автореферат диссертации по процессам и машинам агроинженерных систем, 05.20.02, диссертация на тему:Лазерно-оптические методы и технические средства многопараметрической диагностики растений и плодов

005532090

На правах рукописи

БУДАГОВСКАЯ Ольга Николаевна

ЛАЗЕРНО-ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И ТЕХНИЧЕСКИЕ СРЕДСТВА МНОГОПАРАМЕТРИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ РАСТЕНИЙ И ПЛОДОВ

Специальность 05.20.02 - электротехнологии и электрооборудование в сельском хозяйстве

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени доктора технических наук

15 АВГ 2013

МОСКВА 2013

005532090

Диссертация выполнена в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт садоводства имени И.В. Мичурина» Рос-сельхозакадемии и в Федеральном государственном бюджетном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный агроинженер-ный университет имени В.П. Горячкина»

Научный консультант: Башилов Алексей Михайлович,

доктор технических наук, профессор

Официальные оппоненты: Шогенов Юрий Хасанович,

доктор технических наук, профессор, заведующий сектором электрификации и автоматизации отделения механизации, электрификации и автоматизации Россельхозакадемии, г. Москва

Лямцов Александр Корнилович,

доктор технических наук, профессор, заведующий лабораторией электрооптических технологических установок ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт электрификации сельского хозяйства», г. Москва

Соловченко Алексей Евгеньевич,

доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник кафедры биоинженерии биологического факультета ФГБОУ ВПО "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова"

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский селекционно-технологический ин-

ститут садоводства и питомниководства» Россельхозакадемии, г. Москва

Защита состоится «23» сентября 2013 г., в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д220.044.02 ФГБОУ ВПО «Московский государственный агроин-женерный университет имени В.П. Горячкина» по адресу: 127550, г.Москва, ул. Лиственничная аллея, д. 16а, корпус 3, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан «__»__2013 и размещен «30» апреля 2013 г. на

сайте ВАК http://www.vak.ed.gov.ru и на сайте ФГБОУ ВПО МГАУ http://www.msau.ru

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат технических наук, доцент

Андреев

Сергей Андреевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Рост населения Планеты, сопровождающийся снижением плодородных площадей, требует рационального использования ресурсов и энергии, затрачиваемых на производство и хранение сельскохозяйственной продукции. Этому способствует прецизионное земледелие, которое невозможно без адекватной комплексной оценки жизнедеятельности возделываемых культур. Несмотря на социальную и научную значимость, проблема диагностики растительных организмов разработана недостаточно и требует качественно новых решений.

Специфика оценки функционального состояния растений заключается в том, что они представляют собой открытые динамические системы со способностью к онтогенезу (индивидуальному развитию) и гомеостазу (поддержанию постоянства параметров и функций при изменении условий внешней среды). Ответные реакции таких организмов могут иметь различные проявления, которые в существенной степени зависят от фазы развития, условий обитания, а также вида раздражителя и его интенсивности. Из этого вытекает необходимость многопараметричности измерений в сочетании с высокой скоростью и минимальным влиянием на исследуемый объект.

•Существующие методические подходы, как правило, позволяют регистрировать лишь отдельные биологические показатели: биохимические, физиологические, морфологические и т.п. Однако наиболее полную информацию о жизнедеятельности растений представляет анализ их структурно-функционального статуса, включающий оценку микроструктурной организацию ткани, фотосинтетических процессов и метаболической активности. Для этого используют разнообразные способы и устройства, что делает измерения длительными, трудоёмкими и дорогостоящими. Во многих случаях они носят разрушающий характер.

Российский и зарубежный опыт в области измерений биологических объектов показывает широкие возможности оптического излучения. Значительный вклад в решение вопросов создания и совершенствования технической и методологической базы электрофизической диагностики растительных организмов оптическими средствами внесли исследования В.В. Альта, A.M. Башилова, И.Ф. Бородина, В.А. Веселовского, A.C. Ильинского, Ю.В. Казимирко, В.А. Караваева, C.B. Климова, Ю.Д. Корнеева, Э.В. Кувалдина, И.С. Лискера, Ю.И. Посудина, С.А. Родикова, В.И.Старовойтова, Т.М. Шадчиной, Н. Kautsky, H.K. Lichtentrhaler, G.E. Rehkugler, A. Zdunek и др.

