарной формулы, оценку абсолютного и относительного содержания лимфоцитов и гранулоцитов, выявление уровня гемоглобина, гематокрита и СОЭ. С помощью биохимического анализатора оценивали содержание в крови общего белка, альбуминов, глобулинов, глюкозы, билирубина, активность АЛТ, ACT, ЛДГ, ЩФ, тимоловую пробу, уровень мочевины, креатинина, холестерина, триглицеридов, бета-липопротеидов, С-реактивного белка, протромбина, время рекальцификации, каолиновое время, индекс коагуляции, этаноловый тест, фибриноген, толерантность к гепарину, тромботест.

Иммунологические исследования включали оценку количества и функциональной активности иммунокомпетентных клеток. Абсолютное число и относительное содержание CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+, CD25+, CD95+ и HLA II оценивали с помощью соответствующих моноклональных антител методом проточной цитометрии [Summer Н., Abraham D., 1997]. Пролиферативную активность лимфоцитов изучали в реакции бластгрансформации путем определения ответа на фитогемагглютинин (ФГА)

в дозах 2,5 мкг/мл или 15,0 мкг/мл и митоген лаконоса (PWM) в дозе 5,0 мкг/мл [Кетлинский С.А., Калинина Н.М., 1998]. Способность мононуклеаров синтезировать и продуцировать интерлейкин-ip, интерлейкин-4, фактор некроза опухолей-а и интерферон-у определяли по F.H. Krouwels с соавт. (1997).

Эффекторные свойства нейтрофильных гранулоцитов оценивались по спонтанной и индуцированной форболмиристатацетатом (ФМА) адгезивной способности [Кетлинский С.А., Калинина Н.М., 1998], а также по спонтанной и направленной миграционной активности под агарозой к N-формил-лейцин-метионил-пролину и к интерлейкину-8 [Nelson R.D., 1975]. Функциональный потенциал нейтрофилов изучали в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ-тест), который проводился в спонтанном и стимулированном зимозаном вариантах [Rook G.A. et al., 1985]. Функциональную активность нейтрофилов оценивали хемшпоминесцентным методом [Muto S., 1986]. Способность нейтрофилов к завершенному фагоцитозу изучали в тесте с дрожжами, определяя число поглощающих дрожжи клеток и фагоцитарный индекс [Root R.K. et al., 1975]. Кроме того, в нейтрофилах периферической крови цитохимическими методами определяли содержание катионных белков [Пигаревский В.Е., 1988], липвдов [Sheehan H.L., Storey G.W., 1947], миелопероксидазы [Меньшиков В.В. и др., 1987], щелочной фосфатазы [Kaplow L.S., 1955].

Полученные в ходе исследований данные подвергали обработке методами вариационной статистики с использованием пакета программ «Statistica» с расчетом среднего значения, ошибки средней и среднего квадратического отклонения. Для оценки значимости межгрупповых различий по критериям выживаемости пользовались точным методом Фишера. Оценку различий средних значений в экспериментах с большим количеством лабораторных животных и нормальным распределением средних величин проводили с использованием t-критерия Сгьюдента. Оценку различий данных, полученных при анализе выборок малого объема, проводили непараметрическими методами с использованием критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Обработка результатов, представленных в относительных единицах, осуществлялась с использованием таблиц B.C. Генеса (1967), основанных на точном методе Фишера для четырехпольной таблицы. Вероятность р<0,05 и выше считали достаточной для вывода о статистической достоверности различий полученных данных.

Данные в таблицах представлены в виде X ± тх. Различия по t-критерию Стьюдента обозначены звездочкой (*), различия по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни - решеткой (#).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние интерлейкина-1р на выживаемость и среднюю продолжительность жизни экспериментальных животных при различных вариантах радиационных воздействий

Целью первого раздела исследования явилась экспериментальная оценка радиозащитной эффективности рекомбинантного интерлейкина-1Р (ИЛ-1Р) при профилактическом и раннем лечебном применении для различных вариантов внешнего, внутреннего и сочетанного радиационного воздействия. Для реализации цели были проведены экспериментальные исследования на мышах и крысах, в ходе которых изучалось влияние ИЛ-1Р на показатели выживаемости и средней продолжительности жизни облученных лабораторных животных.

Определение оптимальных сроков профилактического и лечебного применения ИЛ-1Р для достижения максимального радиозащитного эффекта препарата проводилось в экспериментах на 120 белых мышах-самцах, подвергнутых внешнему у-облучению в дозе 6 Гр с мощностью дозы 130 Р/мин.

В результате проведенных исследований было установлено, что ИЛ-1Р при введении за 24 ч до облучения и через 1 ч после радиационного воздействия обладает выраженным радиозащитным эффектом, что позволяет рассматривать его в качестве нового лечебно-профилактического средства обеспечения безопасности при чрезвычайных ситуациях радиационного характера (табл. 1).

Таблица 1

Зависимость выраженности радиозащитного эффекта интерлейкина-1р, оцененного по показателям выживаемости (%) и средней продолжительности жизни (сут) белых беспородных мышей-самцов, подвергнутых острому однократному у-облучению в

Условия эксперимента Сроки введения ИЛ-1(3, ч Выживаемость, % СПЖ, сут

Облучение на фоне применения ИЛ-1Р -72 60 ± 16 14,1 ±1,6*

-24 80 ± 13 * 14,6 ±1,5*

+ 1 70 ± 16* 13,0 ±0,9*

+ 24 40 ±17 10,2 ±1,2

+ 72 10 ±5 9,1 ±0,9

Контроль (облучение) 30 ±15 8,8 ± 1,3

* - различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с контролем (облучением)

Так, однократное внутрибрюшинное введение ИЛ-1Р за 72 ч до облучения увеличивало выживаемость мышей практически в 2 раза.

Наибольшая эффективность ИЛ-1Р, как средства профилактики острого радиационного поражения, отмечена при его введении за 24 ч до облучения. В этом случае удавалось обеспечить выживаемость 80 % животных, облученных в дозе СД70/30. а «процент защиты» составил 50% по сравнению с контрольной группой. Применение препарата в качестве средства профилактики радиационного поражения приводило и к увеличению средней продолжительности жизни погибших мышей, в среднем на 5,3 - 5,8 сут.

Применение ИЛ-1Д через 1 ч после облучения также приводило к повышению выживаемости на 40 % и увеличению на 4,2 сут средней продолжительности жизни облученных животных. Введение препарата через 24 ч после облучения обеспечивало увеличение выживаемости облученных животных лишь на 10 %, а его инъекция через 72 ч после облучения, напротив, приводила к снижению выживаемости животных на 20 %.

В результате исследований, выполненных на следующем этапе, было установлено, что лечебно-профилактическая эффективность ИЛ-1р, оцененная по критериям выживаемости облученных животных, проявлялась при различных вариантах радиационного воздействия: остром и пролонгированном внешнем облучении, при сочетанном внешнем и внутреннем облучении от инкорпорации радионуклидов, характерных для раннего периода радиационной аварии.

Наибольшую радиозащитную эффективность препарат проявлял в условиях острого у-облучения с мощностью дозы 130 р/мин (рис. 1).

■Контроль (облучение) СИЛ-1 за 24 ч до облучения И ИЛ-1 через 1 ч после облучения

120

5,5 6 6,5 7 7,5 8

Доза облучения, Гр

Рис. 1. Выживаемость белых беспородных мышей-самцов, подвергнутых острому у-облучению с мощностью дозы 130 Р/мин, при профилактическом (за 24 ч) и лечебном (через I ч) применении интерлейкина-1(3 в дозе 50 мкг/кг, % (п = 10 в каждой группе)

* - различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с контролем (облучением)

Как видно из данных, представленных на рисунке 1, после облучения в дозе 5,5 Гр выживаемость животных при профилактическом применении ИЛ-1р увеличивалась на 16,7 %, при его использовании в качестве средства ранней терапии радиационных поражений - на 5,6 %. Прирост выживаемости облученных в дозе 6,0 Гр животных составил 27,8 % при применении ИЛ-10 в качестве радиопротектора и 5,5 % при его использовании с лечебной целью.

Радиопротекторный эффект препарата при облучении мышей в дозах 6,5; 7,0 и 7,5 Гр проявлялся в увеличении выживаемости более чем на 20 % (рис. 1). Лечебная эффективность ИЛ-1Р была особенно высока при радиационном воздействии в дозах СД70.9оло: выживаемость животных при облучении в дозе 7,0 Гр увеличивалась в 2 раза, а при облучении в дозе 7,5 Гр - в 4 раза. Расчетное значение ФИД препарата при его применении в качестве радиопротектора составило 1,18, а при использовании ИЛ-1Р в качестве средства ранней патогенетической терапии радиационных поражений — 1,16.

Рекомбинантный ИЛ-1Р обладал противолучевыми свойствами при профилактическом и при раннем лечебном применении и в условиях однократного рентгеновского воздействия с мощностью дозы 54 Р/мин.

НКонтроль (облучение) ПИЛ-1 за 24 ч до облучения 0ИЛ-1 через 1 ч после облучения

5,5 6,5 7,5 8,5

Доза облучения, Гр

Рис. 2. Выживаемость белых беспородных мышей-самцов, подвергнутых острому рентгеновскому облучению с мощностью дозы 54 Р/мин, при профилактическом (за 24 ч) и раннем лечебном (через 1 ч) применении интерлейкина-1р в дозе 50 мкг/кг, % (п = 20 в каждой опытной группе, п = 40 в каждой контрольной группе)

* - различил достоверны (р < 0,05) по сравнению с контролем (облучением)

Как видно из данных, представленных на рисунке 2, при облучении в дозе 5,5 Гр гибель животных контрольной группы составила 80 %, а применение ИЛ-1Р с профилактическими или лечебными целями позволяло увеличить выживаемость облученных животных до 90 %. Введение препарата за 24 ч до облучения в дозе 6,5 Гр увеличивало выживаемость мышей на 17,5

%, а его использование через 1 ч после радиационного воздействия защищало от лучевой гибели на 7,5 % больше животных, чем в контроле. При облучении в дозе 7,5 Гр профилактическое применение препарата позволяло спасти от лучевой гибели почти в 3 раза больше животных, а эффективность его лечебного использования проявлялась в 2-х кратном увеличении выживаемости. При облучении в дозе 8,5 Гр выживаемость в контроле составила 2,5 %, в то время как при использовании ИЛ-1(5 за 24 ч до радиационного воздействия - в 8 раз больше, а при его применении через 1 ч после облучения - в б раз больше, чем в контроле. Расчетное значение ФИД при дозах СД50/30 составило 1,20 для радиопротекторного эффекта препарата и 1,18 для его лечебной активности.

