автореферат диссертации по химической технологии, 05.17.08, диссертация на тему:Масштабирование процесса микробиологического синтеза рекомбинантных белков

МАСШТАБИРОВАНИЕ ПРОЦЕССА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ

(НА ПРИМЕРЕ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО «2-ИНТЕРФЕРОНА)

05.17.08 Процессы и аппараты химических технологий 03.00.23 Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

UUJ460918

Москва-2009

003460918

Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева.

Научный руководитель Доктор технических наук, профессор

Менынутина Наталья Васильевна

Доктор медицинских наук, зам.Генерального директора ОП ЗАО «Биокад» Денисов Лев Александрович

Официальные оппоненты Доктор технических наук, профессор,

руководитель научно-внедренческой лабораторией «Технология промышленного биосинтеза» ФГУП «ГосНИИсинтезбелок» Винаров Александр Юрьевич

Доктор биологических наук, руководитель отдела ОАО «Акрихин» Робакидзе Татьяна Николаевна

Ведущая организация Институт биомедицинской химии

им. В.Н.Ореховича

Защита диссертации состоится «19» февраля 2009 г. в 13 часов в Малом актовом зале на заседании диссертационного совета Д 212.204.03 в РХТУ им. Д.И. Менделеева по адресу: 125047, г. Москва, Миусская пл., д. 9.

С диссертацией можно ознакомиться в Научно-информационном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Автореферат диссертации разослан «19» января 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.204.03

Женса А.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время биотехнология всё активнее замещает химическое производство: это получение химических соединений, лекарственных веществ, новых видов топлив, решение экологических проблем. Биотехнологические процессы составляют 40% химико-фармацевтического производства, и этот процент растёт за счёт создания последнего поколения лекарственных препаратов на основе белков. В связи с этим представляется актуальным развитие и дополнение существующих методик расчёта и масштабирования биохимических реакторов с учётом возможностей нового аналитического оборудования и вычислительных мощностей компьютеров.

В качестве объекта для осуществления масштабного перехода был выбран процесс микробиологического синтеза клетками Escherichia coli белка -человеческого а2-интерферона. Для исследования процесса культивирования, оптимизации параметров ведения процесса и последующего переноса технологии в промышленность был использован системный подход, позволивший связать разработку новой технологии с использованием культуры E.coli SGK25/pIF TREN в различных объёмах и определить пути активного воздействия на процесс с развитием и дополнением методики масштабирования, т.е. определить связи между явлениями, происходящими на разных уровнях иерархии.

Работа выполнена в соответствии с заданием Министерства образования и науки РФ в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы», ГК № 02.513.11.3359.

Цель работы развитие и дополнение существующих методик расчёта и масштабирования биореакторов с учётом возможностей более точного измерения таких важных параметров процесса как растворённый кислород и дыхательный коэффициент биореакторов на примере производства рекомбинантного человеческого а2-интерферона микроорганизмами Kcoli SGK25/pIF TREN в ходе конститутивного синтеза на сложных многокомпонентных средах.

Для достижения поставленных целей необходимо решить следующие задачи:

> Провести системный анализ процесса производства белка бактериальными клетками:

• Изучить особенности и параметры процесса культивирования, влияющие на рост и развитие микроорганизмов E.coli SGK25/pIF TREN на сложной многокомпонентной среде — LB бульон;

• Определить факторы, влияющие на метаболизм клеток и заставляющие их продуцировать рекомбинантный белок а.2-интерферон;

> Изучить динамику потребления клетками кислорода в ходе периодического культивирования и определить дыхательные коэффициенты исследуемых биореакторов при помощи газового масс-спектрометра ProLine 2000®;

> На основании выявленных основных факторов, влияющих на процесс, разработать схему масштабного перехода, включающую в себя разного рода модели (статистические, критериальные, детерминированные);

> Разработать математическую модель кинетики периодического процесса накопления рекомбинантного белка а2-интерферона бактериальными клетками E co!i SGK25/pIF TREN;

> Исследовать гидродинамику в рассматриваемых аппаратах для периодического культивирования микроорганизмов, используя программное обеспечение FLUENT©;

> Разработать программное обеспечение и алгоритм для осуществления масштабного перехода процесса биосинтеза рекомбинантного белка а2-интерферона клетками E.coli.

Научная новизна.

1. Предложена схема масштабирования процессов культивирования в биохимических реакторах, объединяющая в себе несколько подходов (критериальный, статистический, модельный), и позволяющая использовать возможности аналитического оборудования для точного определения оптимальных параметров ведения процессов;

2. Рассчитаны оптимальные параметры производства рекомбинантного человеческого а2-интерферона на сложных многокомпонентных средах и выявлены основные факторы, определяющие течение процесса;

3. Разработана математическая модель кинетики процесса, позволяющая:

• определять максимальный выход белка при различных режимах работы аппарата;

• уточнять параметры ведения процесса при различных начальных условиях.

4. Для мониторинга и масштабирования процессов, протекающих в биохимическом реакторе при производстве препаратов фармацевтического назначения, было успешно применено инновационное аналитическое оборудование, представляющее собой газовый масс-спектрометр ProLine 2000®.

Практическая ценность.

Разработано программное обеспечение для моделирования периодического процесса производства рекомбинантного человеческого а2-интерферона микроорганизмами E.coli SGK25/pIF TREN. Программное обеспечение позволяет на основе кинетики накопления биомассы и целевого белка определять основные параметры и условия ведения процессов

культивирования. Разработанное программное обеспечение может быть адаптировано для моделирования процессов культивирования рекомбинантных штаммов-продуцентов E.coli, протекающих на сложных многокомпонентных средах.

Выявленные закономерности начала синтеза рекомбинантного белка и факторы, влияющие на его скорость, позволили оптимизировать режимы проведения процесса культивирования и добиться стабильных выходных характеристик продукта, что играет важную роль в биофармацевтическом производстве лекарственных препаратов.

Были проведены исследования процесса периодического культивирования штамма Kcoli SGK25/pIF TREN в колбах Эрленмейера, подобраны режимы работы 15 литрового аппарата, рассчитаны и опробированы параметры процесса в 70 литровом аппарате и проведены опытные синтезы в 300 литровом аппарате с целью подтверждения полученных результатов.

Используя предложенный масштабный переход, включающий в себя статистический, критериальный и модельный подходы, был осуществлён перенос технологии культивирования с лабораторных установок на промышленные объёмы. При этом удалось оптимизировать основные параметры ведения процесса, которые позволили повысить не только количественные, но и качественные характеристики выходной субстанции, что, в свою очередь, привело к общему увеличению выпускаемой продукции и её качеству. Проведённая оптимизация процесса культивирования позволила увеличить рентабельность производства клеточной биомассы с высоким содержанием белка а2-интерферона на базе предприятия ЗАО «Биокад», Москва. Получаемая субстанция а2-интерферона используется для приготовления лекарственных препаратов, применяемых при комплексной терапии онкологических заболеваний, а также в качестве противовирусного средства «Генферон®».

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на: 28ой Международной выставке-конгрессе по химической технологии, защите окружающей среды и биотехнологии «АСНЕМА'06», Франкфурт-на-Майне, 2006 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 2006; Международной конференции молодых учёных по химии и химической технологии <МКХТ-2007>, Москва, 2007; 5-ом Международном Конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития», Москва, 2008.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы и приложения. Основной материал изложен на 145 страницах машинописного текста, содержит 60 рисунков, 17 таблиц. Список литературы содержит 160 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении отражена и обоснована актуальность поставленной задачи.

В первой главе рассмотрены основные компоненты, участвующие в процессе культивирования клеток в биохимических реакторах. Дана характеристика бактерий Escherichia coli, используемых в производстве биомедицинских препаратов. Проведён маркетинговый анализ рынков рекомбинантных интерферонов в мире и России. Приведен обзор математических моделей кинетики и гидродинамики процессов периодического культивирования микроорганизмов.

В соответствии с целью работы и на основании результатов анализа литературы была сформулирована задача исследования и намечены этапы ее решения.

Вторая глава посвящена системному анализу процесса микробиологического синтеза белка бактериальными клетками E.coli SGK25/pIF TR EN в ходе периодического процесса. Порядок проведения анализа представлен на рисунке 1.

Основной целью экспериментальных исследований являлось изучение особенностей и параметров процесса культивирования, влияющие на рост и развитие микроорганизмов Ecoli SGK25/pIF TREN на сложной многокомпонентной среде. Кроме того, на основании литературного обзора было установлено, что в ходе экспериментальных работ необходимо определить влияние на процесс 5 основных факторов: температуры, времени проведения процесса и начала синтеза белка клетками, скорости подачи воздуха в ферментёр, количества оборотов мешалки и концентрации субстрата.

