автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.14, диссертация на тему:Исследование и разработка микрофлюидных устройств для анализа биологических объектов методами микроскопии высокого разрешения

На правах рукописи //

Кухтевич Игорь Владимирович

ИССЛЕДОВАНИЕ И РАЗРАБОТКА МИКРОФЛЮИДНЫХ УСТРОЙСТВ ДЛЯ АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ МЕТОДАМИ МИКРОСКОПИИ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ

Специальность: 05.11.14- Технология приборостроения

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

31 ОКТ 2013

Санкт-Петербург - 2013

005536665

005536665

Работа выполнена на кафедре нанотехнологий и материаловедения Санкт-Петербургского национального исследовательского университета информационных технологий, механики и оптики (НИУ ИТМО).

Научный руководитель: Евстрапов Анатолий Александрович,

доктор технических наук, доцент, кафедра нанотехнологий и материаловедения НИУ ИТМО

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Абиев Руфат Шовкетович, доктор технических наук, профессор, Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)

Ястребов Сергей Гурьевич,

доктор физико-математических наук,

Физико-технический институт

им. А.Ф. Иоффе РАН, Санкт-Петербург

ЗАО «Научные приборы», Санкт-Петербург

Защита состоится «26» ноября 2013 г. в 15:30 на заседании диссертационного совета Д 212.227.04 при Санкт-Петербургском национальном исследовательском университете информационных технологий, механики и оптики (НИУ ИТМО) по адресу 197101, Санкт-Петербург, пр. Кронверкский, д. 49, ауд. 206.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке НИУ ИТМО по адресу: 197101, Санкт-Петербург, пр. Кронверкский, д. 49.

Автореферат разослан <<2.'/~> октября 2013 г.

Отзывы и замечания по автореферату (в 2 экз.), заверенные печатью, просим направлять по адресу НИУ ИТМО: 197101, Санкт-Петербург, пр. Кронверкский, д. 49, ученому секретарю диссертационного совета Д 212.227.04.

Ученый секретарь диссертационного

совета Д 212.227.04,

кандидат технических наук, доцент

Киселев Сергей Степанович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Постановка всех стадий и этапов анализа на одном компактном устройстве - суть концепции «лаборатория на чипе» (lab on a chip), которая успешно применяется при исследовании жидких многокомпонентных проб и биологических объектов (клеток, бактерий и др.). Основой «лаборатории на чипе» является микрофлюидное устройство (МФУ), которое содержит различные функциональные элементы: каналы, смесители, нагреватели, фильтры, резервуары, реакционные камеры, устройства разделения пробы, сенсоры и т.д. Данные элементы предназначены для выполнения аналитических, технологических и прочих операций с пробой. Исходя из задач анализа формируется перечень операций, реализуемых в МФУ, что определяет набор необходимых функциональных элементов.

Планарной реализацией МФУ без вспомогательных элементов (гидравлический интерфейс, фитинги и т.д.) является микрофлюидный чип (МФЧ). Одним из направлений развития МФЧ является интегрирование в них микро- и наноразмерных элементов, позволяющих выделять целевые биологические объекты, фиксировать (или разделять) и детектировать их. Снижение стоимости МФЧ может быть обеспечено за счет повышения доступности современных методов изготовления, применяемых в микро- и нанотехнологиях (лазерная литография, ионная литография и др.), использования полимерных материалов - полидиметисилоксан (ПДМС), поликарбонат и т.д., которые позволяют оперативно получать прототипы чипов, например, методом отливки по шаблону.

Прослеживается тенденция использования МФЧ совместно с приборами микроскопии высокого разрешения (конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (KJICM), атомно-силовой микроскопии (АСМ) и др.), позволяющими осуществлять визуализацию биологических объектов с высоким пространственным разрешением и получать новую информацию о них. При проведении исследований методом АСМ в жидкости чаще всего используют воду, однако, изучение биологических объектов требует применения растворов с различным водородным показателем (pH), в частности натрий-фосфатного буфера (phosphate buffered saline, PBS). Для фиксации биологических объектов на время их измерений методом АСМ следует использовать специальные методы пробоподготовки (химическая обработка пробы, применение гелей и т.д.), которые рассчитаны на ограниченный круг объектов, что приводит к необходимости адаптации методов под конкретную задачу.

Таким образом, требуется создание доступных в лабораторных условиях МФЧ с интегрированными микро- и наноразмерными функциональными элементами для исследования биологических объектов методами микроскопии, т.к. эти МФЧ позволяют осуществлять манипуляции отдельными объектами или их небольшими группами, проводить исследования, которые невозможно реализовать методами, традиционно применяемыми в биологии и медицине.

Аналитические приборы и системы на основе МФЧ существуют не первое десятилетие, но вопросы контроля их характеристик и метрологической аттестации остаются в значительной степени нерешенными, что связанно с отсутствием: единых стандартов изготовления МФЧ; единого регламента по выбору материалов, технологий обработки и герметизации чипов; методик контроля геометрических размеров функциональных элементов МФЧ.

Итак, актуальным является разработка МФЧ с интегрированными микро-и наноразмерными элементами для фиксации и разделения биологических объектов, обеспечение совместимости МФЧ с различными методами микроскопии, в том числе высокого разрешения. Контроль погрешностей, обусловленных технологиями изготовления, требует отдельного внимания, ведь именно точность изготовления элементов чипов будет определять их аналитические и функциональные характеристики. При разработке МФЧ для приборов АСМ необходимым является решение комплекса задач, связанных с фиксацией и поддержанием условий функционирования исследуемых биологических объектов. С учетом вышеизложенного и на основании анализа литературных данных были сформулированы цель и задачи работы.

Цель работы: проведение теоретических, технологических и экспериментальных исследований, направленных на разработку, изготовление, контроль геометрических размеров и испытание МФУ, предназначенных для фиксации и разделения биологических микрообъектов, и визуализация последних методами оптической и атомно-силовой микроскопии.

Основные задачи работы:

1) моделирование массопереноса жидкости в гидродинамических ловушках для фиксации микрочастиц, гидродинамического разделения частиц различных размеров в реакционной камере и разработка топологий МФЧ;

2) отработка технологии изготовления микроструктур в стекле марки Крон 8 (К8) методом лазерной литографии с последующим кислотным травлением и контроль их геометрических размеров;

3) разработка технологий изготовления и создание экспериментальных образцов МФЧ с ловушками для фиксации микрочастиц, для разделения частиц и контроль геометрических размеров их элементов, определяющих функциональные и аналитические характеристики чипа (анализируемый объем и т.д.);

4) разработка методического подхода для оценки влияния погрешности изготовления микроразмерных каналов на функциональные характеристики МФЧ (объем элемента и гидравлическое сопротивление канала);

5) испытание экспериментальных образцов МФЧ с использованием модельных объектов (полимерных микрочастиц и бактерий) для проверки адекватности результатов моделирования и подтверждения работоспособности конструкций;

6) изучение особенностей проведения измерений геометрических размеров калибровочной решетки в жидких средах (дистиллированная вода, PBS,

боратный буфер, NaOH) методом ACM и разработка методики фиксации бактерий в воде на время проведения измерений.