Несмотря на большие потенциальные возможности оптических технологий, в биологии, а тем более растениеводстве, они используются недостаточно эффективно. Большинство существующих методов и приборов основаны на измерении амплитудных (цветовых, спектральных или люминесцентных) параметров излучения. Поэтому с их помощью невозможно решать задачи, связанные с количественной оценкой микроструктурных изменений растительных тканей и клеток.

Комплексная диагностика растений и плодов может быть осуществлена средствами когерентной лазерной оптики. Её преимущество заключается в использовании не только энергетических, но и статистических характеристик оптического излучения, что позволяет по амплитудно-фазовым параметрам светорассеяния определять структурно-функциональный статус исследуемых организмов.

Таким образом, актуальная проблема создания неразрушающих методов и технических средств комплексной диагностики растений и плодов требует системного подхода. Он заключается в анализе, теоретическом обосновании и экспериментальной проверке влияния физических и биологических факторов на процессы взаимодействия когерентного излучения с растительными организмами; в разработке кон-

цепции многопараметрической оценки их структурно-функционального состояния средствами когерентной лазерной оптики; в теоретическом и экспериментальном обосновании основных элементов проектирования оптико-электронной аппаратуры для технической реализации комплексной диагностики.

Цель исследования. Повышение эффективности диагностики сельскохозяйственных растений и плодов в процессе селекции, выращивания и хранения посредством создания лазерно-оптических методов и средств многопарамегрической количественной оценки структурно-функционального состояния их тканей.

Поставленная цель предполагает в качестве объекта исследования процессы светорассеяния когерентного электромагнитного излучения и их связь со структурно-функциональными характеристиками растительных тканей, а предмета исследований - методы и технические средства многопараметрической диагностики растений и плодов по амплитудно-фазовым параметрам светорассеяния когерентного лазерного излучения.

Для достижения поставленной цели были выдвинуты следующие задачи:

1. Провести критический анализ существующих методов и средств неразру-шающей оптической диагностики растений и плодов; определить пути повышения их эффективности. •

2. Разработать концепцию неразрушающей многопараметрической диагностики растений и плодов средствами когерентной лазерной оптики.

3. Разработать физико-математические модели светорассеяния когерентного излучения растительными тканями и структурами в режиме отраженного и проходящего через объект лазерного пучка.

4. Исследовать влияние структурно-функционального состояния растительных тканей на амплитудно-фазовые характеристики рассеяния лазерного излучения.

5. Разработать комплекс оптических показателей для количественной оценки структурно-функционального статуса растительных тканей.

6. Теоретически и экспериментально обосновать параметры оптико-электронного оборудования для технической реализации комплексной диагностики растительных организмов.

7. Создать семейство лазерных диагностических приборов, провести их экспериментальную апробацию, внедрение и оценку технико-экономической эффективности.

При решении теоретических и прикладных задач были использованы классические физические методы анализа распространения когерентных электромагнитных волн в неоднородной среде, в частности: теория фазового экрана; а так же методы биофизики, физиологии растений, математического, компьютерного и физического моделирования, планирования экспериментов и компьютерной обработки данных; теоретические основы конструирования оптико-электронных приборов.