Процесс микробиологического синтеза белка занимает ключевую роль в регламенте производства рекомбинантного человеческого а2-интерферона, разработанного и применяемого на предприятии ЗАО «Биокад» (г. Москва). Требования к получаемой биомассе достаточно высоки. От общего количества получаемых клеток и синтезированного белка зависят все дальнейшие стадии выделения и очистки рекомбинантного а2-интерферона, накапливаемого в виде тел включения. Выбор периодического ведения процесса обусловлен необходимостью стерильности получаемой клеточной массы.

В качестве биокультуры был использован штамм бактерий Escherichia coli SGK25/pIF TREN. Питательной средой служила многокомпонентная среда LB (пептон (10 г/литр), Fluka,CIIIA; дрожжевой экстракт (5 г/литр), Sigma, США; NaCl (5 г/литр), Рапгеас, Испания). На первом этапе исследовался процесс микробиологического синтеза в колбах Эрленмейера на качалке «New Brunswick» G10 при скорости вращения платформы 150 об/мин и температуре 32°С. Изучалось влияние степени аэрации на количественный выход клеток и накопление а2-интерферона внутри клеток.

ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ РОСТА " И РАЗВИТИЯ РЁКСМВИИАНТЙЫХ ВПАММОВ-ПРОДУЦЕНТОа в ' КАЧАПОЧНЫХ КОЛБАХ

Особенности культивирования — конститутивных

штаммов Особенности

накопления _

рекомбинантных белков

Определение факторов, оказывающих влияние

на рост и развитие_

бактерий

, ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ' КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ В БМОХНМИЧЕС КОН РЕАКТОРЕ ОБЪЕМОМ 15ЛИТРОВ

т

Проверка результатов, полученных при культивировании в колбах

Определение аминокислотного состава питательной среды —

Подбор оптимальных параметров ведения процесса —

Комплексный анализ свойств конечных продуктов —

Т, время, аэрация (А), обороты\

мешалки (Ы), концентрация _субстрата (Б)

КУЛЬТИВИРОВАНИЕВ ПОЛУПРОМЫШЛЕННОМ БИОХИМИЧЕСКОМ РЕАКТОРЕ OSbEWOM ГО ЛИТРОВ

газовый масс-спектрометр : для определения дыхательного : коэффициента КО и

коэффициента Т; массопередачи по кислороду Кш

Масштабирование с использованием коэффициента массопередачи по кислороду Оценка оптимальных условий проведения процесса культивирования в 70 и 500 литровом биохимических" реакторах

Определение коэффициента массопередачи по кислороду в ферментационной среде "

Статистическая обработка результатов. Вычисление оптимальных параметров ~ (реактор объёмом 15 литров)

ОБРАБОТКА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ СТАТИСТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

Определение — дыхательного коэффициента 130

Определение _ коэффициента массопередачи по кислороду

РАЗРАБОТКА, ^ МЕТОДИКИ МАСШТАБИРОВАНИЯ

_Проверка масштабного

перехода — Изучение влияния скорости перемешивания

_ Изучение влияния

подачи воздуха комплексный анализ свойств конечных продуктов

Создание математической модели кинетики

процесса культивирования в •■биохимическом реакторе

;: ПРОМЫШЛЕННОЕ ШШейРОВАШЕ

Реактор 15 литров

Реактор 70 литров

Реактор 300 литров

Моделирование процесса гидродинамики при .помощи программного пакета FLUENT

Рис. 1. Системный анализ процесса синтеза рекомбинантного белка клетками Е.соИ

Оптическую плотность клеток измеряли при помощи спектрофотометра «БЫтаёги» при длине волны 540 нм с использованием кювет с расстоянием между стенками 1 см. Уровень накопленного белка измеряли при помощи электрофореза в 12,5% ПААГ. Аэрацию регулировали степенью заполнения колб питательной средой. Результаты исследований, проведенных в

Рис.2. А - кривые роста бактерий в колбах Эрленмейера с различными объёмами питательной среды (50, 200,400 мл); Б - процент накопленного белка а2-интерферона

Выявленные зависимости конечного количества клеток и синтезированного белка от объёма питательной среды, позволили сделать вывод о том, что воздействие растворённого кислорода на физиологическое состояние популяции является действенным методом влияния на выходные характеристики процесса.

Кроме того, можно сделать следующие выводы;

• Микробиологический синтез состоит из двух стадий (до периода 6,5-7,5 часов наблюдается активный рост клеток, затем - синтез белка). Процесс накопления белка сложный, так как белок накапливается внутри клеток, а не секретируется во внешнюю среду - нельзя измерить «in situ»;

• Длительность процесса составляет 12—13 часов, после чего наступает стадия стационара и последующее отмирание популяции.

Оптимальными выходными характеристиками процесса по количеству полученной биомассы и количества синтезированного белка было принято считать результаты, полученные в варианте с объёмом среды 200 мл.

При культивировании в биохимическом реакторе появляется возможность влияния на процесс посредством варьирования оборотов мешалки — N (об/мин) и количества подаваемого воздуха — А (л/л^/мин), тем самым изменяя содержание растворенного кислорода. Была проведена серия экспериментов на лабораторном ферментёре (объём 15 литров). Культивирование в ферментёре осуществляли при температуре 32°С и при значения рН=7,2±0,2, без подачи питательной среды и дополнительной коррекции рН. Для изучения влияния растворенного кислорода было решено разделить процесс на 2 стадии:

1. с момента внесения инокулята в питательную среду до 7 часа;

2. с 7 часа до перехода культуры в состояние стационара (13 час).

Была выбрана следующая стратегия варьирования параметров культивирования: на первой стадии увеличение числа оборотов мешалки и количества подаваемого воздуха проходило ступенчато (каждый час) таким образом, чтобы к моменту времени равном 7 часам достичь оптимального значения растворенного кислорода в питательной среде. На второй стадии -поддерживать заданные значения на достигнутом уровне.

На рисунке 3 представлена схема проведения экспериментов в ферментере. Приведён пример электрофореграммы, получаемой при анализе проб, отбираемых в ходе микробиологического синтеза.

тов мешалки; 8 - барботёр; 9 - мешалка; 10 - датчик давления в аппарате; 11 - регулируемые клапаны; 12 - спектрофотометр SHIMADZU®

Для того чтобы оценить влияние содержания компонентов питательной среды на рост клеток, был проведён аминокислотный анализ LB-бульона. Для этого в ходе периодического культивировании отбирались пробы с последующим определением концентрации компонентов субстрата в ИБФМ РАН (г.Пущино). Отмечено, что в ходе роста клетки используют в качестве источника углерода и энергии свободные аминокислоты, входящие в состав питательной среды. Кроме того, результаты исследования позволили сделать следующий вывод: состав питательной среды остается практически постоянным по аминокислотному составу и не ограничивает рост бактерий.

Ниже представлены результаты экспериментов в биохимическом реакторе объёмом 15 литров по выявлению взаимного влияния факторов (оборотов мешалки и аэрации) на выходные характеристики процесса. При исследовании влияния аэрации на синтез клеток и накопления белка фиксировались обороты мешалки на постоянном уровне и менялась только скорость подачи воздуха (л/лж/мин) (рисунок 4), для исследования влияния скорости перемешивания (об/мин) - наоборот (рисунок 5).

Рис.3. Схема проведения культивирования в аппарате объёмом 15 литров фирмы Е1ес1го1их®

рвггпдокз обсратое »«ДО*»

1-вспомогательные штуцеры; 2 - корпус ферментёра; 3 - стерильная питательная среда (ЬВ); 4 - рубашка ферментёра; 5 - датчик температуры охлаждающей воды; 6 - датчик температуры внутри ферментёра; 7 - устройство для регулирования оборо-

Рис.4. Исследование влияния скорости подачи воздуха (л/лж/мин) на синтез белка клетками при фиксированном числе оборотов мешалки (А - кривые роста

Рис.5. Исследование влияния количества оборотов мешалки (об/мин) на синтез белка клетка-ми при фиксированной скорости подачи воздуха (А - кривые роста клеток; Б - содер-жание белка а2-интерферона в клетках)

В ходе экспериментов проводилось измерение текущей концентрации кислорода посредством датчика. Было отмечена разница в концентрации растворенного кислорода в зависимости от параметров ведения процесса. На основании проделанных экспериментов в аппарате объёмом 15 литров были сделаны следующие выводы:

• Синтез белка клетками является сложным. Процесс культивирования является альтернативным: возможен высокий выход по клеткам с малым содержанием белка и наоборот — высокие показатели по белку, но малое количество клеток;

• На течение синтеза не оказывает влияние изменение состава питательной среды. Рассматриваемый процесс не является лимитированным по содержанию необходимых для роста бактерий веществ;

• Одним из эффективных способов повышения выходных параметров является воздействие на физиологию клеток путем выбора оптимальных характеристик ведения процесса: количества растворенного кислорода в питательной среде (количества подаваемого воздуха и скорости оборотов мешалки).