Методы исследования

Для решения поставленных задач применялись следующие аналитические методы: анализ литературных источников по тематике диссертации; математическое моделирование массопереноса жидкости и движения микрочастиц путем решения уравнения Навье-Стокса при помощи программного продукта COMSOL Multiphysics; оптическая микроскопия для контроля микроразмерных структур и апробации МФЧ; сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) для контроля наноразмерных структур МФЧ; KJICM для апробации работы МФЧ; АСМ для изучения тестовых структур и биологических объектов в жидкости; статистическая обработка экспериментальных результатов; нахождение аппроксимирующих функций путем приведения функциональной зависимости к форме линейного тренда в новой системе координат.

Кроме того, для изготовления МФЧ использовались следующие технологические методы: фотолитография с последующим кислотным травлением для изготовления заготовок МФЧ из стекла К8; травление сфокусированным ионным пучком (СИП) для изготовления микро- и наноразмерных структур в заготовках МФЧ из стекла; лазерная литография с последующим кислотным травлением для изготовления тестовых структур и шаблонов МФЧ из стекла; отливка ПДМС по шаблону для получения полимерных МФЧ; герметизация МФЧ за счет использования адгезии между стеклом и ПДМС.

Научная новизна

1. Предложены технологии изготовления, созданы и испытаны оригинальные конструкции МФЧ: а) с гидродинамическими ловушками (П-образная ловушка, сеть параллельных наноразмерных каналов с заходами) для фиксации микрочастиц размером до 3 мкм из потока; б) с реакционной камерой для гидродинамического разделения микрочастиц размерами 3-10 мкм в потоке.

2. В результате технологических исследований по изготовлению тестовых микроструктур в стекле К8 методом лазерной литографии с последующим кислотным травлением и контроля их геометрических размеров методом оптической микроскопии, получены данные, позволяющие определить режим изготовления требуемых структур в стеклянных подложках с необходимой точностью.

3. Разработан методический подход для оценки влияния погрешности технологии изготовления на функциональные характеристики МФЧ (объем элемента и гидравлическое сопротивление канала), учитывающий расчетные и полученные значения геометрических размеров каналов.

4. Разработана новая методика фиксации бактерий Е. Coli на пленке агар-агара (массовая доля 1,8 % в исходном растворе), нанесенной на поверхность слюды, которая позволяет предотвратить ее набухание и деформацию,

5

возникающую при проведении измерений методом АСМ в дистиллированной воде, визуализировать группы и отдельные бактерии, а также оценить их геометрические размеры.

Достоверность научных результатов обеспечивается корректностью постановки задач исследования, в том числе при проведении математического моделирования, воспроизводимостью результатов измерений, статистической обработкой полученных результатов, соответствием расчетных и экспериментальных данных, включая исследование тестовых объектов с заданными характеристиками. Результаты диссертации были представлены на международных и всероссийских конференциях, форумах, ассамблеях и школах, а также опубликованы в журналах рекомендуемых ВАК.

Практическая значимость определяется:

1) разработанными топологиями и экспериментальными образцами МФЧ с интегрированными гидродинамическими ловушками (П-образная ловушка, сеть параллельных наноразмерных каналов с заходами) и для гидродинамического разделения частиц, которые позволяют исследовать микрочастицы методами KJICM и оптической микроскопии;

2) разработанной технологией изготовления микроструктур в стекле К8 методом лазерной литографии с последующим кислотным травлением, которая дает возможность создавать функциональные структуры с заданной точностью размеров.

Положения, выносимые на защиту

1. Предложенные конструкции гидродинамических ловушек (П-образная ловушка, сеть параллельных наноразмерных каналов с заходами) позволяют выделять из потока жидкости, удерживать и исследовать отдельные микрочастицы (полимерные частицы размером 3 мкм, бактерии E.Coli) или их группы методом KJICM.

2. Результаты моделирования траекторий движения полимерных частиц разных размеров (3 и 10 мкм) в реакционной камере МФЧ для гидродинамического разделения частиц и полученные экспериментальные данные свидетельствуют о возможности дискриминации частиц по геометрическим размерам, что позволяет создавать новые информационно-измерительные приборы.

3. Технологии изготовления микро- и наноразмерных структур в подложках из стекла К8 методом лазерной литографии с последующим кислотным травлением и методом СИП, метод отливки ПДМС по шаблону, а также метод герметизации за счет использования адгезии между стеклом и ПДМС применимы для создания гибридных (полимер-стеклянных) МФЧ с функциональными элементами, геометрические размеры которых выполнены с заданной точностью, определяемой требуемыми аналитическими хар актер истиками.

4. Методический подход, разработанный для оценки объема элемента и гидравлического сопротивления канала в зависимости от технологии

изготовления (с учетом расчетных и полученных значений геометрических размеров каналов), позволяет оценить ее влияние на функционирование МФЧ: удерживание микрочастиц и разделение их по геометрическим размерам.

5. Методика фиксации бактерий E.Coli на пленке агар-агара (массовая доля 1,8 % в исходном растворе), нанесенной на поверхность слюды, позволяет предотвратить ее набухание и деформацию при проведении измерений методом АСМ в дистиллированной воде, что дает возможность получать изображения протяженных участков, визуализировать отдельные бактерии и их группы, а также определять их геометрические размеры.

Реализация работы

Результаты диссертации использовалась при выполнении государственных контрактов в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (№ П557, №14.740.11.1218) и проектов по программе У.МН.И.К. (№ 14193, № 16939).

Апробация работы

Основные результаты исследований и разработок, представленные в диссертации, докладывались и обсуждались на следующих конференциях, форумах, ассамблеях и школах: VIII Всероссийская межвузовская конференция молодых ученых (Санкт-Петербург, 2011); European Materials Research Society 2011 Spring Meeting (Nice, France, 2011); International Conference on Materials for Advanced (Suntec, Singapore, 2011); Lab-on-a-Chip European Congress (Hamburg, Germany, 2011); 16-я Санкт-Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2011); I Всероссийский конгресс молодых ученых (Санкт-Петербург, 2012); II Научно-практическая конференция молодых ученых РАН (Санкт-Петербург, 2012); 4-я Всероссийская конференция «Аналитические приборы» (Санкт-Петербург, 2012); Conference «Microfluidics 2012» (Heidelberg, Germany, 2012); IV Международная научно-практическая конференция «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, медицине, фармакологии» (Санкт-Петербург, 2012); IV Международный Казанский инновационный нанотехнологический форум (Казань, 2012); II Всероссийский конгресс молодых ученых (Санкт-Петербург, 2013); Ш Научно-практическая конференция молодых ученых РАН (Санкт-Петербург, 2013).

Публикации

Основные результаты диссертации изложены в 21 печатной работе, из них 6 опубликованы в журналах, входящих в перечень рекомендуемый ВАК.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, списка литературы из 133 наименований. Текст диссертации изложен на 187 страницах, содержит 42 рисунка и 19 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цель и задачи работы. Изложены научная новизна и практическая значимость работы, сформулированы положения, выносимые на защиту.