Организация исследований, биологические материалы и технические средства. Представленная работа выполнена в ГНУ ВНИИС имени И.В. Мичурина и в ФГБОУ ВПО МГАУ имени В.П.Горячкина в рамках следующих отраслевых и федеральных программ Министерства сельского хозяйства и Российской академии сельскохозяйственных наук: отраслевой тематический план ОСХ-бО комплексной программы 03.03.06 (1980-1985); план НИР и ОКР межведомственной программы «Плоды и ягоды» (19861990); программа «Плоды, ягоды, виноград, субтропические и декоративные культуры», задание №08.04.И1-М5 (1990-1995); Федеральная программа фундаментальных и прикладных исследований по научному обеспечению развития АПК РФ задание 19 «Разрабо-

тать научные основы системы производства сохранения и доведения до потребителя высококачественных плодов и ягод» (1995-2000); задание 04.19.03 «Установить биологический потенциал садовых, субтропических растений и винограда, разработать методы управления продукционным процессом, создать методы определения физиолого-биохимических показателей устойчивости к действию биотических и биотических стрессов садовых растений и винограда» (2000-2005); задание 04.16.02 «Разработать методы выявления эколого-физиологических механизмов оптимизации, стабилизации и управления продукционным процессом и качеством продукции, модели оптимизации размещения многолетних насаждений» (2005-2010); задание 04.16 «Разработать адаптивную стратегию интенсификации растениеводства для создания новых сортов и гибридов культурных растений, конструирования высокопродуктивных, экологически устойчивых ресурсосберегающих технологий возделывания с.-х. культур на основе нового поколения технических средств с учетом глобального и локального изменения климата» (2010-2015).

Для экспериментов использовали растения различных видов и сортов плодово-ягодных, субтропических, овощных, зернобобовых, цветочных и декоративных культур, которые произрастали на опытных участках ГНУ ВНИИС имени И.В. Мичурина, ГНУ ВНИИГиСПР имени И.В. Мичурина (г. Мичуринск), ГНУ ВНИИЦиСК (г. Сочи). Часть исследований проводилась в Германии, в институте садоводства и овощеводства Рейнского университета (г. Бонн).

Для модификации функционального состояния растительных организмов применяли различные факторы биогенной (вирусная и грибная инфекция, искусственное и естественное заражение) и абиогенной (химические и физические) природы. Источником зондирующего излучения служили полупроводниковые и газовые лазеры и светодиоды. Светорассеяние в растительных тканях изучали на разработанном автором оборудовании и по авторским методикам. Параллельно с этим проводили оценку функционального состояния растений и плодов с привлечением типовых методик, приборов и специалистов соответствующего профиля.

Научная новизна исследований

1. Выдвинута и теоретически обоснована научная концепция многопараметрической диагностики растений и плодов, основанной на анализе микроструктурной организации ткани, функционального состояния фотосинтетического аппарата и метаболической активности клеток средствами когерентной лазерной оптики.

2. Разработаны физико-математические модели светорассеяния лазерных пучков растительными тканями, позволившие установить связь между показателями, характеризующими морфофизиологичеекое состояние растительных организмов и параметрами физических процессов распространения и трансформации когерентного излучения в их тканях.

3. Выявлены неизвестные ранее закономерности влияния структурно-функциональных свойств растительной ткани и параметров зондирующего лазерного пучка на амплитудно-фазовые характеристики светорассеяния.

4. Показано, что при лазерном зондировании фотосинтезируюших тканей необходимо учитывать комбинированную природу регистрируемого оптического сигнала, содержащего два компонента: люминесцентный и рэлеевский, различающихся по статистической упорядоченности.

5. Теоретически и экспериментально обоснованы новые элементы комплексной диагностики растений и плодов средствами когерентной лазерной оптики:

- количественная оценка микроструктурной организации растительной ткани по степени когерентности или радиусу корреляции рассеянного лазерного пучка;

- оценка функционального состояния фотосинтетического аппарата растений по динамическим показателям фотоконверсии, индуцированной интенсивным монохроматическим излучением;

- оценка метаболической активности растительных клеток и субклеточных структур по вариабельности амплитудно-фазовых параметров светорассеяния.

6. Предложены ранее не использовавшиеся в исследовательской практике показатели и алгоритмы обработки данных для многопараметрической оценки структурно-функционального статуса растительных тканей по амплитудно-фазовым параметрам светорассеяния когерентного лазерного излучения и динамики их светоин-дуцированного изменения.

7. Разработаны принципы конструирования лазерного оборудования и установлены оптимальные параметры технических средств для осуществления комплексной диагностики в рамках единой оптико-электронной схемы.