Третья глава посвящена разработке методики масштабного перехода от лабораторных реакторов (15 литров) к аппаратам полупромышленных (70 литров) и промышленных (300 литров) объёмов. Анализ экспериментальных данных и проведённый литературный обзор позволили разработать следующую методику масштабирования - рисунок 6.

Первым шагом в масштабном переходе является статистическая обработка результатов, полученных в ходе исследования в биохимическом реакторе объёмом 15 литров.

Рис.6. Алгоритм масштабного перехода

На основе пассивного эксперимента была составлена трехуровневая матрица для двух факторов. За параметр оптимизации было выбрано количество синтезируемого белка в клетках, которое рассчитывалось как произведение массы полученных клеток на процент экспрессии целевого белка. С учетом рассчитанных коэффициентов уравнение регрессии выглядит следующим образом:

Р = 4,413 + 0,288-^ + 1,133-Л-0,501-ЛГ2-0,088 Л2-0,200-//Л (1)

где N - число оборотов мешалки (об/мин), А - аэрация (л/л^/мин).

На рисунке 7 представлен результат статистической обработки данных с 15 литрового ферментера. Следует отметить, что рассчитанные значения параметров ведения процесса являются оптимальными для 7 часа синтеза (начало второй стадии), и их следует фиксировать на оставшийся период культивирования.

Рис. 7. Поверхность отклика выходного параметра

Оптимальные значения в ферментере с рабочим объемом 15 литров, которые необходимо фиксировать после 7 часов и поддерживать на заданном уровне:

Кор1" 200 об/мин; АоР, = 0,83 л/лж/мин.

При расчете коэффициента массопередачи кислорода {к]а) были рассмотрены известные зависимости [Кафаров и др., 1979]. При подстановке экспериментальных значений в расчётные формулы были вычислены коэффициенты массопередачи для рассматриваемого процесса. Оценив полученные значения к^а, была выбрана следующая зависимость, которая наиболее точно описывает рассматриваемый синтез:

где (И/У) - удельная мощность.

Исходя из рассчитанных оптимальных значений скоростей мешалки и аэрации, было определено значение коэффициента массопередачи кислорода для этих условий для аппарата объёмом 15 литров на момент времени равном 7 часам к, а = 198ч~'.

Следующим шагом масштабного перехода, следуя алгоритму, представленному на рисунке 6, стало определение оптимальных значений числа оборотов мешалки и скорости подачи воздуха для реакторов объёмом 70 л и 300 л, при условии их геометрического подобия. Кроме того, необходимо соблюсти при расчётах гидродинамическое и массообменное подобие. Подобие гидродинамической обстановки будет показано в главе 4 при использовании компьютерного моделирования гидродинамики. При массообменном подобии аппаратов значение коэффициента массопередачи кислорода «газовая фаза -жидкость» должно поддерживаться, что было использовано в последующих расчётах. Масштабный переход был осуществлён при вышеперечисленных условиях с использованием следующих формул:

где Л^-мощность, расходуемая на перемешивание жидкости в аппарате; Л^-число мощности, «-количество оборотов мешалки, «¿-диаметр мешалки, р - вязкость.

При масштабировании соблюдалось условие:

к,а = 0,06х Ы/У

0,81

(2)

(3)

где N¡,1, N02 - расходы мощности на перемешивание, Ур1, Ур2 - объёмы реакторов.

Из критериального соотношения (4) были определены оптимальные значения скорости вращения мешалки для аппаратов объёмом 70 литров и 300 литров, которые необходимо фиксировать на 7 час культивирования и поддерживать эти значения до завершения процесса. Используя формулу для расчёта числа аэрации (5), был рассчитан необходимый расход воздуха:

в

хпхЫ

(5)

где С? - расход воздуха, - диаметр аппарата, л - частота вращения мешалки, - диаметр мешалки.

Результаты вычислений расхода воздуха и скорости вращения мешалки в рассматриваемых аппаратах представлены в виде таблицы 1.

Таблица 1

Параметр процесса Аппарат 15 литров Аппарат 70 литров Аппарат 300 литров

Кол-во оборотов мешалки, об/мин 200 151 70

Кол-во подаваемого воздуха, л//мин 10 39 65

Полученные значения ¿¿а для 70 и 300 литровых аппаратов совпадали со значением ¿¿а, полученного для биореактора объёмом 15 литров с точностью до 7%.

Правильность результатов предположений и представленных расчётов была подтверждена использованием газового масс-спектрометра РгоЫпе 2000®. При помощи данного прибора были получены профили «дыхательных коэффициентов» - для аппаратов объёмом 15 литров и аппарата объёмом 300 литров. Результаты данного эксперимента, а также формула для расчета представлены на рисунке 8._

ФОРМУЛА РАСЧЁТА КОЭФФИЦИЕНТА ЯО

"= С(%)С02выд х]выд-С(%)С02вх* ¡вх Ос2.ш1 = С(%)0-ахк /вх-С(%)Огвыдх/выд

гех «О

С(%) СО г выд х/выд - С(%) С02 С<%)0гвхх ¡вх -С(%) О ¡выд х/выд

Б

Рис. 8. Данные, полученные при использовании газового масс-спектрометра (А - профиль «дыхательного коэффициента» RQ, Б - формулы для расчётов) Из представленных на рисунке 8 результатов экспериментов видно практическое совпадение профилей «дыхательных коэффициентов» для реакторов с разными объёмами.

Четвёртая глава посвящена моделированию гидродинамики в исследуемых биохимических реакторах и разработке математической модели кинетики процесса.

Моделирование гидродинамики было осуществлено при помощи программного пакета Fluent 6.1. Задача моделирования сводилась к определению основных параметров процесса, влияющих на гидродинамическую обстановку внутри реакторов (таких как плотность жидкости, распределение клеток в объёме аппарата, число оборотов мешалки, подача воздуха), и выбору из имеющегося перечня пакета Fluent уравнений, описывающих процесс.

Картина биохимического реактора объёмом 300 литров представлена на рисунке 9.

А Б

Рис. 9. А - Биохимический реактор (объём 300 литров): 1-привод мешалки, 2-патрубок выходящего воздуха, 3- корпус аппарата, 4- мешалка, 5-барботёр, 6 - вспомогательные штуцеры; Б - геометрия виртуального аппарата, созданная при помощи программного пакета Fluent 6.1

В результате расчёта уравнений модели, описывающих гидродинамику сплошной фазы с диспергированной фазой, и графической визуализации рассчитанных значений были получены следующие профили распределения частиц в объёме исследуемых аппаратов, которые представлены на рисунке 10.

Рис.

Таким образом, проведённые расчёты профилей скоростей в исследуемых реакторах различного объёма подтвердили подобие гидродинамической обстановки при определенных в 3 главе скоростей вращения мешалки и подачи воздуха. Кроме того, результаты расчётов позволяют подтвердить возможность использования положений идеального смешения при последующем моделировании кинетики процесса.

При рассмотрении процессов аэробного биосинтеза на удельную скорость роста клеток влияет как концентрация углеродного субстрата, так и количество растворённого кислорода, что в общем случае может быть представлено как:

(6)

где // - общая удельная скорость роста клеток; ц, - удельная скорость роста клеток, зависящая от субстрата; - удельная скорость роста клеток, зависящая от содержания растворенного кислорода в питательной среде.

В данной работе рассмотрен вариант, когда скорость роста клеток не лимитируется концентрацией углеродного субстрата (он находится в избытке) и, следовательно, удельная скорость роста клеток будет определяться, в основном, содержанием в среде растворенного кислорода.

где /лтах - удельная максимальная скорость роста микроорганизмов, ч"1; Сд-текутая концентрация растворенного кислорода, г/л; Кс и К,с - кинетические константы, г/л; Р - концентрация белка в клетках, г/г.

А Б

10. А - профиль распределения клеток в аппарате объёмом 15 литров в начальный момент времени при внесении инокулята в питательную среду; Б - распределение клеток по объёму аппарата спустя 5 секунд пребывания в аппарате.

Модель кинетики процесса была сформирована исходя из условий идеального смешения в биохимическом реакторе и состоит из дифференциальных уравнений, учитывающих изменение концентрации биомассы, концентрации растворенного кислорода в питательной среде и продукта синтеза (белка а2-интерферона) во времени. Система уравнений представлена следующим образом:

dX Y

-= и-Х

dt

dC_ dt '

dP dt '

KLa■ C'-CL -qc-X

(8)

О, если 0<t<7, X

я?™

кр-х

К,-Х\если t> 7

где Kp, Klp - кинетические константы, г/л; qc - скорость потребления кислорода клетками, л/ч; qPmax - удельная максимальная скорость образования продукта, г/ч; X - концентрация биомассы, г/л; С - равновесная концентрация кислорода при парциальном давлении, г/л.

Скорость потребления кислорода клетками представлена зависимостью:

(9)

1 хс

где Ухе - расходный коэффициент, г/г.