Первая глава представляет собой аналитический обзор, посвященный МФУ для изучения биологических объектов (клеток, бактерий и т.д.), а также исследованиям и разработкам, направленным на проведение измерений методом АСМ в жидких средах. Обсуждаются методы моделирования, применяемые при расчете функциональных элементов МФУ, вопросы контроля и измерения их характеристик.

Перспективным направлением совершенствования МФУ является интегрирование в них микро- и наноразмерных элементов для выделения целевых биологических объектов, их фиксации или разделения. Существует тенденция использования МФУ совместно с приборами микроскопии высокого разрешения (KJICM, АСМ и др.), которые позволяют проводить изучение объектов с высоким пространственным разрешением.

Для моделирования потоков жидкости в МФУ в случае, когда размеры каналов и функциональных структур устройства лежат в интервале от сотен микрон до нескольких сотен нанометров, можно применять гипотезу сплошной среды и решать уравнения Навье-Стокса численными методами, например, методом конечных разностей, методом конечных объемов, методом конечных элементов.

На данный момент нет единого подхода, позволяющего измерять механические величины МФУ в процессе изготовления и при контроле готового изделия. Это обусловлено тем, что реализация необходимого набора операций для постановки анализа или исследования заключается в исполнении всех функциональных элементов на МФУ, размеры которых могут различаться на несколько порядков. Таким образом, актуальна разработка и развитие методов, позволяющих характеризовать МФУ, состоящие из различных материалов и имеющие сложную геометрию функциональных элементов, в широком диапазоне линейных размеров. Необходимо совершенствовать методы контроля и измерений геометрических размеров элементов, которые оказывают непосредственное влияние на аналитические и функциональные характеристики МФУ.

В связи с тем, что при изучении методом АСМ в жидкости микро- и наноразмерные объекты должны находиться в неподвижном состоянии, развиваются новые методы пробоподготовки, обеспечивающие фиксацию объектов на время измерений. В качестве рабочей жидкости используют преимущественно воду. Отсутствие информации о влиянии жидких сред с разным значением рН на особенности проведения и получаемые методом АСМ результаты измерений геометрических размеров, являются достаточной мотивацией для выполнения подобных исследований, необходимых для успешной разработки совместимых с атомно-силовым микроскопом МФЧ.

В заключительном разделе первой главы с учетом анализа литературных данных сформулированы актуальная цель и задачи исследования.

Вторая глава посвящена компьютерному моделированию массопереноса жидкости в микроканале и гидродинамических ловушках, траекторий движения микрочастиц разного размера в реакционной камере МФЧ и разработке новых топологий МФЧ.

Полученные при решении уравнения Навье-Стокса методом конечных элементов в рамках гипотезы сплошной среды (использовался программный пакет СОМБОЬ МиШрЬузкБ) результаты показали (рисунок 1), что П-образная ловушка обладает меньшим гидравлическим сопротивлением (Л^ = 310ь Пас/м") по сравнению с ловушкой в виде сети параллельных наноразмерных каналов с заходами (11 ¡¡ус] = 1,1-Ю17 Пас/м3). Данное обстоятельство обусловливает возможность постановки экспериментов по фиксации микрочастиц размером 3 мкм (сопоставим с размером биологических объектов) в П-образных ловушках за счет движения пробы под действием капиллярных сил. Для обеспечения потока жидкости 1 нл/с через сеть наноразмерных каналов требуется приложить давление ~ 105 Па, что превышает максимальную разность давлений (104 Па), которую можно получить за счет капиллярных сил в канале с поперечным сечением 10 х 50 мкм. В связи с этим необходимо использовать насос для создания потока жидкости.

Поле скоростей, мм/с

Поле скоростей, мм/с

20 40 60 80 100120

мкм

0,8

0.6

0.2

а)

Результаты гидродинамического

Рисунок 1. Профили ПОЛЯ скоростей в различных топологиях гидродинамических ловушек: а) сеть из 10 параллельных наноразмерных каналов с заходами (ширина каналов 250 нм, длина 8,5 мкм): б) П-образная ловушка (ширина микроканалов 2,4 мкм, ширина наноразмерных каналов 350 нм, размеры внутренней области ловушки 3,5 х 2,45 мкм). Расход жидкости 1 нл/с.

мкм

б)

моделирования методом конечных элементов разделения частиц (сопоставимых с размерами биологических объектов) в рабочей зоне МФЧ (рисунок 2) свидетельствуют о различии траекторий движения частиц разных размеров (3 и 10 мкм) в реакционной камере. Определено, что траектория движения зависит не только от размера частицы, но и от ее положения относительно оси симметрии в подводящем канале. Частицы размером 3 мкм с начальным положением в центре подводящего канала движутся ниже 10 мкм частиц на 5 мкм (значение на расстоянии 1000 мкм по оси X), а при смещении на 25 мкм вверх относительно оси симметрии канала траектория 3 мкм частиц выше 10 мкм частиц на 150 мкм. Траектории движения 10 мкм частиц будут практически одинаковыми при различных начальных положениях в подводящем канале.

9

Следовательно, при движении частиц по определенным траектория в подводящем канале, возможна их дискриминация по геометрическим размерам

Рисунок 2. Схематическое изображение топологии рабочей зоны МФЧ для гидродинамического разделения частиц и траектории частиц 3 и 10 мкм, полученные при моделировании. Расход жидкости 1 мкл/мин.

По результатам моделирования были предложены топологии МФЧ:

а) с параллельными микроканалами и гидродинамическими ловушками (П-образная ловушка, сеть параллельных наноразмерных каналов с заходами);

б) ХК с П-образными ловушками и дополнительными микроканалами;

в) для гидродинамического разделения частиц в потоке. Эскизы центральных областей заготовок чипов для фиксации микрочастиц (без ловушек) приведены на рисунке 3 (а-в).

Третья глава посвящена вопросам, связанным с технологией изготовления МФЧ разных топологий, контролем их геометрических размеров, оценкой влияния погрешности изготовления на функциональные характеристики МФЧ (объем элемента и гидравлическое сопротивление канала). Обсуждаются выбор материалов для изготовления МФЧ, метод герметизации, а также варианты гидравлических интерфейсов и вспомогательных устройств для загрузки/слива жидкости.

Заготовки МФЧ для топологий с параллельными микроканалами и ХК изготавливались из стекла К8 методом фотолитографии с последующим кислотным травлением. Контроль наиболее важных для функционирования геометрических размеров заготовок МФЧ (рисунок 3, г-е) показал, что

минимальные и максимальные значения полученных оценок укладываются в доверительный интервал с доверительной вероятностью равной 0,95. Линейные и угловые размеры функциональных элементов заготовок МФЧ выдержаны с отклонением не более 11 % в сравнении с размерами, выбранными при разработке топологий МФЧ.

г) д) е)

Рисунок 3. Эскизы и оптические изображения центральных областей заготовок МФЧ: а, в - с параллельными микроканалами; б, г - топологии X (МФЧ топологии ХК); в, д - топологии К (МФЧ топологии ХК).