8. Создано семейство компьютеризированных лазерных приборов, позволяющих реализовать принципиально новые способы неразрушающей многопараметрической диагностики растений и плодов в процессе их жизнедеятельности.

Теоретическая значимость и практическая ценность исследований

Теоретическая значимость исследований заключается в разработке концепции неразрушающей многопараметрической диагностики, основанной на количественной оценке комплекса морфофизиологических показателей растений и плодов, отражающих различные процессы их жизнедеятельности. Выявлены закономерности светорассеяния, расширяющие представления о взаимодействии когерентного электромагнитного излучения с биологическими системами и структурами. Для описания механизма этих закономерностей предложены физико-математические модели, устанавливающие связь между амплитудно-фазовыми параметрами когерентного излучения рассеянного растительным организмом и его структурно-функциональным состоянием. Предложенные теория и оптическая схема регистрации фазовых параметров светорассеяния для неразрушающей оценки структурных перестроек растительной ткани способствуют развитию новых направлений в научных исследованиях и практическом использовании средств фотоники в сельском хозяйстве. Разработанные автором способы регистрации и анализа комбинированного сигнала, состоящего из люминесцентного и рэ-леевского компонент, дают возможность выявлять качественно новые зависимости амплитудно-фазовых характеристик светорассеяния от функционального состояния фо-тосинтезирующего аппарата (фотосинтетической активности, устойчивости к фотоин-гибированию и фотодекструкции, антиоксидантного потенциала). Выявлена связь флуктуации амплитудно-фазовых параметров лазерного излучения, рассеянного растительной тканью, с её метаболической активностью. Разработанные принципы конструирования оптико-электронного оборудования и алгоритмы обработки получаемой с его помощью информации, обеспечивают неразрушающую многопараметрическую диагностику растений и плодов в режиме реального времени.

Созданные на основе предложенных теоретических положений методы и технические средства лазерной диагностики могут применяться в различных сферах экспериментально-исследовательского и практического растениеводства, в научных и экологических исследованиях, учебно-образовательном процессе. Полученные в диссертационной работе результаты способствуют совершенствованию технической базы оптических методов исследования растительных организмов. Новые способы и устройства позволяют обеспечить количественный многопараметрический анализ структурно-функционального статуса растений и плодов без их повреждения; вы-

полнение измерений в режиме реального времени без дополнительных операций по предварительной подготовке объектов; устранение субъективности оценок; применение современных цифровых технологий съема и обработки данных. Созданные приборы повышают эффективность диагностики растительных организмов, снижают её трудоемкость и энергоемкость.

Достоверность полученных результатов, рекомендаций и выводов, содержащихся в диссертации, подтверждается корректным использованием известных теоретических положений; применением современных средств и методов проведения исследований, непротиворечивостью полученных результатов базовым знаниям; репрезентативностью и статистическим анализом данных; совпадением теоретических и экспериментальных результатов; практикой многолетней эксплуатации методов и оборудования, разработанных автором.

Положения, выносимые на защиту:

1. Концепция многопараметрической диагностики растений и плодов по амплитудно-фазовым параметрам светорассеяния когерентного оптического излучения их тканями.

2. Физико-математические модели светорассеяния лазерного пучка и анализ преобразования сигналов в оптическом тракте, позволившие получить связь между параметрами, характеризующими структурно-функциональное состояние растительных тканей и физическими особенностями распространения и трансформации когерентного лазерного излучения в них, а именно:

- между микроструктурой ткани и степенью пространственной когерентности рассеянного лазерного излучения;

- между метаболической активностью клеток и флуктуациями амплитудно-фазовых параметров светорассеяния;

- между устойчивостью хлорофилл-содержащих тканей к фотоингибированию и фотодеструкции, их фотосинтетической активностью и параметрами фотоконверсии комбинированного сигнала светорассеяния в процессе взаимодействия лазерного пучка с фотосинтезирующими органами растений.