С помощью разработанного программного обеспечения в Mathcad 7.0 была проведена идентификация параметров математической модели и найдены значения кинетических констант и коэффициентов. В качестве начальных условий послужили начальные концентрации биомассы и субстрата в периодическом процессе, протекающем при температуре 32°С: Х- 2,0хЮ"3 г/л, С — 7,5x10"3 г/л, Р = 0 г/л. Результаты математического моделирования представлены на рисунке 11:

Р. Г?п С* 10ГЛ1 f п

3

7ß 5

4

3

2

0 0

Рис. 11 Сравнение результатов, полученных при решении математической модели и экспериментальных данных при периодическом культивировании штамма Е.соН - продуцента человеческого рекомбинантного а2-шггерферона: 1 - кривая роста клеток; 2 - кривая растворенного кислорода; 3 - концентрация накопленного белка клетками.

Времгкулыив|фОвави*-ч

Точками обозначены экспериментальные данные, прямыми - данные, полученные в ходе решения математической модели.

Решение уравнений модели подтвердило правильность определения коэффициента kia (полученного с использованием статистического подхода), позволило уточнить начальную концентрацию посевного материала, а также получить спектр кривых, отражающих ход процесса в зависимости от параметров ведения культивирования.

На основании разработанной модели и предложений по масштабированию процесса были осуществлены экспериментальные серии культивирования штамма-продуцента в 300-литровом аппарате. Результаты экспериментов показали, что составленная математическая модель и расчеты полностью удовлетворяют процессу микробиологического синтеза рекомбинантного белка в клетках Escherichia coli на сложнокомпонептных средах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ

1. Предложена схема и алгоритм масштабирования процессов культивирования в биохимических реакторах, объединяющая в себе несколько подходов (критериальный, статистический, модельный), и позволяющая использовать возможности нового аналитического оборудования для контроля за биотехнологическими процессами в режиме он-лайн с возможностью более точного определения таких важных характеристик процесса как количество потребляемого кислорода клетками и дыхательного коэффициета биореакторов.

2. Оптимизированы основные параметры микробиологического синтеза штамма Ecoli, продуцирующего рекомбинантный человеческий а2-интерферон, при росте на сложных многокомпонентных средах, и выявлены основные факторы, определяющие течение процесса.

3. По предложенной методике масштабирования осуществлен масштабный перенос технологии культивирования процесса биосинтеза рекомбинантного белка а2-интерферона клетками E coli.

4. Благодаря использованному в работе газовому масс-спектрометру ProLine 2000 для анализа отходящей смеси газов из биохимического реактора, был определён дыхательный коэффициент. Полученные результаты подтвердили справедливость предположений и рассчитанных значений при масштабировании процесса.

5. Разработана математическая модель кинетики процесса микробиологического синтеза и программное обеспечение, позволяющие определять максимальный выход белка при различных режимах работы аппарата и уточнять параметры ведения культивирования при различных начальных условиях.

6. Для анализа гидродинамики в биохимическом реакторе был использован программный пакет Fluent, позволяющий оценить гидродинамическую обстановку в аппаратах объёмами 15, 70 и 300 литров.

Экспериментальные и аналитические исследования процесса синтеза белка в биохимических реакторах проводились на базе ЗАО «Биокад» (г.Москва) под руководством к.т.н. Чугунова А.М. и к.б.н. Гончаровой О.В. Аналитические исследования состава сложнокомпонентной среды проводились в ИБФМ РАН (г.Пущино)

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. I. Kazeev., L. Denisov, Е. Guseva, N. Menshutina. Investigation and Optimization of Recombinant Proteins Production. // 28ft International Exhibition-Congress on Chemical Engineering, Environmental Protection and Biotechnology (ACHEMA-2006): proceeding of congress. - Frankfurt am Main, Germany, 2006.- T.XXII.- P. 234-238.

2. Зеркаев А.И., Гузев О.Ю., Казеев И.В. Инновационная технология атмосферной сублимационной сушки с активной гидродинамикой для получения фармацевтических порошков с заданной наноструктурой. Индустрия наносистем и материалы // Всероссийская конференция инновационных проектов аспирантов и студентов: материалы конференции. -М.:МИЭТ, 2006. -244 с.

3. Шейченко О.П., Шейченко В.И., Толкачев О.Н., Бочаров Е.В., Казеев И.В., Быков В.А. Применение разностных электронных спектров поглощения в анализе комплексного препарата Фитомикс-40 // Всероссийская научно-практическая. конференция "Отечественные противоопухолевые препараты". Российский биотерапевтический журнал. - М. 2006. - Том 5, № 1.-32 с.

4. Казеев И.В., Воронова Н.И., Гусева Е.В., Меньшутина Н.В. Изучение кинетики синтеза рекомбинантного а2-интерферона в клетках Escherichia coli // Международный конгресс молодых учёных по химии и химической технологии «МКХТ-2007»: матер, конф. - М.:РХТУ им Д.И. Менделеева, 2007. - T.XXI, № 1. - С. 52-57.

5. Казеев И.В., Меньшутина Н.В., Ефанов Ю.Г., Морозов Д.В. Применение газового масс-спектрометра для контроля за процессом культивирования микроорганизмов в биореакторе // Журнал «Химическая промышленность сегодня». - 2008 - №4. - С. 31 -35.

6. Казеев И.В., Чугунов А.М., Морозов Д.В. Применение газового масс-спектрометра как обязательного элемента при внедрении на предприятии стандартов РАТ // Международный конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития»: матер, конф. - М. 2008. — Т.И, №1. - С. 66-69.

Подписано в печать:

19.01.2009

Заказ № 1453 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Введение.

1. Литературный обзор.

1.1. Процесс культивирования микроорганизмов.

1.2. Микробиологическое производство белка а2-интерферона.

1.2.1. Пути развития и современное состояние производства.

1.2.2. Фармакологические свойства.

1.3. Моделирование кинетики процессов периодической ферментации, протекающих в биохимических реакторах.

1.4. Массообмен в биореакторах с механическим перемешиванием и аэрацией.

1.5. Масштабирование биохимических реакторов.

1.6. СРБ-моделирование гидродинамики биохимических реакторов.

Постановка задачи.

2. Экспериментальные исследования.

2.1. Материалы и методы.52,

2.1.1. Характеристика микроорганизмов.

2.1.2. Аналитические методы измерения параметров культивирования.

2.1.3. Эксперименты в колбах.

2.1.4. Культивирование в лабораторном ферментёре Е1ес1то1их® объёмом 15 литров.

2.1.5. Исследование потребления компонентов питательной среды.

2.2. Результаты и их обсуждение.

2.2.1 Эксперименты в колбах.

2.2.2. Культивирование в лабораторном ферментёре Е1есйо1их® объёмом 15 литров.

2.2.3. Результаты аминокислотного анализа питательной среды.

3. Анализ экспериментальных данных методами статистики и методика масштабирования

3.1. Методика масштабного перехода и моделирования.

3.2. Статистическая обработка полученных результатов.

3.2.1. Расчет коэффициентов уравнения регрессии.

3.2.2. Дисперсия воспроизводимости процесса.

3.2.3. Определение значимости коэффициентов регрессии.

3.2.4. Проверка адекватности математической модели.

3.2.5. Поверхность отклика.

3.3. Определение дыхательного коэффициента (RQ) с помощью газового масс-спектрометра ProLine 2000®.

3.4. Расчёт коэффициента массопередачи (kLa).

3.5. Оценка оптимальных условий проведения процесса культивирования в 70 и 300 литровом биохимических реакторах.

3.6. Масштабирование с использованием коэффициента массопередачи по кислороду.ЮЗ

3.7. Культивирование в аппарате объёмом 70 литров.Ю

4. Математическое моделирование процессов гидродинамики в биохимическом реакторе и создание кинетической модели процесса.ИЗ

4.1. Моделирование гидродинамики процесса.ИЗ

4.1.1. Моделирование гидродинамики исследуемых биохимических реакторов с использованием программного пакета Fluent.

4.1.2. Результаты расчёта уравнений модели.

4.2. Разработка математической модели процесса культивирования.

В настоящее время биотехнология всё активнее замещает химическое производство: это получение химических соединений, лекарственных веществ, новых видов топлив, решение экологических проблем. Биотехнологические процессы составляют 40% химико-фармацевтического производства, и этот процент растёт за счёт создания последнего поколения лекарственных препаратов на основе белков. Таким образом, представляется актуальным развитие и дополнение существующих методик расчёта и масштабирования биохимических реакторов с учётом возможностей нового аналитического оборудования и вычислительных мощностей компьютеров.

Развитие биотехнологии в области производства препаратов медицинского назначения на сегодняшний день достигло больших успехов. Получение большинства антибиотиков, ферментов, гормонов для химико-фармацевтической промышленности осуществляется биотехнологическим способом. Переход от химического синтеза к биологическому позволил сократить количество вредных веществ, выделяемых в атмосферу, снизил энерго- и ресурсозатраты, уменьшил общий цикл производства. Всё это позволило биотехнологии выделиться в отдельное направление в химико-фармацевтической отрасли и занять лидирующее место.