Гидродинамические ловушки в заготовках МФЧ изготавливались методом СИП. Контроль наиболее важных геометрических размеров ловушек Ь1-Ь5 в заготовках МФЧ с параллельными микроканалами (рисунок 4) подтвердил, что минимальные и максимальные значения полученных оценок укладываются в доверительный интервал с доверительной вероятностью равной 0,95. Математическое ожидание оценок отличается не более чем на 16 % в сравнении с размерами, выбранными при моделировании.

Рисунок 4. СЭМ изображения гидродинамических ловушек, сформированных в заготовках МФЧ топологии с параллельными микроканалами: а) сеть параллельных наноразмерных каналов с заходами; 6) отдельный наноразмерный канал с заходами; в) П-образная

ловушка.

Основой технологии формирования микроструктур с разрешением до 1 мкм в стекле К8 являлся метод лазерной литографии с последующим кислотным травлением. Для изучения особенностей данной технологии были проведены исследования по изготовлению тестовых структур (прямоугольных, треугольных и круглых). Травление стекла КВ выполнялось в течение 5, 10 и 20 минут. Контроль геометрических размеров изготовленных структур показал, что минимальные и максимальные значения полученных оценок размеров укладываются в доверительный интервал с доверительной вероятностью равной 0,95. Выявлено, что травление материала идет под углом в ~ 45°, имеет место скругление острых краев, а скорость травления стекла практически одинакова во всех направлениях и составляет ~ 0,8 мкм/мин. На примере круглых структур разного исходного диаметров (№ 1 - 80 мкм, № 2 - 60 мкм, №3-40 мкм) была продемонстрирована возможность нахождения аппроксимирующих функций для режимов травления стекла способом приведения функциональной зависимости к форме линейного тренда в новой системе координат (рисунок 5), что может использоваться при необходимости стравливания слоя стекла толщиной более 16 мкм. Полученные результаты позволяют подобрать режимы для изготовления микроструктур с заданными

Рисунок 5. Зависимости диаметра круглых структур от времени травления, построенные на основе

экспериментальных данных и значений расчитаных е исполыо вание м аппроксимирующих функций.

Время травления, мин

Рассмотренная технология была применена при создании шаблонов для получения МФЧ из ПДМС (рисунок 6, а). Контроль наиболее значимых геометрических размеров шаблонов Ь1-Ь4 (рисунок 6, б) показал, что минимальные и максимальные значения оценок размеров укладываются в доверительный интервал с доверительной вероятностью равной 0,95. Математические ожидания оценок отличаются не более 3,6 % от значений размеров топологии МФЧ для гидродинамического разделения частиц.

МФЧ из ПДМС изготавливались методом отливки по шаблону, который заключался в нанесение смеси основы с отвердителем ПДМС БЛдагсЗ 184 (Ооу/Согшгщ, США) на шаблон, дегазации и последующего термостатирования при температуре 65 °С в течение 4 часов. Контроль геометрических размеров Ь1-Ь4 (соответствуют рисунку 6, б) функциональных элементов МФЧ из ПДМС

геометрическими размерами в подложках из стекла К8.

Круглые структуры № 1

» Экспериментальные данные

80 70 60 50 40 30 20 10 о

«1

ч

X Аппроксимирующая функция Круглые структуры N° 2

—♦-»Экспериментальные данные

Аппроксимирующая функция Круглые структуры № 3

-♦-»Экспериментальные данные ■ Аппроксимирующая функция

10 20 30 40 50 60 70

выявил, что минимальные и максимальные значения полученных оценок размеров укладываются в доверительный интервал, а также не выявил существенных отличий (отклонение не более чем на 2,8 %) значений полученных оценок от размеров топологии МФЧ. Таким образом, точность изготовления структур МФЧ из ПДМС в основном определяется точностью изготовления структур шаблона (рисунок 7).

а) б)

Рисунок 6. Изображения шаблона для изготовления МФЧ для гидродинамического разделения частиц из ПДМС (а) и центральной области шаблона (б).

Для оценки погрешности технологии изготовления микроразмерных элементов и их влияния на функциональные характеристики МФЧ был предложен методический подход, на основе которого рассчитаны относительная погрешность изготовления объема элемента подводящего канала и гидравлическое сопротивление для расчетных и экспериментальных значений геометрических размеров каналов. Оценка относительной погрешности изготовления объема элемента канала показала, что наибольшие значения погрешности (до 10,7 %) ожидаются в случае изготовления МФЧ из ПДМС путем отливки по шаблону, а наименьшие - при изготовлении чипов из стекла К8 методом фотолитографии с кислотным травлением (до 3,5 %). Это связано с большим числом технологических операций, каждая из которых вносит вклад в итоговую погрешность. Изучение оценок гидравлического сопротивления выявило, что для всех изготовленных топологий МФЧ сопротивление подводящих каналов меньше, чем соответствующие оценки для расчетных значений геометрии каналов.

Герметизация МФЧ выполнялась методом, связанным с использованием адгезионных свойств ПДМС и стекла.

Были изготовлены гидравлические интерфейсы для МФЧ, позволяющие выполнять загрузку/слив проб и буферных растворов при помощи внешнего насоса.

9D 101 МКМ

а)

г— 1 1

. J j

! « шаблон

-*-МФЧ

11.6

"I'll " : I 1 г 1

1

1

« шаблон -•-МФЧ

161,4

626

626

11,6 МКМ

б)

-шаблон -МФЧ

Рисунок 7. Сравнение разброса ,значений геометрических размеров для шаблона и МФЧ из ПДМС: а) Ы\ б) 12\ в) ЬЗ- г) и. Обозначения Ы-Ь4

соответствуют рисунку 6 (б).

е) г)

Четвертая глава посвящена апробации МФЧ, изучению особенностей проведения измерений методом АСМ в различных жидких средах, а также отработке методики фиксации бактерий E.Coli в дистиллированной воде на время измерений методом АСМ.

На базе микроскопа TCS SL (Leica, Германия) была собрана экспериментальная установка для испытания МФЧ. Для загрузки/слива проб и буферных растворов использовались перистальтический насос BT100-1F (LongerPump, США) и шприцевой насос 70-2209 (Harvard Apparatus, США), которые при помощи капилляров подключались к одному из гидравлических интерфейсов.

Для всех топологий МФЧ были проведены исследования по распространению раствора флуоресцеина через микро- и наноразмерные структуры, которые показали, что раствор протекает через них без образования подтеков на границе между двумя материалами (стекло К8 и ПДМС), что подтверждает эффективность выбранного метода герметизации.

Испытания по фиксации флуоресцентно-меченных полимерных микрочастиц размером 3 мкм в ловушках МФЧ топологии с параллельными микроканалами (рисунок 8, а, б) подтвердили возможность удержания частиц из потока жидкости в конструкциях гидродинамических ловушек, что соответствует полученным при моделировании результатам (рисунок ]). Кроме того, данные испытания продемонстрировали отсутствие существенного влияния погрешности изготовления функциональных структур на

14

аналитические характеристики МФЧ (анализируемый объем пробы, возможность удержания микрочастиц).