3. Принципы конструирования и результаты оптимизационных исследований параметров приборов, способы и алгоритмы обработки информации, обеспечивающие техническую реализацию лазерно-оптических методов диагностики растений и плодов.

4. Лазерно-оптические методы и технические средства, обеспечивающие увеличение эффективности диагностирования функционального состояния сельскохозяйственных растений и плодов в процессе селекции, выращивания и хранения.

Реализация и внедрение результатов исследований

В научно-исследовательскую и производственную практику внедрены следующие результаты диссертационной работы:

1. Концепция многопараметрической диагностики растений и плодов по амплитудно-фазовым параметрам светорассеяния когерентного оптического излучения их тканями.

2. Способы и устройства неразрушающей оптической диагностики растений и плодов (патенты РФ: №2016671, №2113707, №2222177, №2225691, №2342825, № 2352104, № 2360402, № 2364077, № 2384045, № 2448454, № 2453106).

3. Принципы конструирования и оптимизации параметров лазерного оборудования для многопараметрической оценки структурно-функционального состояния тканей растительных организмов.

4. Оптико-электронное оборудование серии LPT (макетные, экспериментальные и опытные образцы).

Практическое применение выполненных научно-технических разработок подтверждается актами внедрения опытных образцов оборудования и методиками проведения исследований от научно-исследовательских институтов, высших и учебных учреждений, агропромышленных предприятий. Методы и приборы прошли успешные испытания их практического использования для оценки функционального состояния и оптимизации агротехнических приемов выращивания растений яблони, смородины, земляники, цветочных культур, культуры хлореллы, растений in vitro. Результаты исследований и документация переданы для освоения мелкосерийного производства в ООО «НТОП «Сатурн-1» и ООО «Современные системы управления» (г. Москва).

Апробация результатов исследований

Основные положения и результаты работы доложены на: International Ecological Congress (Voronezh, 1996), Международной конференции «Физиология растений - наука 3-го тысячелетия» (Москва, 1999), Втором съезде биофизиков России (Москва, 1999), Четвёртом съезде общества физиологов растений России (Москва, 1999), Международной конференции «Электромагнитные излучения в биологии» (Калуга, 2000), Третьем съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001), Первой всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям (С.-Петербург, 2002), VIII Международной научной экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004), Международной научно-технической конференции «Автоматизация сельскохозяйственного производства» (Углич, 2004), Международной специализированной выставке «Laser 2005» (Москва, 2005), Международных выставках «Фотоника» (Москва, 2007, 2009, 2010), International Conference on Laser Applications in Life Sciences (Moscow, 2007), Всероссийской Школе-конференции «Вопросы физиологии растений в садоводстве» (Мичуринск, 2009), Международном семинаре «Опыт внедрения лазерных технологий в сельском хозяйстве» (Москва, 2009), Международной научно-практической конференции «Реализация биологического потенциала плодовых и ягодных растений в нестабильных условиях внешней среды» (Москва, 2011), Международной научно-практической конференции «Фотоника в сельском хозяйстве и природопользовании» (Москва, 2012), Международном семинаре (Россия-Китай) «Физика лазерных процессов и применения» (Рязань, 2012).

Декларация собственного вклада в разработку научных результатов

Обоснование концепции, разработка физических моделей, их экспериментальная проверка, анализ полученных результатов, описание исследований, формулировки положений и выводов сделаны лично соискателем. Проведенные исследования, разработанные технические устройства выполнены самостоятельно или под его руководством и непосредственном участии. Более половины объема опубликованных работ написаны без соавторов, а в остальных доля его вклада превышает 25 %. Участие в проделанной работе специалистов биологов и разработчиков программного обеспечения отражено в совместных публикациях.

Публикации. По теме диссертационных исследований опубликовано свыше 150 научных работ, включая монографию, 2 методические рекомендации, 11 патентов, более 30 работ в журналах, рекомендованных ВАК, 18 - в зарубежных изданиях. Объём всех публикаций по теме исследований превышает 90 авторских печатных листов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введений, семи глав, заключения и приложений. Основной текст изложен на 420 страницах, вюно-

чая 291 рисунок и 67 таблиц. Перечень цитируемых источников информации включает 665 наименований, из них 251 - на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ В первой главе представлен анализ теоретических и практических вопросов оптической диагностики растений и плодов, выявлены пути её совершенствования, обоснованы цель и задачи исследований.