В связи с бурным развитием таких наук как генетика, молекулярная биологии и биотехнология, человек смог больше узнать о структуре и внутреннем устройстве живых клеток. Создание нового направления в фармацевтической промышленности - генетической инженерии стало возможным благодаря разработке методов изменения генетического аппарата клеток, позволяющих вводить в них чужеродные гены, клонировать их, экспрессировать и получать биосинтетические белки в необходимом количестве. Результатом развития учений об изменении генетической информации организмов стало обеспечение здравоохранения современными терапевтическими вакцинами, интерферонами, колониестимулирующими факторами и многими другими лекарственными препаратами.

В качестве объекта для исследования механизмов накопления белков в клетках, а также для осуществления масштабного перехода был выбран процесс синтеза рекомбинантного человеческого а2-интерферона клетками, получаемый методами генной инженерии из бактериальных клеток Escherichia coli. Для изучения процесса культивирования, оптимизации параметров ведения процесса и последующего переноса технологии в промышленность был использован системный подход, позволивший связать разработку новой технологии с использованием рекомбинантных штаммов-продуцентов в различных объёмах и определить пути активного воздействия на процесс с развитием методики масштабирования, т.е. определить связи между явлениями, происходящими на разных уровнях иерархии.

Спектр заболеваний, при которых назначают препараты интерферонов, достаточно большой. Универсальность и безопасность данных лекарственных средств обеспечили интерферонам прочное место на рынке фармацевтических препаратов. В России большое количество таких лекарственных средств представлено исключительно образцами иностранного производства, что, зачастую, делает эти препараты недоступными для широкого круга пациентов, поэтому разработка и создание более дешёвых и доступных отечественных генно-инженерных препаратов на основе интерферонов носит не только научно-прикладной, но и стратегический характер в масштабах всей страны. Осуществление масштабного перехода технологии культивирования с лабораторных установок на аппараты промышленных объёмов позволит в кратчайшие сроки наладить производство собственных препаратов на основе рекомбинантных белков. Использование методов математического моделирования не только ускорит решение задачи проектирования производства, но и позволит оптимизировать работу действующих установок.

Диссертационная работа представлена в четырёх главах и посвящена моделированию и разработке промышленной технологии культивирования прокариотических штаммов-продуцентов на примере культивирования бактерии Escherichia coli, синтезирующей рекомбинантный человеческий а2-интерферон.

В первой главе - литературном обзоре - приведены общие сведения о процессах культивирования микроорганизмов, продуцирующих белки. Рассмотрены основные компоненты, участвующие в процессе культивирования клеток в биохимических реакторах. Дан обзор современных подходов к изучению процессов, протекающих внутри биореактора, а также химических реакций, происходящих внутри клеток, созданных на основе рекомбинантных ДНК.

Рассмотрена история и современное состояние производства интерферонов. Приведены примеры применения интерферонов в лечении заболеваний человека. Рассмотрены вопросы роста микроорганизмов, продуцирующих белки, на различных субстратах. Освещены вопросы математического моделирования кинетики процессов, происходящих внутри биохимических реакторов. Описаны основные подходы, применяемые при масштабном переходе от лабораторных аппаратов меньшего объёма к промышленным установкам.

В соответствии с целью работы и на основании выводов, сделанных в результате анализа литературы, была сформулирована постановка задачи исследования и намечены этапы ее решения.

Вторая глава работы посвящена системному анализу процесса производства белка бактериальными клетками. Приведены результаты экспериментальных исследований, которые проводились по нескольким направлениям: исследование метаболизма штамма-продуцента; исследования процесса культивирования в качалочных колбах и лабораторном ферментёре (объёмом 15литров), дан комплексный анализ свойств получаемой биомассы и состава культуральной среды. В качестве объекта исследований использовали штамм E.coli SGK25/pIF TREN с конститутивным типом экспрессии рекомбинантного альфа-2 интерферона, созданного в ЗАО «Биокад» на основе штамма SG20050, рекомбинантной плазмидой pIF TREN. Экспериментальные и аналитические исследования позволили выявить взаимосвязь между физиологией микроорганизмов и условиями культивирования, благодаря чему удалось подобрать диапазон работы промышленного аппарата (объёмом 300 литров).

Третья глава посвящена разработке методики масштабного перехода от лабораторных установок (объёмом 15 литров) к аппаратам полупромышленного (70 литров) и промышленного (300 литров)типов. Использование современного аналитического оборудования такого как газовый масс-спектрометр для определения состава паровоздушной смеси в ферментёре в режиме реального времени, позволило исследовать: 1) динамику потребление клетками кислорода; 2) скорость выделения углекислого газа; 3) вычислить дыхательный коэффициент биореактора (RQ) и коэффициент массопередачи кислорода. Полученные данные были использованы при проверке адекватности математической модели.

В основу математического описания легли основные принципы и стратегия системного анализа к математическому моделированию химико-технологических систем и процессов, разработанных академиком В.В. Кафаровым. Адекватность математической модели была определена сопоставлением расчетных и экспериментальных данных при культивировании исследуемого штамма на установке промышленного масштаба (объёмом 300 литров).

Четвертая глава посвящена описанию процесса моделирования гидродинамики в биохимических реакторах в программном пакете Fluent и разработке математической модели кинетики процесса.

Автор выражает глубокую благодарность руководителям работы: д.т.н., профессору Н.В. Меныпутиной; д.м.н., зам. Генерального директора ОП ЗАО «Биокад» Денисову JI.A.; Генеральному директору ЗАО «Биокад» Морозову Д.В.; заведующему опытно-промышленной биотехнологической лабораторией ОП ЗАО «Биокад», к.т.н. Чугунову A.M., заведующей лабораторией физиологии микроорганизмов к.б.н. Гончаровой О.В., с.н.с. Ефанову Ю.Г., сотрудникам ОП ЗАО «Биокад» за консультации и помощь в проведении экспериментальных исследований, а также сотрудникам и аспирантам научной группы, принимавших участие в обсуждении данной работы.

1. Литературный обзор

Выводы по работе

1. Предложена схема и алгоритм масштабирования процессов культивирования в биохимических реакторах, объединяющая в себе несколько подходов (критериальный, статистический, модельный), и позволяющая использовать возможности нового аналитического оборудования для контроля за биотехнологическими процессами в режиме он-лайн с возможностью более точного определения таких важных характеристик процесса как количество потребляемого кислорода клетками и дыхательного коэффициета биореакторов.

2. Оптимизированы основные параметры микробиологического синтеза штамма E.coli, продуцирующего рекомбинантный человеческий а2-интерферон, при росте на сложных многокомпонентных средах, и выявлены основные факторы, определяющие течение процесса.

3. По предложенной методике масштабирования осуществлен масштабный перенос технологии культивирования процесса биосинтеза рекомбинантного белка а2-инте|

4. Благодаря использованному в работе газовому масс-спектрометру ProLine 2000 для анализа отходящей смеси газов из биохимического реактора, был определён дыхательный коэффициент. Полученные результаты подтвердили справедливость предположений и рассчитанных значений при масштабировании процесса.

5. Разработана математическая модель кинетики процесса микробиологического синтеза и программное обеспечение, позволяющие определять максимальный выход белка при различных режимах работы аппарата и уточнять параметры ведения культивирования при различных начальных условиях.

6. Для анализа гидродинамики в биохимическом реакторе был использован программный пакет Fluent, позволяющий оценить гидродинамическую обстановку в аппаратах объёмами 15, 70 и 300 литров.

135

1. Кондратьева Т.С. Технология лекарственных форм М.: Медицина, 1995.-57 с.

2. Муравьёв И.А. Технология лекарственных форм: Учебник для учащихся фармацевтических училищ. М.: Медицина, 1988 г. 13, 35 с.

3. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. М.: Колосс, 2004. - 296 с.

4. Николаев П.И. Аппаратурное оформление промышленных процессов микробиологического синтеза // Журнал всесоюзного химического общества им. Д.И.Менделеева. -1972. -Т. 17, №5. — С. 504-569.

5. Рубан Е.А., Абрамов А.Б., Соловьев Б.В., Назаркина П.И., Письменный В.В, Опыт использования АСУ ТП при культивировании клеток животных. Сборник научных трудов «Научные основы производства ветеринарных биопрепаратов». М.: 1989. - С. 33-38.

6. Уэбб Ф.Ч. Биохимическая технология и микробиологический синтез.-М.: Медицина.-1969. 630с.

7. Виестур У.Э., Швинка Ю.Э., Рикманис M.A. Биоэнергетические и аппаратурные аспекты создания энергосберегающих систем ферментации // Биотехнология.- 1988. Т. 4, № 2. - С. 235-243.

8. Виестур У.Э., Долгицер Н.С. Способы культивирование микроорганизмов и аппараты.- М.: 1972. — 81с.

9. Данквертс П.В. Газо-жидкостные реакции. М.: Химия, 1973. — 296 с.