Для подтверждения возможности фиксации биологических объектов в П-образной ловушке были проведены испытания с использованием флуоресцентно-меченных бактерий E.Coli (рисунок 8, в, г). Показано, что в П-образной ловушке МФЧ топологии с параллельными микроканалами удерживается до двух бактерий, а в ловушках топологии X (МФЧ топологии ХК) группы из трех и более бактерий.

Рисунок 8.

Изображения

результатов

фиксации:

флуоресцентно-

меченых

микрочастиц

размером

3 мкм в ловушке в

виде сети

параллельных

наноразмерных

каналов с заходами

(а) и в П-образной

ловушке (б) , двух

бактерий E.Coli (в)

и их группы /г)

в П-образной

ловушке.

в) г)

Испытания МФЧ из ПДМС для гидродинамического разделения частиц в потоке с использованием флуоресцентно-меченных полимерных микрочастиц размерами 3 и 10 мкм (рисунок 9) подтвердили, что: а) частицам свойственны различные траектории движения в реакционной камере МФЧ; б) траектории зависят не только от размера частиц, но и от их положения относительно оси симметрии подводящего канала, что соответствует расчетным данным (рисунок 2); в) величина разделения частиц по оси У на расстоянии, превышающем середину реакционной камеры по оси X, полученная в ходе экспериментов, совпадает с результатами моделирования. Таким образом, подтверждена возможность дискриминации частиц в предложенной конструкции МФЧ по их геометрическим размерам.

Направление движения жидкости

200 мкм

Результаты моделирования:

----частица 3 мкм

-частица 10 мкм

Эксперимент э.тьиые данные: частица 3 мкм частица 10 мкм

Рисунок 9. Траектории движения частиц размером 3 и 10 мкм в реакционной камере МФЧ для

гидродинамического разделения частиц; сравнение экспериментальных данных и результатов моделирования.

Оценка влияния жидких сред с разной величиной рН (дистиллированная вода, PBS, боратный буфер, NaOH ОД М, NaOH 0,5 М) на результаты измерений геометрических размеров калибровочной решётки методом АСМ (использовался сканирующий зондовый микроскоп ИНТЕГРА Аура (НТ-МДТ, Россия)) показала, что для работы в данных средах наиболее подходящими являются длинные кантилеверы стандартных зондов SNL-10 (Bruker, США) с жесткостью (0,06 - 0,12 НУм). Для достижения наилучшего соответствия между экспериментальными и эталонными значениями размеров калибровочной решетки следует использовать полуконтактный режим сканирования (рисунок 10), а для получения наилучшего качества изображения предпочтителен контактный режим. Наиболее быстрый подвод стандартных зоцдов и подбор параметров сканирования достигаются при использовании сред: PBS, NaOH.

Рисунок 10. Гистограмма зависимости погрешностей оценок геометрических размеров калибровочной решетки при ее измерениях в различных средах с использованием длинного кантилевера АСМ зонда в полуконтактном режиме. Среды: 1) воздух; 2) дистиллированная вода; 3) PBS; 4) боратный буфер; 5) NaOH 0,1М; 6) NaOH 0,5М.

3 4

Номер среды

Отработка методики фиксации бактерий E.Coli в дистиллированной воде с регистрацией результатов методом KJICM показала, что агар-агар (массовая доля 1,8 % в исходном растворе) наилучшим образом подходит для решения данной задачи. Нанесение пленки агар-агара на поверхность слюды позволяет предотвратить ее набухание, деформацию и визуализировать методом АСМ протяженные участки исследуемой поверхности, что обеспечивает получение изображений групп и отдельных бактерий (рисунок 11), а также оценку их геометрических размеров.

а) б)

Рисунок 11. АСМ изображения бактерий E.Coli, зафиксированных на пленке агар-агара (массовая доля 1,8 % в исходном растворе) на слюде в жидкости: а) отдельная бактерия:

б) группа из трех бактерий.

В заключении приведены основные результаты работы.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. На основании проведенного моделирования массопереноса жидкости в топологиях гидродинамических ловушек и движения микрочастиц размерами 3 и 10 мкм в реакционной камере МФЧ продемонстрирована возможность удержания и гидродинамического разделения частиц в потоке, а также предложены оригинальные топологии МФЧ.

2. Методом СИП сформированы гидродинамические ловушки в заготовках МФЧ из стекла К8, а методом СЭМ проведен контроль их функционально значимых геометрических размеров. Экспериментально установлено, что отклонение размеров гидродинамических ловушек в МФЧ с параллельными микроканалами составляет не более 16 %, это не приводит к заметному влиянию на возможность удержания микрочастиц.

3. Выполнены технологические исследования по изготовлению тестовых микроструктур в стекле К8 методом лазерной литографии с кислотным травлением и проведен контроль их геометрических размеров методом оптической микроскопии. Установлены воспроизводимые режимы изготовления структур в стеклянных подложках, обеспечивающие требуемую точность геометрических размеров с доверительной вероятностью не менее 0,95.

4. Продемонстрирована возможность изготовления МФЧ из ПДМС для гидродинамического разделения частиц с использованием предложенной технологии. Контроль наиболее значимых геометрических размеров шаблонов и МФЧ, проведенный методом оптической микроскопии, показал, что отклонение полученных размеров от расчетных значений составляет не более чем 3,6 и 2,8 % соответственно, а точность изготовления структур МФЧ определяется точностью изготовления структур шаблона.

5. Предложен методический подход для оценки влияния технологии изготовления на погрешность функциональных характеристик МФЧ (объем элемента и гидравлическое сопротивление канала) с учетом расчетных и полученных геометрических размеров каналов. Выявлено, что наименьшая погрешность достигается при использовании метода фотолитографии с кислотным травлением.

6. Проведены испытания МФЧ с гидродинамическими ловушками подтвердившие их эффективность для выделения и удерживания отдельных микрочастиц (полимерные частицы размерами 3 мкм, бактерии E.Coli) или их групп в потоке жидкости при исследовании методом KJICM Испытания МФЧ для гидродинамического разделения микрочастиц (полимерные частицы размерами 3 и 10 мкм) подтвердили возможность их дискриминации по геометрическим размерам и регистрации траекторий методом оптической микроскопии.

7. Результаты экспериментов по изучению особенностей проведения измерений геометрических размеров калибровочной решетки методом АСМ в жидких средах (дистиллированная вода, PBS, боратный буфер, NaOH) показали, что для работы в них наиболее подходят длинные кантилеверы зондов SNL-10 с жесткостью 0,06 - 0,12 Н/м, а лучшими средами с точки зрения быстроты подвода зондов и подбора параметров сканирования являются: PBS, NaOH.

8. Разработана методика фиксации бактерии E.Coli в дистиллированной воде на пленки агар-агара (массовая доля 1,8 % в исходном растворе), нанесенной на поверхность слюды, которая позволяет предотвратить набухание и деформацию пленки в воде, получать изображения групп и отдельных бактерий методом АСМ а также оценивать их геометрические размеры.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

В изданиях, из перечня ВАК

1. Евстрапов A.A., Мухин И. С., Кухтевич И. В., Букатин A.C. Применение ионной литографии для формирования наноразмерных каналов микрофлюидных чипов в стеклянных подложках // Научно-технический вестник СПбГУ ИТМО. 2010. № 4. С. 59-64.