В условиях перехода к прецизионному земледелию необходимы эффективные методы и технические средства оценки функционального состояния растений и плодов в процессе их жизнедеятельности. Предназначенная для этого аппаратура должна удовлетворять следующим требованиям: неразрушающий характер измерений в режиме in situ (на месте); высокая производительность; универсальный (неспецифический) характер получаемой информации; низкая трудоемкость и компьютеризация измерений. На растения в процессе их жизнедеятельности действует большое количество климатических и антропогенных факторов, а характер ответных реакций растительного организма в существенной степени зависит от отногенетической программы и фазы его развития, вида, силы, комбинации и длительности действующих факторов. Выход ищут в комплексном анализе структурно-функционального состояния растительных организмов с привлечением нескольких различных методов, позволяющих оценивать структурные перестройки растительной ткани, функциональные изменения фотосинтетического аппарата и активность метаболических процессов. В настоящее время ни в России, ни за рубежом не существует способов и приборов, позволяющих проводить такой комплексный анализ в режиме реального времени и без повреждения растительных тканей. Используемые методики оценки структурных перестроек, метаболической активности и устойчивости к фотоингибированию отличаются высокой трудоемкостью, деструктивным характером измерений, субъективностью получаемых оценок, необходимостью привлечения дорогостоящего оборудования и квалифицированного персонала для его обслуживания.

Наиболее перспективны для решения данной проблемы оптические измерительные технологии. Проведенный анализ достижений, полученных в этой области за последние 40 лег исследователями МГАУ им. В.П. Горячкина, МГУ им. М.В. Ломоносова, ИФР (г.Москва); ИБФ (г. Пущино); Сибирских отделений АН и РАСХН; АФИ и ВИИЗР (СПб); ВНИИС им. И.В. Мичурина, стран СНГ и дальнего зарубежья, показал следующее: 1. Существующие оптические приборы, включая системы технического зрения, и неразрушающие методики исследований функционального состояния растений и плодов основаны на их колориметрических, спектрофотометрических и люминесцентных свойствах. Но поскольку изменения цвета и спектров поглощения, отражения, люминесценции связаны только с модификацией биохимического состава растительных тканей, то известные способы в принципе не способны решать задачи диагностики, требующие оценки структурных перестроек. К ним относятся: дефектоскопия механических повреждений плодов и овощей (сдиры, проколы, ушибы, сетка, градобоины и т.п.); латентные фазы старения, репарации, развития грибной и вирусной инфекций; онтогенетические особенности микроструктурного строения и т.п. Иногда с помощью амплитудных методов удаётся зарегистрировать трансформацию структуры, но лишь на самой заключительной, необратимой стадии, включающей и биохимические изменения. Но на этом этапе меры защиты малоэффективны или бесполезны. В настоящее время для анализа микроструктурных перестроек тканей использует препаративную технику микроскопии.

2. Оптические методы диагностики растений, основанные на связи фотометрических параметров с концентрацией хлорофилла, имеют ряд методических неточностей, приводящих к нестабильному и невоспроизводимому результату при переходе от лабораторных исследований к полевым оценкам. Главным образом это вызвано тем, что не учитывается флуоресценция хлорофилла (ФХ) (и не предпринимаются меры по ее фильтрации). В свою очередь, интенсивность ФХ в существенной степени зависит от свето-температурных условий измерений, мощности и спектрального состава зондирующего излучения, активности фотохимических процессов фотосинтеза. Кроме того, ФХ отличается сложной кинетикой, проявляющейся в 2-4 кратном изменении ее амплитуды в зависимости от длительности засветки в процессе измерений (эффект Каутского). В связи с этим необходимо совершенствовать методику и техническую базу измерений оптических параметров хлорофиллсодержащих тканей растений с учетом комбинированной природы регистрируемого оптического сигнала, содержащего два компонента: люминесцентный и рэлеевский, различающихся по спектру и статистической упорядоченности.