10. Калунянц К.А., Голгер Л.И., Балашов В.Е. Оборудование микробиологических производств. — М.: Агропромиздат, 1987. 398 с.

11. Кафаров В.В. Основы массопередачи. М.: Высшая школа, 1972. -496с.

12. Каркмасова М.А., Баснакьян И. А., Мельникова С. А. Фазовое культивирование микроорганизмов // Микробиология.- 1985.- № 2. С. 105109.

13. Николаев А.Н., Воинов Н.А., Емельянов В.М. Интенсификация процессов микробного синтеза в пленочных аппаратах // Биотехнология. — 2000. №6. - С . 75-79.

14. Weber J., Kayser A. Metabolic flux analysis of Escherichia coli in glucose-limited continuous culture. II. Dynamic response to famine and feast, activation of the methylglyoxal pathway and oscillatory behavior // Microbiology. 2005. -№151. P. 707-716.

15. Штербачек 3., Тауск П. Перемешивание в химической промышленности. -М.: ГХИ,- 1963.-416с.

16. Кафаров В.В., Винаров А.Ю., Гордеев JI.C. Моделирование биохимических реакторов. М., Лесная промышленность, 1979. 268 с.

17. Бирюков В.В., Кантере В.М. М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза., Наука, 1985 г.

18. Лацис Я.Я., Селга С.Э., Завелис Я.З., Ясович М.Я., Базилевич Я.Л. Регулятор скорости вращения мешалки пилотных и промышленных ферментеров // В кн. Ферментационная аппаратура. Рига. 1980. — С.72-77.

19. Huanga W.-C., Chenb S.-J., Chena T.-L. The role of dissolved oxygen and function of agitation in hydraluronic acid fermentation. // Biochem. Eng. J. 2006. -V.32. P. 239-243.

20. Bajpai R.K., Reuss M. Compling of mixing and microbial kinetics for evaluating the performance of bioreactors // Can.J.Chem.Eng. 1982.- Vol.60, №3. -P.384-392.

21. Рубан Е.А., Кафаров В.В., Ворошилова JI.A. Аэрация и перемешивание в процессе биосинтеза антибиотиков // Доклад на симпозиуме стран СЭВ.-М.: 1968.-С.10-16.

22. Рубан Е.А., Кафаров В.В., Былинкина Е.С. Исследование перемешивания в аппаратах для биосинтеза антибиотиков // Хим.фарм.журнал. — 1969.- №6. С.33-38.

23. Рубан Е.А. Анализ условий гидродинамики на биосинтез антибиотиков. Сборник докладов конференции молодых специалистов Москворецкого района. -М.: 1970. -С.7-9.

24. Дубинина Г.П. Управление культивированием патогенных микроорганизмов // Микробиология.- 1982. -№12. С. 40-44.

25. Pharmaceutical process scale-up // Edited by Levin M. -New York and Basel: Marcel Dekker Inc., 2002. 564 p.

26. Рубан E.A., Кафаров B.B. Анализ процесса перемешивания в ферментерах при биосинтезе антибиотиков: Тезисы Всесоюзной конференции по биоинженерии «Инженерные проблемы микробиологического синтеза». -М.: 1968.-С.13-17.

27. Antoniewicz M.R., Kraynie D.F. Metabolic flux analysis in a nonstationary system: fed-batch fermentation of a high yielding strain of E. coliproducing 1,3-propanediol. // Metab. Eng. 2007. V.9. P. 277-292.

28. Уонг Д., Кооней Ч., Демайн А., Дуннеп Р., Хемпри А., Лолли М. Герметизация и технология ферментов. М.: Пищевая промышленность.-1983. -336 с.

29. Телишевская Л.Я., Трусова Л.И. Значение углеводов для роста Listeria monocytogenes и Erysipelothrix insidiosa. // Труды Всесоюзного государственного научно-контрольного института ветпрепаратов. 1974. -Т.20.-С. 251-254.

30. Работнова И. Л. Физиология микроорганизмов и управляемое культивирование // Успехи микробиологии. -1990. -№24. С. 88-97.

31. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. -М.:Мир, 1978.-331С.

32. Петрова Т.А., Степанова Н.В. Интермедиальные модели роста микроорганизмов // Микробиология. -1990. -Т.59, №1. — С. 43-51.

33. Масштабный переход в химической технологии. / Под ред. А.М.Розена. -М.: Химия, 1980.-319с.

34. Maranga, L., Cunha А., demente J., Cruz P., and Carrondo M. J. T. Scale-up of Virus-like Particles Production: Effects of Sparging, Agitation and Bioeractor Scale on Cell Growth, Infection Kinetics and Productivity. Biotechnol. 2004. 107: 55-64.

35. Badino Jr, А. С., M. C. R. Facciotti, and W. Schmidell. 2001. Volumetric Oxygen Transfer Coefficients (kLa) in Batch Cultivations involving Non-Newtonian Broths. Biochem. Eng. 8: 111-119.

36. Martinov, M., and S. D. Vlaev. 2002. Increasing Gas-Liquid Mass Transfer in Stirred Power Law Fluids by Using a New Saving Energy Impeller. Chem. Biochem. Eng. 16: p. 1-6.

37. Chisti Y.: Build better industrial bioreactors. Chem. Eng. Progress 88, 1992 P. 55-58.

38. Kling К., Mewes D. Two-colour laser induced fluorescence for the quantification of micro- and macromixing in stirred vessels // Chem. Eng. Sei. -2004. V.59. P.1523-1528.

39. Бекер M.E., Лиепинып Т.К., Райпулис Е.П. // Биотехнология. М.: Агропромиздат, 1990 г. - сс. 193-195.

40. Пасет Б.В., Кузнецова Т.Е. Основы химической технологии — СПб, 1996 г.-24 с.

41. Srivastava P., Bhattacharaya Р., Pandey G., Mukherjee K.J. Overexpression and purification of recombinant human interferon alpha2b in Escherichia coli., Protein Expression and Purification, 41. 2005, 23-37 p.

42. Fersht A.R. Biophysical Analysis of the Interaction of Human Ifnar2 Expressed in E. coli with IFNa2. Mol. Biol. -2002, P. 68.

43. Любецкая A.B., Рубанов Л.И., Гельфанд М.С. Применение потоковой модели для изучения метаболизма Escherichia coli. М. Биохимия, Т 71, вып. 11.2004.-С. 34-45.

44. Arratia P.E., Lacombe J.P., Shinbrot Т., Muzzio F.J. Segregated regions in continuous laminar stirred tank reactors // Chem. Eng. Sei. 2004. P. 1481-1490.

45. Алюшин M.T. Актуальные проблемы фармацевтической технологии. М.: Медицина, 1994 г. 43 с.

46. Гавриков A.B. Оптимизация биотехнологического производства субстанций рекомбинантных интерферонов человека для создания на их основе препаратов ветеринарного назначения: Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Москва, 2005. - 13 с.

47. Korz D.J. «Simple fed-batch technique for HCDC of E. coli». Journal of biotechnology, 1995, 19-22 pp.

48. Патрушев Л.И. «Экспрессия генов», «Наука», 2000, - 348 с.

49. Ki Jun Jeong. «Enhanced production of recombinant proteins in E. coli». Applied and environmental microbiology, 2003, 20 pp.

50. Kilander J., Blomstrom S., Rasmuson A., Scale up behaviour in stirred square floculation tanks // Chem. Eng. Sei. 2007. 62. P. 1606-1618

51. Kane, J.K. and Hartley, D.L. Properties of recombinant protein- containing inclusion bodies in E. coli. In Purification and Analysis of Recombinant Proteins (R. Seetharam and S.K. Sharma, eds.). Marcel Dekker, New York, 1991. P. 121-145.

52. Patent US 4,962,091 October 9. Controlled release of macromolecular polypeptides. Eppstein; Deborah A. (Palo Alto, CA); Schryver; Brian B. (Redwood City, CA), 1990;

53. Rocha I. Optimisation methods for improving fed-batch cultivation of E. coli producing recombinant proteins. Center of biological engineering, 2002, - 172 pp.

54. Patent US 4,737,462 April 12. Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-.beta. Mark; David F. (Hercules, CA); Lin; Leo S. (Fremont, CA); Yu Lu; Shi-Da (Oakland, CA), 1988.

55. Жибурт Е.Б. Трансфизиология: учебник. СПб: Питер, 2002 г. - 736 с.

56. Xiao-Ming Yang, Lun Xu, Lee Eppstein. Production of recombinant human interferon-al by Escherichia coli using a computer-controlled cultivation process. Journal of Biotechnology, 23, 2003, P. 45-50.

57. Creighton, Т.Е. Proteins: Structures and Molecular Properties, 2nd eds., W.H. Freeman, New York. 1993. P. 293-296.

58. Скоупс P., Якубке Х.-Д., Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, белки. Методы очистки белков. М., 1985. 250 с.