2. Евстрапов A.A., Мухин КС., Кухтевич КВ., Букатин A.C. Метод сфокусированного ионного пучка при формировании наноразмерных структур в микрофлюидных чипах // Письма в ЖТФ. 2011. Т. 37. №20. С. 32-40.

3. Кухтевич КВ., Букатин A.C., Мухин КС., Евстрапов A.A. Микрофлюидные чипы с интегрированными наноразмерными структурами для фиксации биологических объектов // Научное приборостроение. 2011. Т. 21. №3. С. 17-22.

18

4. Кухтевич И.В., Букатнн А.С., Мухин И.С., Евстрапов А.А. Микрофлюидные чипы для исследования биологических объектов методами микроскопии высокого разрешения // Научно-технический вестник информационных технологий, механики и оптики. 2012. № 1. С. 111-115.

5. Evstrapov А.А., Mukhin I.S., Bukatin A.S., Kuhtevich I.V. Ion and electron beam assisted fabrication of nanostructures integrated in microfluidic chips // Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 2012. V. 282. P. 145-148.

6. Кухтевич И.В., Жуков М.В., Чубинский-Надеждин В.И., Букатии А.С., Евстрапов А.А. Фиксация бактерий E.Coli на подложке для измерений в жидкости методом атомно-силовой микроскопии // Научное приборостроение. 2012. Т. 22. №4. С. 56-61.

Публикации в других изданиях

7. Кухтевич И.В., Букатии А.С., Мухин И.С. Биосенсоры на основе микро- и нанофлюидных технологий // Сборник трудов VIII Всероссийской межвузовской конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 2011). С. 345-346.

8. Mukhin I.S., Evstrapov A. A., Kuhtevich I.V., Bukatin A.S., Golubok А.О. Ion and electron beam assisted fabrication of nanostructures integrated in microfluidic chips // Proceedings of EMRS2011 Spring Meeting (Nice, France, 2011). PB251.

9. Bukatin A., Mukhin I., Kukhtevich I., Evstrapov A. Focused ion beam lithography for creating microfluidic chips with integrated functional nanostructures // Abstracts of ICMAT 2011 (Suntec, Singapore, 2011). P. 35.

10. Kukhtevich I. V, Evstrapov A. A., Bukatin A.S., Mukhin I.S. Microfluidic chips with nanostructures for investigation of biological objects by methods of high resolution microscopy // Abstracts of Lab-on-a-Chip European Congress (Hamburg, Germany, 2011). Электронный ресурс: http://www.eposters.net/index.aspx?id=3588

11 .Кухтевич И.В. Микрофлюидные чипы с интегрированными микро- и наноразмерными структурами // Сборник трудов 16-й Санкт-Петербургской ассамблеи молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2011). С. 114.

12. Кухтевич И.В., Букатии А.С., Мухин И.С., Чубинский-Надеждин В.И., Евстрапов А.А. Микрофлюидные чипы для исследования биологических объектов методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии // Сборник тезисов I Всероссийского конгресса молодых ученых (Санкт-Петербург, 2012). С. 361-362.

13. Кухтевич И.В., Евстрапов А.А. Тенденции развития микрофлюидных аналитических систем на чипах для исследования биологических проб // Сборник тезисов П Научно-практической конференции молодых ученых РАН «Фундаментальная и прикладная наука глазами молодых ученых. Успехи, перспективы, проблемы и пути их решения» (Санкт-Петербург, 2012). С. 18-20.

14. Евстрапов А.А., Буляница А.Л., Рудницкая Г.Е., Лукашенко Т.А., Есикова Н.А., Тупик А.Н., Кухтевич И.В., Букатии А.С. Аналитические приборы для исследований биологических проб на основе микрофлюидных платформ //

Сборник тезисов докладов 4-й Всероссийской конференции «Аналитические приборы» (Санкт-Петербург, 2012). С. 102.

15. Kukhtevich I.V., BukatinA.S., Chubinskiy-Nadezhdin V.l., Mukhin I.S., Evstrapov A.A. Microfluidic chips with traps for single cell analysis // Proceedings of Microfluidics 2012 (Heidelberg, Germany, 2012). P. 153.

16. Жуков M.B., Кухтевич И.В., Букатип A.C., Чубинский-Надеждин В.И., Евстрапов A.A. Фиксация бактерий E.Coli в жидкости во время измерений методом атомно-силовой микроскопии // Сборник тезисов IV Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, медицине, фармакологии» (Санкт-Петербург, 2012). С. 213-216 .

17. Кухтевич И.В., Букатин A.C., Мухин И.С., Чубинский-Надеждин В.К, Евстрапов A.A. Микрофлюидные чипы с интегрированными микро- и наноразмерными функциональными элементами для исследования биологических объектов // Сборник тезисов IV Международного Казанского инновационного нанотехнологического форума (Казань, 2012). С. 307-309.

18.Белоусов К.И., Кухтевич И.В. Моделирование процессов массопереноса и фиксации микрочастиц в микрофлюидных чипах с гидродинамическими ловушками // Сборник тезисов П Всероссийского конгресса молодых ученых (Санкт-Петербург, 2013). С. 271-273.

19. Жуков М.В. Кухтевич И.В. Выявление особенностей проведения измерений методом атомно-силовой микроскопии в жидких средах // Сборник тезисов II Всероссийского конгресса молодых ученых (Санкт-Петербург, 2013). С. 325-326.

20. Кухтевич И.В., Жуков М.В. Изучение бактерий E.Coli в жидкости методом атомно-силовой микроскопии // Сборник тезисов П Всероссийского конгресса молодых ученых (Санкт-Петербург, 2013). С. 331-332.

21 .Кухтевич И.В., Евстрапов A.A. Микрофлюидные устройства для исследования биологических проб: классификация по функциональному назначению и последние разработки // Сборник тезисов Ш Научно-практической конференции молодых ученых РАН «Фундаментальная и прикладная наука глазами молодых ученых. Успехи, перспективы, проблемы и пути их решения» (Санкт-Петербург, 2013). С. 24-27.

Корректор Позднякова Л.Г.

Тиражирование и брошюровка выполнены в учреждении «Университетские телекоммуникации» 197101, Санкт-Петербург, Саблинская ул., д. 14 Тел. (812) 233-46-69 Объем 1,25 п.л. Тираж 100 экз.

Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики

На правах^ук^писи

П/ ППЛ 7 / ; /

¿и I ООЧОСУ

Кухтевич Игорь Владимирович

ИССЛЕДОВАНИЕ И РАЗРАБОТКА МИКРОФЛЮИДНЫХ УСТРОЙСТВ ДЛЯ АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ МЕТОДАМИ МИКРОСКОПИИ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ

Специальность: 05.11.14- Технология приборостроения

Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель: Доктор технических наук Евстрапов А. А.