Результаты оценки радиозащитной эффективности ИЛ-10 в условиях пролонгированного у-облучения представлены в таблице 2.

Таблица 2

Выживаемость (%) и средняя продолжительность жизни (сут) белых беспородных крыс, подвергнутых внешнему у-облучению в дозе 10 Гр с мощностью дозы 1 Р/мин, при профилактическом (за 24 ч) и раннем лечебном (через 1 ч) применении

Показатель Группы

контроль (облучение) ИЛ-1 за 24 ч до облучения ИЛ-1 через 1 ч после облучения

Выживаемость, % 30 ±10 90 ±20* 80 ±20*

СПЖ, сут 16,0 ±1,6 25,0 ± 1,2* 27,5 ±1,2*

* - различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с контролем (облучением)

Установлено, что в условиях пролонгированного у-облучения с мощностью дозы 1 Р/мин применение ИЛ-1(3 за 24 часа до облучения позволяет увеличить выживаемость облученных крыс в 3 раза, а при использовании препарата через 1 ч после лучевого воздействия - в 2,6 раза. Кроме того, при профилактическом применении ИЛ-1(3 средняя продолжительность жизни погибших животных возрастала на 8,4 сут, а при лечебном - на 10,9 сут.

Как видно из данных, представленных на рисунке 3, в условиях сочетанного радиационного воздействия гибель животных контрольной группы составила 70 %, а средняя продолжительность жизни погибших крыс 19,6 ± 2,1 сут. Профилактическое применение ИЛ-1(3 на 40 % снижало показатели смертности облученных животных и на 8 сут увеличивало среднюю продолжительность жизни погибших от радиационной травмы крыс. Еще более эффективным было использование ИЛ-10 в качестве средства ранней терапии: выживаемость облученных животных увеличивалась на 50 %, а средняя продолжительность жизни погибших особей возрастала на 8,4 сут.

Рис. 3. Выживаемость (%) и средняя продолжительность жизни (сут) белых беспородных крыс-самцов, подвергнутых сочетанному внешнему и внутреннему облучению в дозе 10 Зв, при профилактическом (за 24 ч) и раннем лечебном (через 1 ч) применении шгтерлейкина-1р в дозе 1 мкг/кг (п = 10 в каждой группе) * - различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с контролем (облучением)

Таким образом, данные экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что рекомбинантный ИЛ-1(3 может рассматриваться в качестве эффективного средства профилактики и ранней терапии лучевых поражений, развивающихся при различных вариантах радиационного воздействия (внешнее острое и пролонгированное, сочетанное внешнее и внутреннее облучение).

Влияние интерлейкина-1р на показатели костномозгового кроветворения у мышей при внешнем у- и рентгеновском облучении

На данном этапе исследования в методиках эндогенного и экзогенного колониеобразования изучалось влияние профилактического и раннего лечебного применения ИЛ-1(3 на число стволовых кроветворных клеток, определяющих возможность восстановления гемопоэза после облучения.

Эксперимент проводили на 400 белых беспородных мышах-самцах, 200 из которых относились к опытным группам (профилактическое и лечебное применение ИЛ-1(3) и 200 - к контрольным группам (облучение без применения исследуемого препарата). Животных опытных и контрольных групп подвергали внешнему рентгеновскому облучению на установке РУМ-17 в дозах 5,5 (п = 10), 6,0 (п = 10), 6,5 (п = 12), 7,0 (п = 14), 7,5 (п = 16), 8,0 (п = 18) и 8,5 Гр (п = 20).

В результате проведенных исследований установлено, что рекомбинантный ИЛ-1(3 обладает радиопротекторной и ранней терапевтической активностью в отношении клеток-предшественников гемопоэза у облученных мышей (табл. 3).

Таблица 3

Количество эндогенных 9-сугочных колониеобразующих единиц на селезенке белых беспородных мышей-самцов, подвергнутых внешнему однократному рентгеновскому облучению, при профилактическом (за 24 ч) и лечебном (через 1 ч)

Доза облучения, Гр Контроль (облучение) ИЛ-1(}за24ч до облучения ИЛ-10 через 1 ч после облучения

5,5 7,3 ± 1,7 10,8 ±2,4 11,0 ± 1,6

6,0 5,8 ±1,1 6,0 ±1,8 8,3 ±1,1

6,5 4,6 ±0,9 5,5 ±0,8 6,7 ± 0,8

7,0 3,1 ±0,7 5,3 ± 1,2 * 6,0 ±0,7*

7,5 1,8 ±0,6 3,2 ±0,7* 5,6 ±1,1 *

8,0 0,8 ±0,5 2,2 ±1,2* 3,8 ±0,9*

8,5 0 2,0 ±1,0* 1,7 ±0,6*

* - различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с контролем (облучением)

В условиях профилактического (за 24 ч до радиационного воздействия) применения при всех изученных дозах облучения рекомбинантный ИЛ-1(5 предотвращал снижение количества эндогенных КОЕ-С9 у облученных мышей. Статистически значимых отличий по сравнению с контролем (радиационным воздействием без предварительного введения рекомбинангного ИЛ-1(5) данный показатель достигал при облучении животных в дозах 7,0 и 7,5 Гр (СДтмо/зо). При действии очень высоких доз -8,5 Гр (СД90-100/30) - только предварительное внутрибрюшинное введение препарата позволяло сохранить колониеобразующую активность клеток на селезенках облученных мышей.

Высокую противолучевую активность по показателям эндогенного колониеобразования ИЛ-10 проявлял и при его лечебном применении через 1 ч после радиационного воздействия (табл. 3). И в этом случае при всех дозах облучения рекомбинантный ИЛ-10 предотвращал снижение числа эндогенных КОЁ-С9 у облученных мышей. Так, число КОЕ-С9 при лечебном применении препарата превышало аналогичные значения группы сравнения при облучении в дозе 7,0 Гр почти в 1,5 раза, при облучении в дозе 7,5 Гр - в 2,6 раза, при облучении в дозе 8,0 Гр - в 4,75 раза. Следует также отметить, что, как и в случае профилактического использования ИЛ-10, только его лечебное применение позволяло обнаружить рост эндогенных колоний на селезенках мышей, подвергнутых радиационному воздействию в дозе 8,5 Гр.

Влияние профилактического (за 24 ч до облучения) введения рекомбинангного ИЛ-10 в дозе 50 мкг/кг на количество КОЕ-С9 у облученных мышей изучали и в методике экзогенного колониеобразования. Эксперимент проводился на мышах различных линий: мышах линии ВАЬВ/с, обладающих высокой радиочувствительностью, белых беспородных мышах и мышах-гибридах первого поколения СВА х С57В1, являющихся радиорезистентными.

Результаты проведенного исследования представлены в таблице 4.

Число миелокариоцитов и количество экзогенных 9-суточных колониеобразующих единиц на селезенке» внешнему однократному рентгеновскому облучению, при профилактическом (за 24 ч) применении инте] мкг/кг (п = 20 в каждой группе)__

Лабораторные животные Показатель Условия эксперимента

без облучения контроль (облучение) ИЛ-ф за 24 ч до облучения

Мыши линии ВАЬВ/с число миелокариоцитов, х 106/бедро 18,5 ± 1,6 18,2 ± 1,4 18,5 ± 1,2

число КОЕ-С9 в 1 бедре 80 ±8 11±1 32 ± 3 *

число КОЕ-С9 на 10б миелокариоцитов 4,1 ±0,5 0,6 ± 0,2 1,7 ± 0,3 *

Белые беспородные мыши число миелокариоцитов, х 106/бедро 18,0 ± 1,5 18,4 ± 1,4 20,0 ± 1,2

число КОЕ-С? в 1 бедре 220 ± 56 80 ±32 164 ±29*

число КОЕ-С9 на 106 миелокариоцитов 24,4 ±6,1 8,7 ±3,2 15,4 ±3,0*

Мыши-гибриды первого поколения СВАхС57В1 число миелокариоцитов, х 106/бедро 21,0 ± 1,8 20,5 ± 1,4 20,0 ± 1,9

число КОЕ-С, в 1 бедре 358 ±19 38 ±8 107 ± 12 *

число КОЕ-С, на 106 миелокариоцитов 18,0 ±1,1 1,2 ±0,2 5,2 ± 0,3 *

* - различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с контролем (облучением) ** - различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с уровнем до облучения

Установлено, что радиационное воздействие вызывало существенное снижение количества колоний, выросших на селезенках облученных животных: до 15 % от исходного уровня у мышей линии ВАЬВ/с, до 36 % - у белых беспородных и до 10 % - у гибридов Р] (СВА х С57В1).

Профилактическое (за 24 ч до облучения) внутрибрюшинное введение рекомбинантного ИЛ-10 в дозе 50 мкг/кг позволяло в значительной степени предотвратить постлучевое снижение числа экзогенных КОЕ-С, у облученных мышей. При этом, радиозащитнын эффект препарата в отношении клеток-предшественников проявлялся вне зависимости от радиочувствительности различных линий мышей. Число колоний на селезенках облученных животных под влиянием препарата в среднем увеличивалось в 2-3 раза. Так, у мышей линии ВАЬВ/с, получавших ИЛ-10 в качестве радиопротектора, количество колоний, по сравнению с незащищенными облученными животными, выросло в 2,8 раза и составило 42 % от уровня облученного контроля. У белых беспородных мышей число колоний выросло в 1,8 раз (до 63 % от уровня облученного контроля), у мышей-гибридов - в 4,3 раза (до 29 % от уровня облученного контроля).

Таким образом, результаты исследований показали, что рекомбинантный ИЛ-10 влияет на миграционную и пролиферативную активность ранних предшественников гемопоэза, увеличивая ее. Применение данного препарата за 24 ч до облучения или через 1 ч после радиационного воздействия способствует сохранению жизнеспособности значительного числа кроветворных клеток-предшественников гемопоэза, о чем свидетельствуют данные, полученные при исследовании противолучевой эффективности ИЛ-10 в методиках эндогенного и экзогенного колониеобразования.