59. Киселёв О.И., Ершов Ф.И., Деева Э.Г. Гамма-интерферон: новый цитокин в клинической практике «Ингарон». М. - СПб. Компания «Димитрейд График Групп», 2007. - 462 с.

60. Alibek К., Liu Ge. Biodefense shield and avian influenza. Emerging infections Diseases. 2006, Vol. 12, p. 873 875.

61. Ершов Ф.И. Антивирусные препараты/Справочник 2-ое издание/ «Геотар-Медиа».- М., 2006, 312 с.

62. Pestka S., Krause C.D., Walter M.R. Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunol Rev., 2004, Vol. 202, p. 8-32.

63. Покровский В.И. Грипп птиц: происхождение инфекционных биокатастроф. Изд. «Росток». СПб., -2005, - 266 стр.

64. Barchet W., Cella М., Colonna М. Plasmacytoid dendritic cells-virus experts of innate immunity. Semin Immunol. 2005 Aug.; 17(4), p. 253-261.

65. Щегловитова O.H. Вопросы вирусологии. Обзор. 2005, 50, 5, с. 4-9.

66. Симбирцев А.С. Иммунология, 2005, №6, с. 368-384.

67. Badriashvili N.R., Chakhunashvili G.S./Interferon system in children with cystic fibrosis // Georgian MedNews-2006, Jul.-V. 136.-p. 7-74.

68. Spencer Т.Е., Johnson G.A., Bazer F.W. at al. Pregnancy recognition and conceptus implantation in domestic ruminants: roles of progesterone, interferons and endogenous retroviruses // Reprod Fertil Dev.-2007- Vol.l9(l).-p. 65-78.

69. Platanias L.C. Mechanisms of type-I and type-II interferon-mediated signaling. Nature reviews immunology, 2005. Vol.5, no. 5, p.375-386.

70. Горячева Л.Г. Терапия вирусных гепатитов у детей с использованием препаратов различного механизма действия // Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова-2006. №4. -186 с.

71. Глумсков В. Мировой фармацевтический рынок: состояние и тенденции. «Эксперт Казахстан» №20 (122), 2007. — 120 с.

72. Аналитический обзор фармацевтического рынка. М.: ЦМИ «Фармэксперт», №5, 2007 г. 29 с.

73. Аналитический обзор фармацевтического рынка. М.: ЦМИ «Фармэксперт», №9, 2007 г. 71 с.

74. Кафаров В.В., Дорохов И.Н. Системный анализ процессов химической технологии. Топологический принцип формализации. - М.: Наука, 1979. - 394 с.

75. Лапшенков Г.И., Зиновкина Т.В., Харитонова Л.Ю. Выбор режима культивирования аэробных микроорганизмов с учетом степени устойчивости процесса. Биотехнология, 2002, № 6.-160 с.

76. Нигматулин Р.И. Механика гетерогенных сред. -М.: Наука, 1978.-336 с.

77. Рудобашта С.П. Массоперенос в системах с твердой фазой. -М.: Химия, 1980.-248 с.

78. Лайтфут Э. Явления переноса в живых системах. -М: Мир, 1977. 520 с.

79. Бекер М.Е., Рапопорт А.И., Калакуцкий Л.В. и др. Торможение жизнедеятельности клеток / Под общ. ред. Бекера М.Е. -Рига: Зинатне, 1987.-239 с.

80. Бирюков В.В., Кантере В.М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза.- М.: Наука, 1985. 292с.

81. Винаров А.Ю., Кафаров В.В., Гордеев Л.С. Перемешивание на микро-и макроуровнях в процессах ферментации. Обзор —- М.: ОНТИТЭИмикробиопром. 1974. - 70с.

82. Винаров А.Ю., Кафаров В.В., Гордеев Л.С. и др. Ферментеры колонного типа для микробиологических процессов.- М.: 1976. — 48 с.

83. Карпов A.M., Саруханов A.B. Физико-химические характеристики продуктов микробиосинтеза. -М.:ВНИИСЭНТИ, 1984. -60 с.

84. Dhotre М.Т., Joshi J. В. Design of a gas distributor: Three dimensional CFD simulation of a coupled system consisting of a gas chamber and a bubble column. // Chem. Eng J. 2007.(125). P. 149-163.

85. Работнова И.Л., Минкевич И.Г. Лимитирование и ингибирование процессов роста и микробиологического синтеза // Пущино. 1976.-208с.

86. Лисенков А.Н., Чумаков М.П., Миронова Л.Л. Системный подход к статистическому анализу и оптимизации процессов биотехнологического производства вакцин // Биотехнология.- 1990. -№ 6. — С. 77-82.

87. Марцулевич H.A., Порото дьяконов И.О., Романков П.П. Масштабный переход при моделировании массообменных процессов в аппаратах сидеальным перемешиванием диспергированной фазы // ТОХТ. -1984. -T.XVIII, №1.-С.З-7.

88. Мельник Н.В. Разработка, усовершенствование и оптимизация промышленных технологий производства диагностикумов и противобактерийных вакцин // Дис. доктора ветеринарных наук. Щелково.-1997.- 280с.

89. Рубан Е.А., Гайденко В.П., Веселов И .Я., Грачева И.М., Уваров И.П. Влияние аэрации и перемешивания на культивирование в ферментерах различной емкости // Микробиологическая промышленность. -1974. -№4. -С.42-44.

90. Palaeht К. MaBstalsiibertragung fur Fest-Flussing Drehscheibenextraktoren bei Euisat zur Extraktion von Biomassen // Abh. Akad. Wiss. DDR Abt. Math, Naturwiss, Techn. 1982.- № 2. - P. 265-292.

91. Sanchez A.M., Bennett G.N., San K.-Y. Efficient succinic acid production from glucose through overexpression of pyruvate carboxylase in an Escherichia coli alcohol dehydrogenase and lactate dehydrogenase mutant. // Biotechnol. Progr.2005. P. 358-365.

92. Wolf K.H. Methoden de MaBstabsubertragug-ihre Möglichkeiten und Grenzen bei fermentativer Prozeassen // Abh. Akad. Wiss DDR. Abt. Math. Naturwiss, Techn. -1981. -№ 3. P. 459-469.

93. Schumpe A., Deckwer W.D. Estimation of 02, C02 solubilities in fermentation media// Biotechn. and Bioeng. -1979.- Vol. 21, №6. -P.1075-1078.

94. Ахназарова C.JI., Кафаров B.B. Методы оптимизации эксперимента в химической технологии: Учеб. пособие для хим.-технол. спец. вузов. М.: Высш. шк., 1985.

95. Nesterov B.F., Vershov D.S., Siborov E.A. Control of the multicomponent gaseus medium in laboratory fermentation apparatus // In.Sth. L-t. Ferment.Sym/Berlin.-1976.-P.26-41.

96. Fabrice G., Christian T. Mixing in industrial Rushton turbine-agitated reactors under aerated conditions.// Chem. Eng. Process. 2003. V.42. P. 373-386.

97. Arratia P.E., Kukura J., Lacome J., Muzzio F.J. () Mixing of Shear Thining Fluids with Yield Stress in stirred tanks. // A.I.Ch.E. J. 2006. - V.52. P. 23102322.

98. Fireoved R.L. Mutharasen R. Meoserment of gas-phase oxyden concentrations with oxyden electrode // Biotechn. and Bioeng. -1982. №9. -P.2109-2113.

99. Alexopoulos H., Maggioris D., Kiparissides C. CFD analysis of turbulence nonhomogeneity in mixing vessels: A two-compartment model. // Chem. Eng. Sci. 2003. P. 1735-1752.

100. Levenspiel O., Chemical Reaction Engineering, 2d ed.3 John Wiley and Sons, Ins., New Jork.- 1972. - 480 p.

101. Касаткин А.Г. Основные процессы и аппараты химической технологии. М.: Госхимиздат, 1960. 277 с.

102. Павлов К.Ф. Примеры и задачи по курсу «Процессы и аппараты химической технологии»: учеб.пособие / П.Г. Романков, А.А. Носков М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2004. - 576 с.

103. Aguiar, W.B., Faria, L.F., Couto, M.A.P.G., Araujo, O.Q.F., Pereira, N., Growth model and prediction of oxygen transfer rate for xylitol production from D-xylose by C. guilliermondii. 2002. Biochemical Engineering Journal 12, P. 4959.

104. Dhanasekharan, K.M., Sanyal, J., Jain, A., Haidari, A. A generalized approach to model oxygen transfer in bioreactors using population balances and computational fluid dynamics. Chemical Engineering Science: 2005. 60, P. 213— 218.

105. Garcia-Ochoa, F., Gormez, E. Theoretical prediction of gas-liquid mass transfer coefficient, specific area and hold-up in sparged stirred tanks. Chemical Engineering Science. 2004. 59, P. 2489-2501.