3. Устойчивость растений к фотоингибированию и фотодеструкции является интегральной оценкой их функционального состояния, редокс-потенциала, метаболической активности, адаптивности и в конечном итоге тесно связана с продуктивностью. Однако существующие методы являются чисто лабораторными. Они заключаются в анализе спектральных или люминесцентных характеристик листьев до и после длительного экспонирования (несколько часов), как правило, целых растений интенсивным белым светом от мощных излучателей. Помимо высокой энергоемкости, материалоемкости и трудоемкости, такие измерения носят повреждающий характер, не позволяют проводить оценку состояния растений в процессе вегетации, их реакций на изменение условий обитания. Из-за сложного анатомо-морфологического строения фотосинтезирующих органов и "спектрального распределения источников, не удаётся получить точные оценки дозы, поглощённой клетками, особенно при использовании не монохроматических излучателей. В целом данная методика нуждается в существенном усовершенствовании.

Анализ работ по применению лазеров для исследования растительных объектов в РФ и СНГ (Астафурова Т.П., Венедиктов П.С., Гришин А.И., Дмитриев А.П., Жу-марь А.Ю., Каневский A.B., Ковалев A.A., Кутис И.С., Левин Г.Г., Лискер И.С., Масюк Н.П., Медведев Е.М., Межерис P.M., Миркамилов Д.М., Посудин Ю.И., Палама-рюк В.Е., Сапожникова В.В., Тарусов Б.Н., Царюк О.В.) и странах дальнего зарубежья (Brach E.J., Brada Jr, Buschmann С., Chapelle E.W., Cecchi E.W., Chen Y., Ehret D„ Fejer S.O., Gowin J., Gunasekaran S.A., Heisel Y., Huang L., Jinior R., Koper R„ Lichtenthaler H.K.., Ludeker W„ O'Sullivan V., Oulamara A., Pajuelo M., Popp F.-A., Ren К., Shoji T., Tartachnyk J., Terasaki S., Tribillon G., Tu К., Turner С.Е., Voshchula I.V., Walklate P.J., Wei D., Zdeng В., Zdunek А.) позволяет сделать следующие выводы:

1. Лазер в основном применяют как источник с высокой спектральной яркостью и малой расходимостью для возбуждения люминесценции и дистанционного измерения формы и размера растительных объектов. Фазовые методы исследования структурных особенностей живой материи воплощены только в интерференционном микроскопе Линника, имеющего низкую виброустойчивость и предназначенного для лабораторной работы с оптически прозрачными тонкими срезами-препаратами.

2. Несмотря на сочетание таких уникальных и взаимообусловленных свойств лазерного излучения, как высокая пространственная и временная когерентность, степень поляризации, монохроматичность, спектральная яркость, низкая расходи-

мость, их не используют в полном объёме и комплексно. Не разработаны теоретические подходы к многопараметрической диагностике растений, нет методик расчета и проектирования лазерной аппаратуры для ее реализации.

Анализ потенциальных возможностей когерентной лазерной оптики показал, что она в принципе позволяет решить проблему комплексной диагностики растений и плодов. Для этого необходим системный подход, объединяющий физическую, биологическую и инженерную методологию на теоретическом, экспериментальном и конструкторском уровнях, что явилось основой сформулированной цели и задач исследований.

Во второй главе описаны структура, методология и техническая база проведения исследований. Их организацию можно отразить следующей схемой: теоретическое обоснование методов измерений <--> математическое и физическое моделирование *-> расчет-обоснование параметров оборудования для проведения экспериментов *-* исследование специфики светорассеяния лазерного излучения растительной тканью <-> экспериментальные исследования по оптимизации параметров рабочих органов оборудования много параметрической диагностики —> разработка и изготовление приборов лазерной диагностики проведение испытаний —»внедрение опытных образцов.