Влияние интерлейкина-10 на количественный состав лейкоцитов периферической крови облученных мышей и крыс

На данном этапе исследования в экспериментах на 120 белых беспородных мышах-самцах проводили изучение влияния ИЛ-10 на пострадиационную динамику содержания лейкоцитов в периферической крови. Животных подвергали внешнему относительно равномерному однократному у-облучению в дозе 6 Гр (СД7о/зо) с мощностью дозы 130 Р/мин.

Как видно из данных, представленных в таблице 5, острое у-облучение в дозе 6 Гр вызывало у мышей развитие панцитопении с выраженными проявлениями миелодепрессии. Введение ИЛ-10 животным до облучения существенно не влияло на темп развития постлучевой лейкопении в 1-е сутки, однако уже к 3-м суткам после облучения у мышей, получавших препарат, общее число лейкоцитов в периферической крови сохранялось на более высоком уровне по сравнению с контролем. Начало восстановления числа лейкоцитов у леченых животных отмечалось через 8 сут после облучения, тогда как в контроле этот процесс развивался лишь к 12 сут (табл. 5).

Таблица 5

Динамика общего числа лейкоцитов в периферической крови белых беспородных мышей, подвергнутых острому у-облучению в дозе 6 Гр при профилактическом (за 24 ч) применении интерлейкина-!^ в дозе 50 мкг/кг,х 109/л (п= 10 в каждой группе)

Условия эксперимента С роки исследования, сут

до облучения 1 3 8 12 20

Контроль (облучение) 7,5 ± 0,5 1,2 ±0,2 0,3 ± 0,2 0,4 ±0,1 0,7 ±0,3 7,0 ±0,5

ИЛ-1 за 24 ч до облучения 9,3 ± 0,4 * 1,3 ± 0,2 0,8 ±0,1* 1,5± 0,2* 1,8± 0,2* 7,6 ± 0,3

* - различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с контролем (облучением)

Таким образом, под влиянием ИЛ-10 выраженность пострадиационной лейкопении была меньше, чем у облученного контроля, а также наблюдалось более быстрое восстановление числа лейкоцитов в периферической крови.

Оценка влияния ИЛ-1(5 на количественный состав лейкоцитов периферической крови крыс проводилась при пролонгированном у-облучении лучами Со-60 в дозе 10 Гр (мощность дозы облучения составила 1 Р/мин). Обследование экспериментальных животных опытных и контрольных групп с оценкой гематологических показателей проводили до облучения (дважды), а также через 3 сут и далее каждые 5-е сутки в течение 30 сут после облучения.

Как видно из данных, представленных в таблице 6, внешнее облучение в дозе 10 Гр с мощностью дозы 1 Р/мин приводило к резкому снижению общего числа лейкоцитов в периферической крови крыс в ранние сроки после радиационного воздействия.

Таблица 6

Динамика общего числа лейкоцитов в периферической крови белых беспородных крыс, подвергшихся пролонгированному у-облучении в дозе 10 Гр, при профилактическом (за 24 ч) и лечебном (через 1 ч) применении интерлейкина-113 в дозе 1 мкг/кг, х 109/л (п = 10 в каждой группе)_

Сроки исследования, сут Группы

контроль (облучение) ИЛ-1 за 24 ч до облучения ИЛ-1 через 1 ч после облучения

До обл\'чения 10,8 ± 0,2 11,3 ±0,3 11,4 ±0,3

3 1,9 ±0,1 4,6 ± 0,3 * 2,0 ±0,1

5 1,3 ±0,1 1,9 ±0,1 * 2,4 ±0,1 *

7 3,5 ± 0,6 3,2 ± 0,2 2,9 ± 0,3

12 5,1 ±0,8 6,2 ± 0,7 5,8 ± 0,7

17 15,7 ±0,6 11,6 ±0,5 * 9,8 ±0,9 *

22 17,6 ± 1,7 12,7 ±0,6* 11,6 ±0,9*

30 10,6 ±0,9 11,2 ±0,6 13,0 ±2,1

* - различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с контролем (облучением)

Профилактическое введение ИЛ-1(5 за 24 ч до радиационного воздействия уменьшало глубину постлучевого снижения общего числа лейкоцитов в периферической крови крыс в ранние сроки после облучения. Так, через 3 сут после облучения общее число лейкоцитов у животных, получивших ИЛ-составляло 40 % от исходного уровня, что почти в 2,5 раза больше, чем у незащищенных крыс. Через 5 сут уровень лейкоцитов у этих животных был лишь 16 % от исходных значений, но все равно почти в 1,5 раза превышал значения аналогичного показателя в контрольной группе. Восстановление числа лейкоцитов до нормы у животных, защищенных предварительным введением ИЛ-1(3, происходило к 17 сут эксперимента, а развития лейкоцитоза у этих крыс в течение срока наблюдения не отмечалось.

Позитивное влияние на содержание лейкоцитов в периферической крови облученных крыс препарат оказывал и при его использовании через 1 ч после окончания радиационного воздействия. Так, лечебное применение ИЛ-1{3 предотвращало снижение уровня лейкоцитов в ранние сроки после радиационного воздействия: через 5 сут после облучения значения этого показателя у леченых крыс были на 86 % выше, чем у нелеченых животных. Восстановление числа лейкоцитов происходило, начиная с 17 сут наблюдения, при этом так же, как и в случае профилактического применения препарата, отсутствовала фаза лейкоцитоза, развивавшегося у животных контрольной группы (только облучение) на 17-22 сут опыта.

Динамика содержания нейтрофилов и лимфоцитов в периферической крови облученных животных, получавших с профилактической или лечебной целью ИЛ-ф, практически полностью повторяла изменения, регистрировавшиеся при изучении общего числа лейкоцитов.

Следует также отметить, что более эффективно препарат влиял на количество нейтрофилов. Так, введение ИЛ-1 [5 не допускало их резкого постлучевого снижения в ранние сроки после облучения: через 3 сут уровень нейтрофилов превышал показатели контрольной группы более чем в 3 раза в случае профилактического применения препарата и в 2 раза при его лечебном использовании. Восстановление количества нейтрофилов при применении ИЛ-1(5 в качестве средства ранней терапии лучевых поражений начиналось уже с 5 сут наблюдения, а к 12 сут препарат, введенный за 24 ч до облучения, не вызывал нейтрофилёза, в отличие от данных без введения ИЛ -1р.

Изучение влияния на количество клеток крови профилактического и лечебного применения ИЛ-1|3 в условиях сочетанного внешнего и внутреннего облучения в дозе 10 Зв проводили на 30 белых беспородных крысах-самцах.

Установлено, что максимальное падение уровня лейкоцитов (до 22 % от значений необлученных животных) регистрировалось на 5 сут после радиационного воздействия. Через 7 сут после облучения наблюдался незначительный абортивный подъем, а через 12 сут количество лейкоцитов вновь снижалось. Восстановление числа лейкоцитов начиналось с 17 сут, а нормальных (на уровне биологического контроля) значений этот показатель достигал через 22-30 сут после облучения (табл. 7).

Таблица 7

Динамика общего числа лейкоцитов периферической крови белых беспородных крыс, подвергнутых сочетанному внешнему и внутреннему облучению в дозе 10 Зв, при профилактическом (за 24 ч) и лечебном (через 1 ч) применении интерлейкина-1{3 в дозе 1 мкг/кг, х 109/л (п = 10 в каждой группе)

Сроки исследования, СУТ Группы

контроль (облучение) ИЛ-1 за 24 ч до облучения ИЛ-1 через 1 ч после облучения

До облучения 11,3 ±0,4 10,2 ± 0,3 10,5 ± 0,3

3 3,1 ±0,2 2,4 ±0,3 2,1 ±0,4

5 " 2,5 ± 0,3 4,9 ±0,3 * 5,2 ±0,5 *

7 4,3 ±0,4 4,2 ±0,2 3,8 ±0,2

12 3,5 ± 0,2 7,0 ±0,2* 5,7 ± 0,5 *

17 9,2 ± 0,6 11,2 ±0,5* 9,3 ± 0,4

22 10,5 ±0,4 12,0 ±0,6 12,3 ±0,3*

30 10,6 ±0,1 11,2 ±0,7 11,6 ±0,5

* - различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с контролем (облучением)

Рекомбинантный ИЛ-10, введенный за 24 ч до или через 1 ч после сочетанного радиационного воздействия, снижал выраженность лейкопении на 5 сут наблюдения. Применение препарата как с профилактической, так и с лечебной целью способствовало также ускорению восстановления уровня лейкоцитов в периферической крови облученных животных. Значимые отличия этого показателя, по сравнению с контролем, регистрировались уже на 12 и 17 сут эксперимента, а, начиная с 22 сут, уровень лейкоцитов в крови получавших препарат крыс незначительно превышал значения, зарегистрированные у этих же крыс до радиационного воздействия.

> 'контроль(облучение) —&—ИЛоблучение - А - облучениеИЛ (

о I о.

X 1

о

о

б„

® о

ЛО облуЧСНИЯ

5 7 12 17

сроки исследования, сут

22 30

Рис. 4 Динамика абсолютного количества нейтрофилов в периферической крови белых беспородных крыс, подвергнутых сочетанному внешнему и внутреннему облучению в дозе 10 Зв. при профилактическом (за 24 ч) и лечебном (через 1 ч) применении интерлейкина-1 (3 в дозе 1 мкг/кг. х 109/л (п = 10 в каждой группе)

* - различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с контролем (облучением)

Аналогичные закономерности были обнаружены и при оценке влияния профилактического или раннего лечебного применения ИЛ-10 на динамику абсолютного количества нейтрофилов (рис. 4) и лимфоцитов у подвергшихся сочетанному облучению животных.

В ходе следующего этапа препарат рекомбинантного ИЛ-10 использовался для коррекции и восстановления гематологических показателей, развивающихся при фракционированном облучении.