Санкт-Петербург - 2013

Содержание

Сокращения........................................................................................................5

Введение...............................................................................................................7

Глава 1. Литературный обзор........................................................................15

1.1. Классификация микрофлюидных устройств для анализа и исследования биологических объектов.........................................................15

1.2. Тенденции развития современных микрофлюидных устройств

для анализа и исследования биологических объектов..................................32

1.3. Методы моделирования, применяемые при расчете функциональных элементов микрофлюидных устройств............................34

1.4. Контроль и измерение характеристик функциональных элементов микрофлюидных устройств............................................................................36

1.5. Проведение измерений методом атомно-силовой микроскопии в жидких средах.................................................................................................46

1.6. Постановка цели и задачи исследования..............................................54

Глава 2. Моделирование массопереноса жидкости и движения микрочастиц в микрофлюидных устройствах. Разработка топологий микрофлюидных устройств............................................................................55

2.1. Моделирование массопереноса жидкости в чипах с ловушками

для фиксации микрочастиц............................................................................55

2.2. Моделирование процесса гидродинамического разделения частиц.....60

2.3. Топологии микрофлюидных чипов с гидродинамическими ловушками для фиксации микрочастиц.........................................................62

2.4. Топология микрофлюидного чипа для гидродинамического разделения частиц...........................................................................................67

2.5. Результаты и их обсуждение..................................................................68

2.6. Заключение к главе..................................................................................70

Глава 3. Изготовление микрофлюидных устройств и контроль их характеристик...................................................................................................71

3.1. Материалы микрофлюидных чипов........................................................71

3.2. Изготовление стеклянных микрофлюидных чипов с гидродинамическими ловушками и контроль их

геометрических размеров...............................................................................72

3.3. Отработка технологического процесса изготовления микроструктур в стекле методом лазерной литографии с последующим кислотным травлением..........................................................85

3.4. Изготовление микрофлюидных чипов из полидиметилсилоксана.....100

3.5. Оценка влияния погрешности изготовления на объем элемента

и гидравлическое сопротивление канала.....................................................106

3.6. Герметизация микрофлюидных чипов разных топологий...................112

3.7. Гидравлические интерфейсы для микрофлюидных чипов и вспомогательные устройства........................................................................114

3.8. Результаты и их обсуждение.................................................................117

3.9. Заключение к главе................................................................................122

Глава 4. Экспериментальные исследования и тестирование..................124

4.1. Испытания микрофлюидных устройств................................................124

4.1.1. Экспериментальная установка для проведения испытаний микрофлюидных чипов.................................................................................124

4.1.2. Проверка функционирования микрофлюидных чипов при

помощи раствора флуоресциина..................................................................125

4.1.3. Экспериментальные исследования по фиксации микрообъектов

в микрофлюидных чипах с ловушками.......................................................127

4.1.4. Экспериментальные исследования по разделению микрочастиц

в микрофлюидных чипах для гидродинамического разделения................131

4.2. Измерения микрообъектов и тестовых структур в жидких средах

методом атомно-силовой микроскопии.......................................................134

3

4.2.1. Изучение особенностей проведения измерений методом АСМ в жидких средах...............................................................................................134

4.2.2. Исследование калибровочной решетки TGQ1 методом сканирующей электронной микроскопии....................................................150

4.2.3. Визуализация биологических объектов в жидкой среде методом атомно-силовой микроскопии......................................................................151

4.3. Результаты и их обсуждение.................................................................159

4.4. Заключение к главе................................................................................164

Заключение.....................................................................................................166

Список публикаций по материалам работы..............................................168

Список литературы........................................................................................172

Сокращения

EpCAM - epithelial-cell-adhesion-molecule (молекулы, находящиеся на эпителиальных клетках)

GFP - green fluorescent protein (зеленый флуоресцентный белок) PBS - phosphate buffered saline (натрий-фосфатный буфер) ACM - атомно-силовая микроскопия АФ - автофлуоресценция

ДЛСМ - двухфотонная сканирующая лазерная микроскопия ДМФК - динамическая микроскопия фазового контраста ИМ - интерференционная микроскопия К8 - крон 8

KAPP - когерентное антистоксовое Рамановское (комбинационное) рассеивании

ККТ - красные кровяные тельца

КЛСМ - конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

МКО - метод конечных объемов

МКР - метод конечных разностей

МКЭ - метод конечных элементов

МФУ - микрофлюидное устройство

МФЧ - микрофлюидный чип

ПДМС - полидиметисилоксан

ПК - поликарбонат

ПММА - полиметилметакрилата

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РЭФР - рецептор эпидермального фактора роста

СИ - сканирующая интерферометрия

СИП - сфокусированный ионный пучок

СМИП - сканирующая микроскопия ионной проводимости СЭМ - сканирующая электронная микроскопия ЯМР - ядерный магнитный резонанс

Введение

Актуальность темы

Постановка всех стадий и этапов анализа на одном компактном устройстве - суть концепции «лаборатория на чипе» (lab on a chip), которая успешно применяется при исследовании жидких многокомпонентных проб и биологических объектов (клеток, бактерий и др.). Основой «лаборатории на чипе» является микрофлюидное устройство (МФУ), которое содержит различные функциональные элементы: каналы, смесители, нагреватели, фильтры, резервуары, реакционные камеры, устройства разделения пробы, сенсоры и т.д. Данные элементы предназначены для выполнения аналитических, технологических и прочих операций с пробой. Исходя из задач анализа формируется перечень операций, реализуемых в МФУ, что определяет набор необходимых функциональных элементов.

Планарной реализацией МФУ без вспомогательных элементов (гидравлический интерфейс, фитинги и т.д.) является микрофлюидный чип (МФЧ). Одним из направлений развития МФЧ является интегрирование в них микро- и наноразмерных элементов, позволяющих выделять целевые биологические объекты, фиксировать (или разделять) и детектировать их. Снижение стоимости МФЧ может быть обеспечено за счет повышения доступности современных методов изготовления, применяемых в микро- и нанотехнологиях (лазерная литография, ионная литография и др.), использования полимерных материалов - полидиметисилоксан (ПДМС), поликарбонат и т.д., которые позволяют оперативно получать прототипы чипов, например, методом отливки по шаблону.

Прослеживается тенденция использования МФЧ совместно с

приборами микроскопии высокого разрешения (конфокальной лазерной

сканирующей микроскопии (KJICM), атомно-силовой микроскопии (АСМ) и

др.), позволяющими осуществлять визуализацию биологических объектов с

7

высоким пространственным разрешением и получать новую информацию о них. При проведении исследований методом АСМ в жидкости чаще всего используют воду, однако, изучение биологических объектов требует применения растворов с различным водородным показателем (pH), в частности натрий-фосфатного буфера (phosphate buffered saline, PBS). Для фиксации биологических объектов на время их измерений методом АСМ следует использовать специальные методы пробоподготовки (химическая обработка пробы, применение гелей и т.д.), которые рассчитаны на ограниченный круг объектов, что приводит к необходимости адаптации методов под конкретную задачу.

Таким образом, требуется создание доступных в лабораторных условиях МФЧ с интегрированными микро- и наноразмерными функциональными элементами для исследования биологических объектов методами микроскопии, т.к. эти МФЧ позволяют осуществлять манипуляции отдельными объектами или их небольшими группами, проводить исследования, которые невозможно реализовать методами, традиционно применяемыми в биологии и медицине.