106. Garrido-Vidal, D., Pizarro, C., Gonzarlez-Saiz, J.M. Study of process variables in industrial acetic fermentation by a continuous pilot fermentor and response surfaces. Biotechnology Progress. 2003. 19, P. 1468-1479.

107. Gormez, E., Santos, E.V., Alcon, A., Martin, A.B., Garcia-Ochoa F. Oxygen-Uptake and mass-transfer rates on the growth of Pseudomonas putida CECT5279: influence on biodesulfurization (BDS) capability. Energy & Fuels 20, 2006. P. 1565-1571.

108. Gonji, S.M., Oddone, S., Segura, J.A., Mascheroni, R.H., Salvadori, V.O. Prediction of foods freezing and thawing times: artificial neural networks and genetic algorithm approach. Journal of Food Engineering 84, 2008. P. 164-178.

109. Gonzarlez-Sariz, J.M., Pizarro, C., Garrido-Vidal, D. Evaluation of kinetic models for the industrial acetic fermentation: proposal of a new model optimised by genetic algorithms. Biotechnology Progress 19 (2), 2003. P. 599-611.

110. Рубан E.A., Бьлинкина E.C., Никитина T.C, Торбочкина Л.И., Сазыкин Ю.О. Анализ и расчет гидродинамического режима работы ферментера //Хим.фарм.журнал, -1972. -№ 10. -С.20-22.

111. Cleveland J., Montvik T.J., Nes I.F., Chikindas M.L., 2001. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation. Int. J. Food Microbiol. 71, P. 120.

112. Рубан E.A., Никаноров Б.А., Гайденко В.П. Обеспечение оптимальных гидродинамических условий в промышленных ферментерах // Экспресс-информация «Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности» .-М.:-1976.-№5-С.8-11.

113. Levenspiel О., Chemical Rea6ction Engineering, 2d ed., John Wiley and Sons, Ins., New Jork.- 1972. -480 p.

114. Дытнерский Ю.А. Основные процессы и аппараты химической технологии: пособие по проектированию / Г.С. Борисов, В.П. Брыков М.: Химия, 1991.-496 с.

115. Diaz A., Acevedo F., 1999. Scale-up strategy for bioreactors with Newtonian and non-Newtonian broths. Bioprocess Eng. 21, P. 21 23.

116. Рубан E.A. Исследование условий перемешивания в ферментерах при биосинтезе антибиотиков. Автореф. дисс. канд. технических наук.- JL:1969.-19 с.

117. Junker В.Н. Scale-up methods for Escherichia coli and yeast fermentation processes. // J. Biosci. Bioeng. 2004. P.347 364.

118. Виестур У.Э., Шмите И.А., Жилевич A.B. Биотехнология (биологические агенты, технология, аппаратура). Рига: Зинатне, 1987.-264 с.

119. Бейли Дж, Оллис Д. Основы биохимической инженерии. М.: Мир, 1989.-Т. 1.-692 с.

120. Иерусалимский Н.Д. Теоретические и промышленные аспекты микробиологического синтеза // Вестник АН СССР.- 1965. -№ 4. С. 42-50.

121. Рубан Е.А., Кафаров В.В. Определение времени перемешивания в аппаратах с мешалкой // Журнал прикладной химии. -1968. №2. - С.301-308.

122. Taguchi Н. The Nature of Fermentation Fluids // In book: Advances in Biochemical Engineering, Berlin — N.Y., Springer Verlag. -1971. P. 1-29.

123. Ishikawa Y., Shoda M., Maruyama H. Design and performance of a new microcalorimetric system for aerobic cultivatijn of microorganisms // Biotechn. and Bioeng. -1981. -Vol.23, №11. -P.2629-2640.

124. Ory, I., Romero, L.E., Cantero, D. Operation in semi-continuous with a closed pilot plant scale acetifer for vinegar production. // Journal of Food Engineering. 2004 63. P. 39^5.

125. Lai R., Peng W., Velazquez-Vargas L.G., Yang G.Q., Fan L.S. Gas-liquid mass transfer in high-pressure bubble columns. // Industrial Engineering Chemistry Research-2004, 32. P. 1302-1311.

126. Tang Y.J., Zhong J.J. Role of oxygen supply in submerget fermentation of Ganoderma lucidium for production of Ganoderma polysachoride and ganoderic acid. Enzyme Microbiology Technology, 2005, 32, P. 478 484.

127. Liu Т., Miura S., Yaguchi M., Arimura Т., Park E.Y., Okabe M. Scale-up of Llactic acid production by mutant strain Rhizopus sp. MK-96-1196 from 0.003 m3 to 5 m3 in airlift bioreactors. //J. Biosci. Bioeng. 2006. V(101). P. 9-12.

128. Dhanasekharan К.М., Sanyal J., Jain A., Haidari A. A generalized approach to model oxygen transfer in bioreactors using population balances andcomputational fluid dynamics. Chemical Engineering Science,60. 2005, P. 213-218.

129. Zhang S.L., Chu J., Zhuang Y.P. A multi-study of industrial fermentation processes and their optimization. // Adv. Biochem. Eng. Biot. 2004, (87). P 97-150.

130. Fregapane G., Rubio-Fernarndez H., Nieto J., Salvador M.D. Wine vinegar production using a non-commercial 100-litre bubble column reactor equipped with a novel type of dynamic sparger. Biotechnology and Bioengineering 63 (2), 2003. P. 141-146

131. El-Enshasy H.A., Mohamed N.A., Farid M.A., El-Diwany A.I. Improvement of erythromycin production by Saccharopolyspora erythraea in molasses based medium through cultivation medium optimization. // Bioresource Technol. 2008. V.99. P. 4263-4268.

132. Feng Q., Mi L., Li L., Liu R., Xie L., Tang H., Chen Z.N. Application of «oxygen uptake rate-amino acids" associated mode in controlled-fed perfusion culture.» // J. Biotechnol, 2006. (122). P. 422-430.

133. Jung H.M., Kim S.Y., Prabhu P., Moon H.J., Kim I.W., Lee J.K. Optimization of culture conditions and scale-up to plant scales for teicoplanin production by Actinoplanes teichomyceticus. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008. P. 21-27.

134. Атикинсон Б. Биохимические реакторы. М.: Пищевая промышленность, 1979.- 280с.

135. Кафаров В.В., Клипинцер В.А., Дудоров А.А. Стохастическая модель не идеального смесителя // ТОХТ.- 1968. -№ 12. — С.793-801.

136. Zhang S.L., Ye B.C., Chu J., Zhuang Y., Guo M.J.,. From multi-scale methodology to systems biology: to integrate strain improvement and fermentation optimization. J. Chem. Technol. Biot. 2006 81, 734-745.

137. Chavan A., Mukheiji S. Dimensional analysis for modelling oxygen transfer in rotating biological contactors. // Bioresour. Technol. 2008. V.99 (9). P. 3721-3728.

138. Dutta S., Hoffmann E., Hahn H.H. Study of rotating biological contactor performance in wastewater treatment using multi-culture biofilm model. // Water Sci. Technol. 2007, №55. P. 345-353.

139. Hall J.F., Barigou M., Simmons M.J.H. Stitt E.H. A PIV study of hydrodynamics in gas liquid high throughput experimentation (HTE) reactors with eccentric impeller configurations. // Chem. Eng. Sci. 2005. №60. P. 6403-6413.

140. Gadkar K.G., Mahadevan R., Doyle F.J. III. Optimal genetic manipulations in batch bioreactor control. // Automatica. 2006.(42). P. 1723-1733.

141. Клонирование ДНК. Методы // Под редакцией Гловера Д., М., Мир, 1988г.

142. Егоров Н.С., Олескин А.В., Самуилов В.Д. Биотехнология. Проблемы и перспективы, Т.1. -М.: Высшая школа, 1987. 159 с.

143. Методы общей бактериологии. Под редакцией Ф.Герхарда и др. — М.: Мир, 1984. Т.2-168 с.

144. Karnaukhova E.N., Reshetova O.S., Semenov S.Y., Skladnev D.A., Tsygankov Y.D. // Amino Acids. 1994. - V.6. - P. 165-176.

145. Березин И.В., Савих Ю.В. "Основы биохимии", МГУ, 1990.

146. Бекетов В.И., Воронина Р.Д., Филатова Д.Г., Зоров Н.Б. // Ж. аналитич. химии. 2000. Т.55. № 12. С 1277-1280.

147. Nagy Z.K., Braatz R.D. Open-loop and closed-loop robust optimal control ) of batch processes using distributional and worst-case analysis. // Journal of

148. Process Control. 2004. 14(4). P. 411-422.

149. Вахитов Т.Я., Момот E.H., Петров JI.H. Стимулятор роста клеток бактерий Escherichia coll Патент России № 2233875, 2004.

150. Вахитов Т.Я., Момот Е.Н., Толпаров Ю.Н. Динамика и функции экзометаболитов в процессе роста периодической культуры Escherichia coli М-17 // Журн. микробиол.- 2005.- № 1.- С. 16-21.