с

о> О

□ контроль облучение ■ облучение с ИЛ-1 бета

20,5 22,5

Суммарная доза, Гр

Рис. 5. Количество лейкоцитов у крыс при фракционированном радиационном воздействии при применении интерлейкина-1р при рентгеновском фракционированном облучении в дозе 25 Гр (п = 10 в каждой группе), х 109/л * - различия достоверны (р <0,05) по сравнению с контролем (облучением)

Как видно из данных, представленных на рисунке 5, пятикратное внутрибрюшинное введение ИЛ-10 по 1 мкг/кг в сутки в ходе продолжающегося фракционированного облучения предотвращает дальнейшее снижение количественных показателей белой крови, а также ускоряет их восстановление после окончания радиационного воздействия.

После завершения фракционированного облучения в суммарной дозе 25,0 Гр при курсовом применении ИЛ-10 (внутрибрюшинно по 1 мкг/кг в течение 5 сут) восстановление общего числа лейкоцитов, абсолютного количества нейтрофилов и лимфоцитов происходят в более ранние сроки, чем у нелеченных животных. Так, по сравнению с показателями нелеченых крыс у животных, получавших препарат, уже через 1 сут после начала терапии общее число лейкоцитов было более чем в 2 раза выше, абсолютное количество нейтрофилов - более чем в 3 раза выше, а число лимфоцитов - в 1,5 раза выше (р<0,05). Через 5 и 10 сут после первой инъекции препарата сохранялась тенденция к более высокому уровню общего количества лейкоцитов и абсолютного содержания лимфоцитов, а число нейтрофилов достоверно

(р<0,05) превышало значения аналогичного показателя нелеченных животных. Результаты этого раздела работы представлены на рисунке б.

13 контроль облучение В облучение с ИЛ-1 бета

с

X

До введения

5

10

Сроки исследования после введения ИЛ-1, сут

Рис. 6. Количество лейкоцитов у крыс при применении интерлейкина-1|3 после окончания фракционированного рентгеновского облучения в суммарной дозе 25 Гр (п = 10 в каждой группе), х 109/л

* - различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с контролем (облучением)

Результаты исследований, проведенных на этом этапе, показали, что в условиях внешнего острого и пролонгированного, а также и сочетанного внешнего и внутреннего облучения рекомбинантный ИЛ-1 {5, введенный за 24 ч до или через 1 ч после радиационного воздействия, способствует предотвращению ранней постлучевой лейкопении (развивающейся за счет снижения числа и нейтрофилов, и лимфоцитов) и ускоряет восстановление количества клеток белой крови в поздние сроки после облучения. А использованные схемы применения препарата при фракционированном облучении, в высоких суммарных дозах, способствуют более быстрому и полному восстановлению гематологических показателей у крыс.

Влияние интерлейкина-1р на показатели функционально-метаболического статуса нейтрофилов периферической крови облученных крыс

Наряду с предотвращением пострадиационных изменений количества клеток белой крови ИЛ-1(3, введенный за 24 ч до или через 1 ч после внешнего пролонгированного у-облучения в дозе 10 Гр, оказывал позитивное влияние и на качественное состояние нейтрофилов, оцененное по содержанию в этих

клетках лизосомальных катионных белков, активности миелопероксидазы (МПО) и щелочной фосфатазы (ЩФ).

Внешнее пролонгированное облучение в дозе 10 Гр вызывало уменьшение содержания катионных белков в нейтрофилах периферической крови крыс, особенно выраженное в промежуток с 3 по 17 сут после лучевого воздействия (табл. 8). Наибольшее падение количества этих биоцидных протеинов зарегистрировано через 5 сут после облучения.

Таблица 8

Динамика содержания катионных белков в нейтрофилах периферической крови белых беспородных крыс, подвергнутых внешнему пролонгированному у-облучению в дозе 10 Гр, при профилактическом (за 24 ч) и лечебном (через 1ч) применении

интерлейкина-1 3 в дозе 1 мкг/кг, усл. ед. (п = 10 в каждой группе)

Сроки исследования, сут Группы

контроль (облучение) ИЛ-1 за 24 ч до облучения ИЛ-1 через 1 ч после облучения

До облучения 1,34 ±0,06 1,34 ± 0,02 1,29 ± 0,02

3 1,10 ±0,02 1,32 ± 0,02 * 1,34 ± 0,02 *

5 1,05 ± 0,03 1,26 ±0,03 * 1,27 ± 0,03 *

7 1,08 ±0,01 1,20 ±0,03 * 1,24 ±0,04*

12 1,14 ±0,06 1.27 ± 0.03 1.38 ± 0.07 *

17 1,19 ±0,03 1,27 ± 0,03 1,35 ± 0,03 *

22 1,32 ± 0,03 1,37 ± 0,05 1,40 ±0,04

30 1,34 ± 0,04 1,40 ± 0,01 1,37 ±0,01

* - различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с контролем (облучением)

В этих условиях как профилактическое, так и лечебное применение ИЛ-1(3 в дозе 1 мкг/кг способствовало предотвращению радиационно обусловленного снижения показателей лизосомально-катионного теста. Так, уже на ранних сроках (3-5 сут) содержание катионных белков при обеих схемах использования ИЛ-1(5 превышало показатели контрольной группы в среднем на 20 %. Следует также отметить, что внутрибрюшинное введение ИЛ-1(3 как до, так и после облучения способствовало тому, что количество катионных белков в нейтрофилах облученных крыс практически не снижалось, оставаясь на уровне 1,26-1,37 усл. ед. практически во все сроки исследования.

Активность МПО в нейтрофилах периферической крови крыс в ранние сроки после внешнего облучения в дозе 10 Гр с мощностью дозы 1 Р/мин была пониженной. Максимальное угнетение активности фермента регистрировалось через 5 сут после окончания радиационного воздействия, а восстановление данного показателя до уровня необлученных животных происходило лишь на 22-30 сут наблюдения. Профилактическое применение ИЛ-1(3 не отменяло раннего постлучевого ингибирования МПО, но способствовало более быстрой (уже к 7 сут опьгга) нормализации активности фермента. Раннее лечебное

использование препарата практически полностью предотвращало вызванное радиацией ингибирование МПО в нейтрофилах, а, начиная с 7 сут эксперимента, активность данного фермента у леченых животных достоверно превышала показатели соответствующего нелеченного контроля.

Действие внешнего пролонгированного у-облучения приводило к увеличению в клетках активности ЩФ, особенно выраженному на 5-7 сут эксперимента. Как профилактическое, так и лечебное использование ИЛ-1(3 способствовало еще большей активации этого фермента в ранние сроки после окончания радиационного воздействия. Так, применение ИЛ-10 в качестве средства профилактики лучевого поражения через 3 сут после облучения приводило к увеличению активности ЩФ на 14 % по сравнению с соответствующим контролем (р>0,05) и на 18 % по сравнению с исходными данными. При применении ИЛ-10 в качестве средства раннего лечения активность ЩФ в этот же период возрастала на 11 % относительно контроля (р>0,05) и на 14 % относительно исходного уровня. В то же время, значимые отличия содержания данного фермента в нейтрофилах по сравнению с контролем регистрировались лишь через 7 и 12 сут после облучения, когда активность ЩФ у нелеченых животных уже восстанавливалась до нормы, а у крыс, получавших ИЛ-10, все еще наблюдалась ее гиперактивация.

Оценка влияния ИЛ-10 на состояние лейкоцитов периферической крови при сочетанном внешнем и внутреннем облучении показала, что через 3 и 5 сут после сочеганного радиационного воздействия в нейтрофилах облученных крыс обнаруживалось существенное (более чем на 20 % от исходного уровня) снижение количества катионных белков, а профилактическое или лечебное использование рекомбинантного ИЛ-10 отменяло этот эффект облучения.

Таблица 9

Динамика активности миелопероксидазы в нейтрофилах периферической крови белых беспородных крыс, подвергнутых сочетанному внешнему и внутреннему облучению в дозе 10 Зв, при профилактическом (за 24 ч) и лечебном (через 1 ч)

Сроки исследования, сут Группы

контроль (облучение) ИЛ-1 за 24 ч до облучения ИЛ-1 через 1 ч после облучения

До облучения 1,39 ±0,04 1,39 ±0,04 1,37 ±0,04

3 1,15 ±0,02 1,20 ±0,03 1,24 ± 0,03 *

5 1,16 ±0,03 1,23 ± 0,03 1,25 £0,04

7 1,18 ±0,03 1,28 + 0,04 1.28 ±0,04

12 1,14 ±0,05 1,32 ± 0,04 * 1,38 ±0,04*

17 1,20 ± 0,03 1,36 ± 0,07 1,29 ±0,07

22 1,27 ±0,03 1,37 ±0,03* 1,30 ±0,03

30 1,23 ±0,03 1,30 ±0,03* 1,38 ± 0,03 *

* - различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с контролем (облучением)

Как свидетельствуют данные, представленные в таблице 9, при обеих схемах применения исследуемый препарат не только предотвращал раннее постлучевое ингибирование МПО, но и значительно ускорял восстановление уровня этого фермента в нейтрофилах облученных крыс.

Уже через 12 сут после радиационного воздействия в нейтрофилах животных, получавших ИЛ-10, происходило полное восстановление активности МПО, в то время как у животных группы сравнения (облучение без фармакологической защиты) активность этого фермента оставалась сниженной весь период наблюдения (в течение 30 сут после облучения).

Результаты изучения активности ЩФ в нейтрофилах подвергшихся сочетанному облучению животных, свидетельствуют о выраженном стимулирующем влиянии ИЛ-10 как на зрелые формы нейтрофилов, так и на их костномозговых предшественников. Закладка ЩФ в специфические гранулы клеток происходит на стадии миелоцита, а время прохождения клеток от стадии миелоцита до нейтрофила циркулирующего пула составляет 3-5 сут, то есть как раз тот срок, когда и регистрируется наибольшее увеличение содержания данного фермента у крыс, получавших до или сразу после сочетанного облучения ИЛ-10.

Оценка влияния ИЛ-10 на показатели функционально-метаболического статуса нейтрофилов периферической крови в условиях фракционированного облучения проводили на 30 белых беспородных крысах. ИЛ-10, растворенный в 0,2 мл физиологического раствора, вводили пятикратно внутрибрюшинно в дозе 1мкг/кг по одной инъекции в день в течение 5 сут. Животным первой опытной группы курсовую терапию ИЛ-10 начинали после набора ими дозы 20 Гр и продолжали в ходе фракционированного облучения. Крысы второй опытной группы курс интерлейкинотерапии получили после окончания фракционированного облучения и набора суммарной дозы 25 Гр. Животные контрольной группы подвергались облучению, но вместо ИЛ-10 им вводился физиологический раствор.