Аналитические приборы и системы на основе МФЧ существуют не первое десятилетие, но вопросы контроля их характеристик и метрологической аттестации остаются в значительной степени нерешенными, что связанно с отсутствием: единых стандартов изготовления МФЧ; единого регламента по выбору материалов, технологий обработки и герметизации чипов; методик контроля геометрических размеров функциональных элементов МФЧ.

Итак, актуальным является разработка МФЧ с интегрированными микро- и наноразмерными элементами для фиксации и разделения биологических объектов, обеспечение совместимости МФЧ с различными методами микроскопии, в том числе высокого разрешения. Контроль погрешностей, обусловленных технологиями изготовления, требует

8

отдельного внимания, ведь именно точность изготовления элементов чипов будет определять их аналитические и функциональные характеристики. При разработке МФЧ для приборов АСМ необходимым является решение комплекса задач, связанных с фиксацией и поддержанием условий функционирования исследуемых биологических объектов. С учетом вышеизложенного и на основании анализа литературных данных были сформулированы цель и задачи работы.

Цель работы: проведение теоретических, технологических и экспериментальных исследований, направленных на разработку, изготовление, контроль геометрических размеров и испытание МФУ, предназначенных для фиксации и разделения биологических микрообъектов, и визуализация последних методами оптической и атомно-силовой микроскопии.

Основные задачи работы:

1) моделирование массопереноса жидкости в гидродинамических ловушках для фиксации микрочастиц, гидродинамического разделения частиц различных размеров в реакционной камере и разработка топологий МФЧ;

2) отработка технологии изготовления микроструктур в стекле марки Крон 8 (К8) методом лазерной литографии с последующим кислотным травлением и контроль их геометрических размеров;

3) разработка технологий изготовления и создание экспериментальных образцов МФЧ с ловушками для фиксации микрочастиц, для разделения частиц и контроль геометрических размеров их элементов, определяющих функциональные и аналитические характеристики чипа (анализируемый объем и т.д.);

4) разработка методического подхода для оценки влияния погрешности изготовления микроразмерных каналов на функциональные характеристики МФЧ (объем элемента и гидравлическое сопротивление канала);

5) испытание экспериментальных образцов МФЧ с использованием модельных объектов (полимерных микрочастиц и бактерий) для проверки адекватности результатов моделирования и подтверждения работоспособности конструкций;

6) изучение особенностей проведения измерений геометрических размеров калибровочной решетки в жидких средах (дистиллированная вода, PBS, боратный буфер, NaOH) методом АСМ и разработка методики фиксации бактерий в воде на время проведения измерений.

Методы исследования

Для решения поставленных задач применялись следующие аналитические методы: анализ литературных источников по тематике диссертации; математическое моделирование массопереноса жидкости и движения микрочастиц путем решения уравнения Навье-Стокса при помощи программного продукта COMSOL Multiphysics; оптическая микроскопия для контроля микроразмерных структур и апробации МФЧ; сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) для контроля наноразмерных структур МФЧ; KJTCM для апробации работы МФЧ; АСМ для изучения тестовых структур и биологических объектов в жидкости; статистическая обработка экспериментальных результатов; нахождение аппроксимирующих функций путем приведения функциональной зависимости к форме линейного тренда в новой системе координат.

Кроме того, для изготовления МФЧ использовались следующие технологические методы, фотолитография с последующим кислотным травлением для изготовления заготовок МФЧ из стекла К8; травление сфокусированным ионным пучком (СИП) для изготовления микро- и наноразмерных структур в заготовках МФЧ из стекла; лазерная литография с последующим кислотным травлением для изготовления тестовых структур и шаблонов МФЧ из стекла; отливка ПДМС по шаблону для получения

полимерных МФЧ; герметизация МФЧ за счет использования адгезии между стеклом и ПДМС.

Научная новизна

1. Предложены технологии изготовления, созданы и испытаны оригинальные конструкции МФЧ: а) с гидродинамическими ловушками (П-образная ловушка, сеть параллельных наноразмерных каналов с заходами) для фиксации микрочастиц размером до 3 мкм из потока; б) с реакционной камерой для гидродинамического разделения микрочастиц размерами 3-10 мкм в потоке.

2. В результате технологических исследований по изготовлению тестовых микроструктур в стекле К8 методом лазерной литографии с последующим кислотным травлением и контроля их геометрических размеров методом оптической микроскопии, получены данные, позволяющие определить режим изготовления требуемых структур в стеклянных подложках с необходимой точностью.

3. Разработан методический подход для оценки влияния погрешности технологии изготовления на функциональные характеристики МФЧ (объем элемента и гидравлическое сопротивление канала), учитывающий расчетные и полученные значения геометрических размеров каналов.

4. Разработана новая методика фиксации бактерий E.Coli на пленке агар-агара (массовая доля 1,8 % в исходном растворе), нанесенной на поверхность слюды, которая позволяет предотвратить ее набухание и деформацию, возникающую при проведении измерений методом АСМ в дистиллированной воде, визуализировать группы и отдельные бактерии, а также оценить их геометрические размеры.

Достоверность научных результатов обеспечивается корректностью

постановки задач исследования, в том числе при проведении

математического моделирования, воспроизводимостью результатов

измерений, статистической обработкой полученных результатов,

11

соответствием расчетных и экспериментальных данных, включая исследование тестовых объектов с заданными характеристиками. Результаты диссертации были представлены на международных и всероссийских конференциях, форумах, ассамблеях и школах, а также опубликованы в журналах рекомендуемых ВАК.

Практическая значимость определяется:

1) разработанными топологиями и экспериментальными образцами МФЧ с интегрированными гидродинамическими ловушками (П-образная ловушка, сеть параллельных наноразмерных каналов с заходами) и для гидродинамического разделения частиц, которые позволяют исследовать микрочастицы методами KJICM и оптической микроскопии;

2) разработанной технологией изготовления микроструктур в стекле К8 методом лазерной литографии с последующим кислотным травлением, которая дает возможность создавать функциональные структуры с заданной точностью размеров.

Положения, выносимые на защиту

1. Предложенные конструкции гидродинамических ловушек (П-образная ловушка, сеть параллельных наноразмерных каналов с заходами) позволяют выделять из потока жидкости, удерживать и исследовать отдельные микрочастицы (полимерные частицы размером 3 мкм, бактерии E.Coli) или их группы методом KJICM.

2. Результаты моделирования траекторий движения полимерных частиц разных размеров (3 и 10 мкм) в реакционной камере МФЧ для гидродинамического разделения частиц и полученные экспериментальные данные свидетельствуют о возможности дискриминации частиц по геометрическим размерам, что позволяет создавать новые информационно-измерительные приборы.

3. Технологии изготовления микро- и наноразмерных структур в подложках

из стекла К8 методом лазерной литографии с последующим кислотным

12

травлением и методом СИП, метод отливки ПДМС по шаблону, а также метод герметизации за счет использования адгезии между стеклом и ПДМС применимы для создания гибридных (полимер-стеклянных) МФЧ с функциональными элементами, геометрические размеры которы