В результате проведенных на этом этапе исследований установлено, что применение ИЛ-10, . в ходе продолжающегося фракционированного радиационного воздействия и после его окончания оказывало позитивное влияние на активность ЩФ в нейтрофилах облучаемых крыс.

Фракционированное облучение приводило к снижению активности ЩФ, которое регистрировалось во все сроки наблюдения. В то же время, уже через 1 сут после начала курсового применения ИЛ-10 активность ЩФ в нейтрофилах облучаемых крыс восстанавливалась практически до значений ложнооблученного контроля и удерживалась на этом уровне в течение 10 сут.

В частности, уже начиная с 1 сут наблюдения, активность данного фермента в нейтрофилах крыс, получавших после окончания фракционированного облучения ИЛ-10, восстанавливалась до значений ложнооблученного контроля и удерживалась на этом уровне не менее 10 сут. При этом через 10 сут после начала интерлейкинотерапии активность ЩФ в

нейтрофилах леченых животных даже несколько превышала показатели контрольной группы (рис. 7).

1 5 10

сроки исследования после начала введения ИЛ-1, сут

Рис. 7. Динамика активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах периферической крови крыс при курсовом применении интерлейкина-1р в ходе фракционированного облучения, усл. ед. (п = 10 в каждой группе)

* - различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с контролем (облучением)

Установлено также, что при обеих схемах применения ИЛ-10 способствовал более быстрому восстановлению активности ЩФ в нейтрофилах крыс, подвергавшихся фракционированному радиационному воздействию в большой дозе. Активность ЩФ у нелеченых облученных животных статистически значимо не отличалась от значений ложнооблученного контроля, начиная с 10 сут после окончания фракционированного облучения в суммарной дозе 25 Гр. В тоже время, при курсовом применении ИЛ-1Р полное восстановление активности ЩФ происходило уже через 1 сут после завершения радиационного воздействия. Следует также отметить, что на 15 и 20 сут восстановительного периода активность ЩФ в нейтрофилах получавших ИЛ-1Р крыс статистически значимо (р<0,05) превышала не только значения нелеченых животных, но и данные ложнооблученного контроля. В то же время, существенных различий в динамике этого показателя при различных схемах курсового применения ИЛ-1Р (в ходе облучения или после его завершения) не наблюдалось.

Клкпико-лабораторная оценка переносимости интерлейкина-ip людьми

Клинико-лабораторную оценку состояния здоровья людей, принимавших участие в исследовании, проводили непосредственно перед началом введения ИЛ-ip, в ходе его введения и в течение суток после окончания введения препарата. Препарат ИЛ-ip, предварительно разведенный физиологическим раствором, вводился внутривенно капельно в дозе 5 нг/кг в течение 3 часов.

В результате проведенных исследований установлено, что ИЛ-ip не вызывал существенных изменений состояния здоровья испытуемых людей, определяемых физикальными методами исследования. В то же время, через 22,5 ч после начала введения ИЛ-1р трое испытуемых предъявляли жалобы на озноб и головную боль, температура у них поднималась до субфебрильных значений, на 10-15% повышалось систолическое артериальное давление, частота сердечных сокращений увеличивалась до 78-80 ударов в минуту. В течение ближайших 10-15 мин после окончания введения ИЛ-1р самочувствие испытуемых людей улучшалось, жалоб на состояние здоровья они не предъявляли, показатели объективного статуса возвращались к нормальным. В целом, состояние здоровья добровольцев в ходе введения препарата и после его окончания оценивалось как удовлетворительное, а при их повторном обследовании через сутки после введения ИЛ-ip никаких отклонений изучаемых показателей от нормы ни у одного из испытуемых не отмечалось.

С целью более полного выявления реакций организма участвующих в исследовании людей на ИЛ-ip у них до введения, через 3, б и 24 ч после введения препарата проводилась оценка общеклинических гематологических, биохимических и иммунологических показателей.

В результате проведенных исследований установлено, что ИЛ-ip не оказывал существенного влияния на биохимические показатели сыворотки крови. Лишь активность ACT через 6 ч и ДЦГ через 24 ч были повышены на 40% и 17%, соответственно, но и эти показатели были в пределах нормы.

В то же время, препарат обладал выраженным гемостимулирующим действием, которое проявлялось в виде повышения общего числа лейкоцитов (с максимумом через 6 ч после введения препарата), в основном, за счет увеличения количества нейггрофильных гранулоцигов, относительные величины которых составили 70-90%. Повышенный уровень общего числа лейкоцитов и нейтрофилов сохранялся и через сутки после введения ИЛ-ip.

Наряду с увеличением содержания нейтрофилов препарат стимулировал и их функциональную активность (рис. 9). После введения ИЛ-lp происходило увеличение адгезивной и миграционной способности нейтрофилов, возрастал их функциональный потенциал, определенный в НСТ-тесте, во все сроки наблюдения значительно повышались показатели хемшпоминесценции. Об изменениях функционального статуса нейтрофилов свидетельствуют и сдвиги показателей метаболизма этих клеток: под влиянием ИЛ-1(3 повышалось содержание в клетках липидов и снижалась активность щелочной фосфатазы.

^ ^ после введения препарата, ч

Рис. 9. Спонтанная хемшноминесценция нейтрофилов периферической крови людей в разные сроки после введения интерлейкина-1р (п = 6)

# — различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с данными до введения ИЛ-1р

Иммуностимулирующее действие ИЛ-10 проявлялось ранним (через 3-6 ч после начала введения препарата) снижением абсолютного количества СБЗ+, СБ4+ и СБ8+ лимфоцитов и резким увеличением числа 0-лимфоцитов. Однако уже через 24 ч после инфузии никаких изменений количества и относительного содержания различных субпопуляций лимфоцитов не наблюдалось. Кроме того, под влиянием препарата увеличивалось число клеток, синтезирующих и продуцирующих ИЛ-1 и ФНО-а (рис. 10), а пролиферативная активность лимфоцитов, оцененная в реакции бласттрансформации с субоптимальными и оптимальными дозами ФГА и Р\¥М, напротив, несколько стекалась.

НИЛ-1 внутриклеточный ПФНО внутриклеточный ■ ФИО внеклеточный

до введения препарата

ч/з 24 ч после введения препарата

Рис. 10. Количество мононуклеаров, синтезирующих и продуцирующих цитокины, в периферической крови людей до и после введения интерлейкина-1р (п = 6) # - различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с данными до введения ИЛ-1(3

Таким образом, введение ИЛ-10 людям в дозе 5 нг/кг по субъективным (отсутствию жалоб на состояние здоровья), клиническим (показатели пульса, артериального давления, термометрии и др.) и лабораторным данным (гематологические, биохимические и иммунологические исследования) не приводило к ухудшению состояния их здоровья, но вызывало повышение общего количества лейкоцитов и стимуляцию их функционально-метаболического статуса.

Влияние интерлейкина-10 на состояние лейкоцитов людей после облучения проб их периферической крови in vitro

Задачей данного этапа исследования явилась оценка радиозащитной эффективности ИЛ-10 в отношении количественных и функционально-метаболических показателей лейкоцитов человека, регистрирующихся после облучении проб периферической крови здоровых людей in vitro.

Для решения этой задачи, у 6 здоровых добровольцев до введения и через 3, 6 и 24 ч после начала внутривенной инфузии рекомбинантного ИЛ-10 в дозе 5 нг/кг в стеклянные пробирки забирались пробы периферической крови, которые в дальнейшем подвергались облучению в дозах 0.25, 0.5, 1 и 4 Гр in vitro. В каждой пробе до и сразу после радиационного воздействия изучалось количество основных популяций лейкоцитов, параметры субпопуляционного состава лимфоцитов и их функциональная активность в ответ на митогены, относительное число мононуклеаров, синтезирующих и продуцирующих цитокины, эффекторные свойства и морфобиохимические характеристики нейтрофилов. Сравнение полученных после введения ИЛ-10 и последующего радиационного воздействия in vitro результатов проводили с исходными данными, а также со значениями, которые регистрировались после облучения проб периферической крови этих же людей без внутривенной инфузии ИЛ-10.

В результате проведенных на этом этапе исследований было установлено, что облучение проб периферической крови здоровых людей в дозах от 0.25 до 4 Гр in vitro не влияло на общее количество лейкоцитов, но вызывало изменения субпопуляционного состава лимфоцитов, активности процессов синтеза и продукции цитокинов мононуклеарами, а также показателей функционально-метаболического статуса нейтрофилов. Рекомбинантный ИЛ-10 в течение первых суток после его парентерального введения здоровым людям существенно изменял количественный состав и качественное состояние лейкоцитов периферической крови, разнонаправлено модифицируя реакции этих клеток, развивающиеся после облучения проб крови in vitro.

Так, при облучении проб периферической крови людей без введения им ИЛ-10 существенных изменений абсолютных количеств лейкоцитов, по отношению к исходным значениям, не наблюдалось. Если же пробы крови облучали через 6 ч после внутривенной инфузии препарата, то количество

лейкоцитов в периферической крови статистически значимо (р<0,05) превышало данные, зарегистрированные при облучении проб крови у людей, обследованных до введения ИЛ-1р. Эта тенденция сохранялась и через 24 ч после начала введения препарата и последующего облучения (табл. 10).

Таблица 10

Абсолютное количество лейкоцитов людей до и после введения интерлейкина-lp и последующего облучения проб периферической крови в дозах 0.25, 0.5, 1 и 4 Гр ш vitro, х 109 /л (п = 6)__

Доза облучения, Гр До введения ИЛ-1р Сроки исследования после введения ИЛ-1(5, ч

3 6 24

Без облучения 4,5 ± 1,48 4,8 ± 1,7 11 ± 2,11 * 7,25 ± 2,9

0.25 4,2 ±1,1 4,7 ±1,0 12 ± 1,1 * ,6,3 ±2,0

0.5 3,7 ± 1,2 6,0 ± 1,3 11 ±2,6* 6,2 ±0,7

1 4,6 ± 1,6 4,9 ±1,3 8,6 ± 2,1 * 5,9 ±0,6

4 3,6 ± 0,7 4,6 ±1.1 9,1 ±2,4* 6,5 ± 2,8

# - различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с данными до введения ИЛ-1Р

При оценке показателей лейкоцитарной формулы было выявлено, что, на фоне отсутствия сдвигов в распределении лейкоцитов после облучения проб крови in vitro, введение ИЛ-ip сопровождалось значительным ростом относительного содержания нейтрофильных гранулоцитов, в том числе и за счет увеличения юных и палочкоядерных форм клеток. Это приводило к тому, что через 6 и 24 ч после инфузии препарата и последующего радиационного воздействия относительное содержание нейтрофилов статистически значимо (р<0,05) превышало показатели, зарегистрированные у людей как в исходном состоянии, так и после облучения проб крови in vitro без введения ИЛ-ip.

Профилактическое введение испытуемым ИЛ-ip до облучения проб их периферической крови приводило также к изменению показателей, характеризующих функционально-метаболический статус нейтрофилов. Так, при радиационном воздействии in vitro в дозах 0.25, 0.5, 1 и 4 Гр, которое проводилось через 3 ч после начала внутривенной инфузии Ш1-1р, содержание липидов в нейтрофилах достоверно (р<0,05) возрастало. Если же облучение проб крови осуществлялось спустя 6 или 24 ч после введения препарата, уровень внутриклеточных жиров в гранулоцитах практически не изменялся.

Применение ИЛ-ip за 3 или 6 ч до облучения проб крови людей не отменяло постлучевого уменьшения содержания катионных белков в нейтрофилах. В то же время, эффективность ИЛ-ip, введенного испытуемым за 24 ч до облучения проб их периферической крови в дозах 1 и 4 Гр, была значительной, о чем свидетельствует более высокий уровень катионных белков (115-120%) по отношению к их содержанию в нейтрофилах проб крови, облученных без предварительного введения препарата.

Профилактическое применение ИЛ-1(3 до облучения проб крови людей не отменяло постлучевого ингибирования щелочной фосфатазы. Однако снижение активности данного фермента после радиационного воздействия in vitro в дозах 1 и 4 Гр на фоне введенного препарата было меньшим (р<0,05), чем в пробах крови, которые подвергались облучению без введения ИЛ-1(3 (табл. 11).

Таблица 11

Активность щелочной фосфатазы в нейтрофилах людей до и после введения интерлейкина-ip и последующего облучения проб периферической крови в дозах 0.25,0.5,1 и 4 Гр in vitro, усл. ед. (п = 6)_

Доза облучения, Гр До введения ил-ip Сроки исследования после введения ИЛ-ip, ч

3 6 24

Без облучения 1,31±0,06 0,99 ±0,05* 1,06 ±0,04* 1,08 ± 0,08 *

0.25 1,43 ± 0,04 1,35 ± 0,05 # 1,45 ± 0,07 * 1,49 ± 0,09 *

0.5 1,37 ±0,03 1,30 ±0,02* 1,38 ± 0,09 * 1,46± 0,08 *

1 1,20 ±0, 04 1,25 ± 0.02 * 1,44 ±0,02* 1,50 ± 0,03 * „

4 0,67 ± 0,07 * 1,27 ±0,04* 1,27 ± 0,07 * я 1,43 ± 0,03 * ##

# - различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с данными без облучения; ш - различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с данными после облучения без введения ИЛ-1Р

Изменения метаболизма нейтрофилов, которые наблюдались после облучения проб крови в дозе 4 Гр на фоне парентерального введения ИЛ-1(3, сопровождались и модификацией эффекторных свойств данных клеток. Так, радиационное воздействие in vitro до введения ИЛ-1(3 вызывало статистически значимое (р<0,05) снижение показателей спонтанной и индуцированной ФМА адгезии, уменьшалась миграционная способность нейтрофилов к ИЛ-8.

Через 3 ч после начала внутривенной инфузии ИЛ-ip и последующего облучения проб крови in vitro в дозе 4 Гр достоверные (р<0,05) отличия, по отношению к исходным значениям, определялись в параметрах, характеризующих процессы адгезии и миграции, показателях спонтанного и индуцированного зимозаном НСТ-теста, а также характеристиках хемшпоминесценции нейтрофилов. Следует отметить, что при облучении без введения препарата наблюдалось статистически значимое (р<0,05) уменьшение показателей НСТ-теста, а спонтанная и индуцированная ФМА или зимозаном хемшпоминесценция нейтрофилов были, напротив, более высокими (р<0,05).

Анализ относительных показателей клеточного иммунитета показал, что при облучении в дозе 4 Гр проб периферической крови людей через 3 ч после начала внутривенной инфузии ИЛ-1(3 процентное содержание CD3+ лимфоцитов по сравнению с данными облучения до введения препарата было в 1,4 раза ниже. Снижение числа CD3+ клеток в этот период происходило в основном за счет статистически значимого (р<0,05) уменьшения

относительного содержания СЭ4+ лимфоцитов, что отражалось и на значении индекса иммунорегуляции: 1,12 ± 0,11 против 1,50 ± 0,08 в контроле.

Облучение проб крови людей через 6 ч после начала введения препарата также сопровождалось уменьшением относительного содержания СБЗ+ и СБ4+ лимфоцитов (р<0,05). Кроме того, в этот срок исследования наблюдалось и статистически значимое (р<0,05) снижение СБ20+ лимфоцитов по сравнение с данными необлученных проб, а значение СБ4+/С08+ составляло 1,23 ± 0,07.

Применение ИЛ-1Р за 24 ч до облучения проб крови людей в дозе 4 Гр полностью отменяло пострадиационное снижение изученных субпопуляций лимфоцитов. Следует отметать, что относительное содержание СБ95+ клеток в этот период (24,6 ± 10,8%) было существенно ниже, чем в случае после облучения без введения препарата (37,6 ± 14,6%) и даже по Сравнению с данными необлученных проб крови (30,3 ± 9,45%). Необходимо также подчеркнуть, что, несмотря на применение ИЛ-1Р, уровень 0-лимфоцитов после радиационного воздействия был существенно повышен, а относительное содержание НЬА+ клеток значимо не отличалось от значений групп сравнения.

После облучения проб крови людей в дозе 4 Гр без предварительного введения ИЛ-1Р статистически значимо (р<0,05) по сравнению с исходным уровнем возрастало число мононуклеаров с внутриклеточной формой ИЛ-1Р и ФНО-а и с поверхностной формой ФНО-а (рис. 11).

Идо облучения без введения препарата □ после облучения без введения препарата Ыпосле введения препарата и после облучения

Я ЙИ

ИЛ-1 ФНО ФНО внеклеточный

внутриклеточный внутриклеточный

Рис. 11. Количество мононуклеаров, синтезирующих и секретирующих цитокины, в периферической крови людей до и через 24 ч после введения интерлейкина-1 р и последующего облучения проб периферической крови в дозе 4 Гр in vitro, % (n = 6) # - различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с данными до облучения; т - различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с данными после облучения без введения ИЛ-1Р

При профилактическом применении ИЛ-10 за 24 ч до радиационного воздействия in vitro содержание клеток, синтезирующих ИЛ-10 и ФНО-а, также увеличивалось в 5,2 раза и 7,1 раза, соответственно, по отношению к данным необлученных проб. Статистически значимо (р<0,05) возрастал и уровень мононуклеаров, продуцирующих ФНО-а во внеклеточное пространство (в 2,2 раза). Следует, однако, отметить, что отношение содержания клеток с внутриклеточной формой ИЛ-10 к уровню мононуклеаров с поверхностной формой ФНО-а под влиянием ИЛ-10 изменялось более чем в два раза. В частности, после облучения без использования препарата этот индекс составлял 0,39, а после радиационного воздействия in vitro на фоне профилактического (за 24 ч) парентерального введения ИЛ-10 его значение возрастало до 0,98.

Радиационное воздействие in vitro в дозе 4 Гр сопровождалось тенденцией к снижению спонтанной и индуцированной митогенами пролиферативной активности лимфоцитов. При использовании ИЛ-10 до облучения проб периферической крови показатели спонтанной реакции бластгрансформации практически не отличались от исходных значений. В то же время, пролиферативная активность Т-лимфоцитов в ответ на ФГА в дозе 2,5 мкг/мл при облучении на фоне введенного ИЛ-10 уменьшалась: через 3 ч после начала внутривенной инфузии препарата - на 49%, через 6 ч - на 84% (р<0,05), через 24 ч - на 69% (р<0,05). В ответ на ФГА в дозе 15 мкг/мл показатели реакции бластгрансформации Т-лимфоцитов после введения ИЛ-10 и последующего облучения проб крови также снижались: через 3 ч - на 52%, через б ч - на 78% (р<0,05), через 24 ч - на 62% (р<0,05). В среднем на 40% уменьшалась и пролиферативная активность В-лимфоцитов, оцененная в реакции бластгрансформации в ответ на митоген лаконоса в дозе 5 мкг/мг.

Таким образом, результаты, представленные в настоящем разделе, свидетельствуют о том, что ИЛ-10 обладает выраженной радиозащитной активностью по отношению к лейкоцитам людей, а максимальный радиопротекторный эффект препарата, оцениваемый по количественным и функционально-метаболическим показателям лейкоцитов периферической крови, наблюдается через 24 ч после парентерального введения ИЛ-10.

В основе радиозащитного и лечебного действия ИЛ-10 лежит его способность предотвращать постлучевую депрессию кроветворения, уменьшать выраженность процесса апоптоза, а также стимулировать иммунитет и неспецифическую резистентность организма. Основные пути реализации противолучевой активности ИЛ-10, подтвержденные результатами наших исследований, представлены на схеме.

Резюмируя результаты проведенных экспериментально-клинических исследований и данные литературы, необходимо отметить, что рекомбинантные цитокины вообще, и интерлейкин-10 в частности, занимают уникальное место в системе средств профилактики и лечения радиационных поражений. В отличие от радиопротекторов ИЛ-1(3 обладает одновременно как профилактическим, так и лечебным действием, проявляет свой радиозащитный эффект не только при остром радиационном воздействии, но и при пролонгированном, фракционированном, сочетанием внутреннем и внешнем облучении, и, судя по данным литературы, при местных и комбинированных радиационных поражениях [Заргарова Н.И. и др., 2000; Ремизов Д.В., 2000]. Этот цитокин оказывает непосредственное воздействие на основное звено патогенеза радиационных поражений — систему гемопоэза, защищая кроветворные клетки от лучевой гибели и ускоряя их восстановление после облучения [Аксенова Н.В., 2004; Neta R., 1997]. Положительным моментом является и то, что радиозащигное действие ИЛ-10 проявляется как в условиях однократного применения, так и при курсовом введении, и сохраняется в течение достаточно длительного времени. Важно также, что фармакопейный препарат рекомбинантного ИЛ-10 «Беталейкин» относится к немногим средствам профилактики и лечения радиационных поражений, выпускаемым в Российской Федерации [Назаров В.Б., Гребенюк А.Н., 2008]. Все это позволяет рекомендовать внедрение ИЛ-10 в существующую схему профилактики и лечения радиационных поражений, так как только комплексное применение традиционных и вновь создаваемых средств и методов позволит обеспечить эффективную защиту организма при воздействии поражающих факторов радиационной природы.

выводы

1. Рекомбинантный интерлейкин-1р при введении за 24 ч до облучения и через 1 ч после радиационного воздействия обладает выраженным радиозащитным эффектом, что позволяет рассматривать его в качестве нового лечебно-профилактического средства обеспечения безопасности при чрезвычайных ситуациях радиационного характера.

2. В условиях острого радиационного воздействия шггерлейкин-1р является эффективным медицинским средством противорадиационной защиты, позволяющим увеличивать выживаемость облученных животных: ФИД препарата при его применении в качестве радиопротектора составляет 1,18-1,20, а при использовании в качестве средства ранней патогенетической терапии радиационных поражений - 1,16-1,18. При пролонгированном радиационном воздействии, сочетанном внешнем и внутреннем облучении профилактическое и лечебное использование интерлейкина-1 ¡3 позволяет увеличить выживаемость облученных животных в среднем на 40-50%.

3. Интерлейкин-1р увеличивает миграционную и пролиферативную активность ранних предшественников гемопоэза. Применение данного препарата за 24 ч до облучения или через 1 ч после радиационного воздействия способствует сохранению жизнеспособности значительного числа стволовых кроветворных клеток и ускоряет восстановление гипоплазированного после радиационного воздействия костного мозга.

4. В условиях острого, пролонгированного, фракционированного и сочетанного внешнего и внутреннего облучения профилактическое и лечебное применение интерлейкина-1р позволяет уменьшить выраженность ранней постлучевой лейкопении и ускоряет восстановление количества клеток белой крови в поздние сроки после облучения.

5. Стимулирующий эффект интерлейкина-1р в отношении показателей функционально-метаболического статуса нейтрофилов, измененных в результате различных вариантов радиационного воздействия, проявляется увеличением внутриклеточного содержания катионных белков, повышением активности миелопероксидазы и щелочной фосфатазы.

6. Введение интерлейкина-1Р в дозе 5 нг/кг хорошо переносится людьми и, несмотря на кратковременное повышение температуры тела до субфебрильных цифр, не оказывает отрицательного влияния на самочувствие и объективный статус людей, а также на биохимические показатели крови. Гемо- и иммуностимулирующее действие препарата у людей проявляется развитием умеренно выраженного нейтрофилыюго лейкоцитоза, повышением функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов, увеличением

количества клеток, синтезирующих и продуцирующих провоспалительные цитокины.

7. Введение людям рекомбинантного интерлейкина-lß за 24 часа до облучения их проб их периферической крови in vitro отменяет радиационно-индуцированное снижение абсолютного числа CD4+, CD8+ и CD20+ лимфоцитов, уменьшает пострадиационное ингибирование щелочной фосфатазы в нейтрофилах, нормализует адгезивные свойства гранулоцитов и их миграционную способность, снижает выраженность пострадиационных нарушений в цитокиновой сети.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомбинантный интерлейкин-lß рекомендуется для применения в качестве средства профилактики и экстренной терапии лучевых поражений, формирующихся при радиационных авариях и катастрофах.

2. Разработанная экспериментальная модель исследования реакций количественного состава различных субпопуляций лейкоцитов, параметров клеточного иммунитета, характеристик цитокиновой сети и морфофункциональных показателей нейтрофилов, развивающихся после введения здоровым людям рекомбинантного интерлейкина-lß и последующего облучения проб их периферической крови in vitro, может бьггь использована для оценки эффективности радиомодифицирующих препаратов в отношении человека.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в изданиях по перечню ВАК:

1. Аксенова Н.В. Радиопротекторная активность рекомбинантного IL-lß в отношении клеток предшественников гемопоэза / Н.В. Аксенова, А.Н. Гребенюк, С.А. Кетлинский, A.C. Симбирцев, Д.А. Сидоров, A.A. Тимошевский // Медицинская иммунология. - 2003. - Т. 5, № 5-6. - С. 21-24.

2. Тимошевский A.A. Реакция лейкоцитов человека на парентеральное введение интерлейкина-lß и на последующие облучение проб периферической крови in vitro / A.A. Тимошевский, А.Н. Гребенюк, Н.М. Калинина // Мед. радиология и радиационная безопасность. - 2005. - Т. 50, № 2. - С. 5-17.

3. Гребенюк А.Н. Противолучевые свойства интерлейкина-1 / А.Н. Гребенюк, К.Г. Саркисян, A.A. Тимошевский // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2005. -№ 1 (13). - С. 44-53.

4. Гребенюк А.Н. Препараты интерлейкина-1 в лечении поражений ионизирующими излучениями / А.Н. Гребенюк, Н.В. Аксенова, В.В. Конев, К.Г. Саркисян, А Л. Тимошевский // Вестник Российской Военно-медицинской академии.-2005.1 (14).-С. 161-162.

5. Гребенюк А.Н. Экспериментальное обоснование целесообразности использования рекомбинантного IL-1 beta для коррекции эффектов фракционированного облучения / А.Н. Гребенюк, В.В. Конев, A.A. Тимошевский // Медицинская иммунология. - 2005. - Т. 7, № 5-6. - С. 605611.

6. Гребешок А.Н. Перспективные направления фармакологической коррекции пострадиационных нарушений иммунитета / А.Н. Гребенюк, H.A. Смирнов, Ю.А. Севрук, A.A. Тимошевский II Военно-медицинский журнал. -2005. - Т. 327, № 8. - С. 49-53.

7. Гребенюк А.Н. Перспективы совершенствования средств и методов профилактики радиационных поражений / А.Н. Гребенюк, Н.В. Аксенова, В.В. Зацепин, Д.А. Сидоров, A.A. Тимошевский // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2005. - № 1 (15). - Приложение. -С. 404-405.

8. Гребенюк А.Н. Принципы, средства и методы медицинской противорадиационной защиты / А.Н. Гребенюк, В.В. Зацепин, A.A. Тимошевский // Медицина катастроф. - 2007. - № 3 (59). - С. 32-37.

9. Гребенюк А.Н. Влияние раннего терапевтического применения интерлейкина-lß на выживаемость и костномозговое кроветворение облученных мышей / А.Н. Гребенюк, В.В. Зацепин, Н.В. Аксенова, A.A. Тимошевский // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2008. -№ 1 (21).-С. 135-138.

10. Гребенюк А.Н. Влияние раннего терапевтического применения интерлейкина-lß на количество иммунокомпетентных клеток в периферической крови, тимусе, селезенке и костном мозге облученных мышей / А.Н. Гребенюк, В.В. Зацепин, A.B. Петров, Н.В. Пигарева, A.C. Симбирцев, A.A. Тимошевский // Вестник Российской Военно-медицинской академии. -2008.-№3(23).-С. 29-35.

11. Тимошевский A.A. Медицинская противорадиационная защита специалистов аварийно-спасательных формирований / A.A. Тимошевский, Н.М. Калинина, А.Н. Гребенюк, В.В. Зацепин // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях.-2008.-№4.-С. 13-18.

12. Алексанин С.С. Клинико-экспериментальное обоснование интерлейкина-lß как средства профилактики и ранней терапии поражений при радиационных авариях и катастрофах / С.С.Апексанин, A.A. Тимошевский // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. - 2009. - № 2. - С. 5-11.

Статьи в журналах, сборниках трудов, тезисы докладов:

13. Гребешок А.Н. Реакция нейтрофилов на облучение крови в малых дозах in vitro / А.Н. Гребенюк, В.В. Конев, A.A. Тимошевский, В.Г. Конусова, Н.М. Калинина, О.С. Солнцева // 3 Съезд по радиационным исследованиям: Тез. докл. - Т. 1. - Пущино, 1997. - С. 22-23.

14. Сидоров Д. А Экспериментальное изучение влияния рекомбинанхного интерлейкина-1 на костномозговой и кишечный синдром при остром лучевом воздействии / Д.А. Сидоров, В.В. Конев, A.A. Тимошевский // Итоговая науч. конф. военно-научного об-ва слушателей I факультета и клин, ординаторов ВМедА: Тез. докл. - СПб., 1998. - С. 164.

15. Тимошевский A.A. Прямое действие малых доз ионизирующего излучения на клетки периферической крови / A.A. Тимошевский // Итоговая науч. конф. военно-научного об-ва слушателей I факультета и клин, ординаторов ВМедА: Тез. докл. - СПб., 1998. - С. 173.

16. Тимошевский A.A. Состояние нейтрофилов в облученных пробах крови здоровых людей и лиц, ранее подвергавшихся воздействию ионизирующих излучений / A.A. Тимошевский, А.Н. Гребенюк, В.В. Конев, Д.А. Сидоров // Юбилейная конф. молодых ученых и специалистов, посвященная 200-летию ВМедА: Тез. докл. - СПб., 1998. - С. 126.

17. Тимошевский A.A. Реакция лейкоцитов периферической крови на действие малых доз ионизирующих излучений / А.А.Тимошевский, В.В. Конев, О.С. Солнцева, А.Н. Гребешок // Морской мед. журн. - 1998. - Т. 5, № 2.-С. 26-29.

18. Солнцева О.С. Изменение количества апоптотических клеток, синтеза и продукции цитокинов в результате воздействия малых доз ионизирующего излучения / О.С. Солнцева, Н.М. Калинина, Н.В. Бычкова, А.Н. Гребенюк, A.A. Тимошевский, А.М. Никифоров // Морской мед. журн. -1998.-Т. 5,№3.-С. 31-34.

19. Куценко С. А. Использование цитохимических методов исследования нейтрофилов для оценки эффективности фармакологической коррекции радиационных поражений / С.А. Куценко, А.Н. Гребенюк, Е.В. Давыдова, Д.А.Сидоров, A.A. Тимошевский, В.В. Конев // От materia medica к современным медицинским технологиям: Матер. Всерос. науч. конф. - СПб., 1998. - С. 89.

20. Гребенюк А.Н. Экспериментально-теоретическое обоснование возможности применения рекомбинантного интерлейкина-lß в качестве средства ранней коррекции гематологического синдрома радиационной этиологии / А.Н. Гребенюк, Д.А. Сидоров, A.C. Симбирцев, Н.В. Аксенова, Е.В. Давыдова, В.В. Конев, A.A. Тимошевский // Современные проблемы медицинской науки и практики: Сб. науч. статей. - СПб., 1998. - С. 38-39.

21. Конев B.B. Оценка влияния рекомбинантного интерлейкина-lß на гематологические показатели при фракционированном радиационном воздействии ! В.В. Конев, A.A. Тимошевский, Д.А. Сидоров // Итоговая науч. конф. военно-научного об-ва слушателей I факультета и клин, ординаторов ВМедА: Тез. докл. - СПб., 1999. - С. 62.

22. Гребенюк А.Н. Исследования радиозащитной эффективности интерлейкина-lß в Военно-медицинской академии / А.Н, Гребенюк, Н.В. Аксенова, В.В. Конев, Д.А. Сидоров, A.A. Тимошевский // Адаптация организма к неблагоприятным условиям среды обитания: Сб. науч. статей. -СПб.: Изд-во "АСПОР" СПбГМПА, 1999. - С. 50-54.

23. Калинина Н.М. Оценка радиозащитной эффективности препарата «Беталейкин» в исследованиях in vitro / Н.М. Калинина, О.С. Солнцева, Д.А. Сидоров, А.Н. Гребенюк, В.Г. Конусова, A.C. Симбирцев, A.A. Тимошевский // Фундаментальные и прикладные проблемы биотехнологии и медицины: Матер. Юбилейной науч.-техн. конф. - СПб., 2000. - С. 30.

24. Гребенюк А.Н. Влияние «Беталейкина» на количественные и функционально-метаболические показатели лейкоцитов людей при облучении проб периферической крови in vitro / А.Н. Гребенюк, A.A. Тимошевский // Радиационные поражения, перспективы развития средств индивидуальной защиты от ионизирующих излучений: Тез. докл. науч.-пракг. конф. - М., 2000. - С. 20.

25. Аксенова Н.В. Радиопротекторная эффективность препаратов интерлейкина-1 / Н.В. Аксенова, А.Н. Гребенюк, A.A. Тимошевский, Д.А. Сидоров // Морской мед. журн. - 2001. - Т. 8, № 4. - С. 6-10.

26. Гребенюк А.Н. Комплексная оценка радиозащитной эффективности рекомбинантного интерлейкина-lß / А.Н. Гребенюк, Н.В. Аксенова, Ф.В. Арсеньев, А.Б. Верведа, Д.А. Сидоров, В.В. Конев, АА.Тимошевский и др. // IV съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность): Тез. докл. - Т. И.-М., 2001.-С. 415.

27. Тимошевский A.A. Экспериментальная оценка радиозащитной активности рекомбинантного интерлейкина-lß в исследованиях in vitro / A.A. Тимошевский // Медицинские аспекты радиационной и химической безопасности: Тез. докл. Рос. науч. конф. - СПб., 2001. - С. 445-446.

28. Тимошевский A.A. Перспективы применения рекомбинантных препаратов интерлейкина-lß в качестве медицинских средств защиты / A.A. Тимошевский, Н.В. Аксенова, А.Н. Гребенюк, Д.А. Сидоров, В.В. Конев // Сб. тр. I съезда военных врачей медико-профилактического профиля ВС РФ. -СПб., 2002.-С.174-175.

29. Гребенюк А.Н. Влияние интерлейкина-1 на состояние нейтрофилов в условиях острого, пролонгированного, фракционированного и сочетанного (внешнего и внутреннего) облучения / А.Н. Гребенюк, Н.В. Аксенова, В.В. Конев, A.A. Тимошевский // III Съезд по радиационным исследованиям (радиобиология и радиоэкология): Тез. докл.- Киев, 2003. - С. 143.

30. Аксенова Н.В. Экспериментальное исследование механизмов радиозащитного действия интерлейкина-1 / Н.В. Аксенова, А.Н. Гребенюк, К.Г. Саркисян, Д.А. Сидоров, A.A. Тимошевский // Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты: Тез. докл. Рос. науч. конф. - СПб., 2004. - С. 229-231.

31. Аксенова Н.В. Перспективы создания новых средств медицинской противорадиационной и противохимической защиты на основе рекомбинантных цитокинов / Н.В. Аксенова, А.Н. Гребенюк, A.M. Ищенко, В.В. Конев, С.А. Кетлинский, К.Г. Саркисян, A.A. Тимошевский и др. // The peculiarities of medical support of armed forces in contemporary conditions: Abstracts of scientific conference. - Yerevan, 2004. - C. 44-45.

32. Антушевич A.E. Противорадиационные средства для оказания первой медицинской помощи при крупномасштабных радиационных авариях / А.Е. Антушевич, И.Ш. Галеев, А.Н. Гребенюк, A.A. Тимошевский и др. // The peculiarities of medical support of armed forces in contemporary conditions: Abstracts of scientific conference. - Yerevan, 2004. - C. 83-84.

33. Аксенова Н.В. Фармакологические эффекты перспективного радиозащитного препарата интерлейкина-lß / Н.В. Аксенова, В.А. Башарин, А.Н. Гребенюк, А.М. Ищенко, Н.М. Калинина, A.A. Тимошевский и др. // Актуальные проблемы обитаемости и медицинского обеспечения личного состава ВМФ: Тез. докл. науч.-практ. конф. - СПб., 2004. - С. 163-164.

34. Гребенюк А.Н. Цитокиновая терапия радиационного стресса / А.Н. Гребенюк, Н.В. Аксенова, В.А. Башарин, К.Г. Саркисян, Д.А. Сидоров, A.A. Тимошевский // Механизмы стресса в экстремальных условиях: 3 Всерос. науч. конф.: Сб. науч. тр.-М., 2004.-С. 100-102.

35. Тимошевский A.A. Рекомбинантные цитокины в системе средств профилактики и лечения радиационных поражений / A.A. Тимошевский, К.Г. Саркисян, Н.В. Аксенова, А.Н. Гребешок // Радиационная гигиена: Сб. науч. тр. - СПб., 2004. - С. 146-152.

36. Аксенова Н.В. Препараты интерлейкина-1 как медицинские средства минимизации радиационных повреждений организма 1 Н.В. Аксенова, А.Н. Гребенюк, Е.Б. Жаковко, Н.И. Заргарова, A.A. Тимошевский и др. // Радиобиологические эффекты, риски, минимизация, прогноз: Матер, междунар. науч. конф. - Киев, 2005. - С. 46.

37. Grebenyuk A. Recombinant interleukin-1 as perspective radiodefence drug / A. Grebenyuk, N. Aksenova, N. Kalinina, S. Ketlinski, V. Konev, A. Timoshevski et al. II XXX World Congress on Military Medicine: Abstracts. - St. Petersburg, 2005.-P. 134-135.

38. Sarkisyan K. Influence of interleukin-1 and its receptor antagonist on frequency of reciprocal translocations formations in the spermatogonies of mice irradiated in sublethal doses / K. Sarkisyan, Y.Zhakovko, A.Grebenyuk, N.Aksenova, A. Timoshevski // Modern problems of genetics, radiobiology, radioecoiodgy and evolution: Abstracts of scientific conference. - Yerevan, 2005. -P. 143.

39. Гребешок A.H. Регуляторы гемопоэза в профилактике и лечении радиационных поражений / А.Н. Гребенюк, Е.Б. Жаковко, Н.И. Заргарова, Н.В. Аксенова, А.А. Тимошевский и др. // V съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность): Тез. докл. - Т. II.-М., 2006.-С. 32.

40. Grebenyuk A. Recombinant cytokines in prophylaxis and therapy of radiation injures II A. Grebenyuk, N. Aksenova, K. Sarkisyan, A. Timoshevsky // The 35th Annual Meeting of the European Radiation Research Society and the 4th Annual Meeting of the Ukrainian Society for Radiation Biology: Abstracts. - Kyiv, 2006.-P. 87.

41. Тимошевский A.A. Влияние регуляторов гемо- и иммунопоэза на реакцию нейтрофилов периферической крови человека / А.А. Тимошевский,

B.В. Кирьянов, А.Н. Гребенюк, О.В. Бабенко, Ю.В. Боровикова // XXXVII научно-практическая конференция врачей 5 ЦВКГ ВВС: Сб. науч. статей. -Красногорск, 2007. - С. 370-372.

42. Grebenyuk A. Experimental study of the possibility of use of IL-1(5 curing leucopenia induced by fractionated radiation / A. Grebenyuk, V. Konev, A. Timoshevski // Military Medicine (Armenia). -2007. - № 1. - P. 43-47.

43. Тимошевский A.A. Медицинская профилактика и неотложная помощь в начальном периоде радиационной аварии / А.А. Тимошевский, А.Н. Гребенюк "II Медицинские и экологические эффекты ионизирующего излучения: Матер. IV междунар. науч.-практ. конф. — Северск, Томск, 2007. -

C. 151-152.

44. Алексанин С.С. Результаты клинико-экспериментальной оценки интерлейкина-1|3 как средства профилактики и ранней терапии поражений при радиационных авариях и катастрофах / С.С. Алексанин, А.А. Тимошевский // Вестник психотерапии. -2009. -№29 (34). - С. 130-134.

45. Алексанин С.С. Возможности применения интерлейкина-ip для профилактики и ранней терапии поражений при радиационных авариях / С.С. Алексанин, А.А. Тимошевский // Актуальные психолого-педагогические и медико-социальные проблемы социума и безопасности жизнедеятельности: Матер, междунар. науч.-практ. конф. - СПб.: МИРВЧ, 2009. - С. 4-7.