При разработке физико-математических моделей светорассеяния лазерного излучения растительными тканями, математическое описание было дополнено физическим моделированием. Создание необходимой для этого аппаратурной базы проходило с учетом того, что эксперименты в основном будут проходить на плодах и листьях. Для модификации ФСР использовали как климатические условия произрастания, так и различные факторы биогенной и абиогенной природы.

Параметры светорассеяния лазерных пучков растительными тканями исследовали на разработанном автором оборудовании и по авторским методикам. В качестве источников когерентного и квазимонохроматического излучения применяли одномодовые и многомодовые газовые, полупроводниковые и твёрдотельные лазеры, светодиоды различной мощности и длины волны. Так как ширина спектра излучения полупроводниковых источников зависит от тока накачки (рис.1), то для каждого конкретного излучателя её оценивали с помощью спектроанапизаторов.

А Б

Длина волны, ни Д™на волны, нм

Рис. 1. Спектры излучения светодиода І_-533РС-Р (А) и полупроводникового лазерного модуля Н1Л>РМ-10 (Б) в зависимости от тока накачки.

Мощностью, плотностью мощности и диаметром пучка зондирующего излучения управляли электронными блоками питания, введением в оптический тракт нейтральных

светофильтров, изменением расходимости потока излучения. Выходную мощность определяли калориметрическим измерителем мощности ИМО-2Н (Россия), полупроводниковыми приборами VEGA Ophir (Израиль) и ИМ 1-2 (Россия). Ширину спектральных линий контролировали анализатором спектров SOLAR F150-2-36-48USB (Беларусь) и спекгроф-луориметром JY3CS (Франция). Преобразование оптического сигнала в электрический осуществляли с помощью фотодиодов ФД-7К, ФД-24К, ФД-263; аналоговых и цифровых видеокамер фирм Sony (Япония), Logitech (Швейцария), Defender (Китай).

Экспериментальные исследования потребовали разработки и изготовления специализированных оптико-электронных узлов и электронных макетных схем, осуществляющих стабилизированное питание излучателей, линейное усиление сигнала фотодетекторов; предварительную обработку информации и заданные режимы управления процессом измерений. Для функциональной диагностики растений и плодов использовали также стандартные методы и приборы: портативные хлорофилл-флуориметры Uníor-РАМ, РАМ-2000 (Германия) и ИФСР-2 (Россия); ИФА-фотометр MR-600 (США), хло-рофиллометр DA-meter (Италия), пенетрометр FT327 (Италия) и др.

Разработана методика относительной калибровки видеосигнала цифровых 8-ми битовых видеокамер, позволяющая существенно увеличить линейность, динамический диапазон внутрикадровой оцифровки и снизить ошибку при оценке контраста интерференционной картины при различных уровнях входного сигнала.

В третьей главе изложены теоретические и экспериментальные основы получения комплексной информации о структурно-функциональном состоянии растений и плодов без повреждения тканей, с помощью амплитудно-фазовых параметров светорассеяния лазерного излучения и динамики их изменения в процессе измерений.

Теоретически обоснована количественная оценка микроструктуры растительной ткани по степени пространственной когерентности (СПК) и радиусу корреляции (Re) рассеянного объектом лазерного пучка методом поляризационной и спекл-интерферометрии. На базе физико-математической модели стационарного случайного фазового экрана с Гауссовым типом распределения фазовых неоднородностей определены теоретические зависимости СПК и Re от среднего размера фазовых неоднородностей среды а, и разности хода s поляризационного интерферометра (рис. 2).

Рис. 2. Теоретический вид кривых изменения СПК от разности хода s поляризационного интерферометра и среднего размера фазовых неоднородностей среды а,:

А - не рассеянный лазерный пучок (з = 2г0 » 200 мкм); В - а, = 80 мкм; С - а, = 30 мкм; Re - линия отсчета радиуса корреляции по уровню 0,5.

В соответствии с теоремой Винера-Хинчина корреляционная функция стационарного случайного процесса и его спектральная плотность связаны Фурье-преобразованием, что для одномерного случая можно представить как:

у (s) = J gfy/Je'^di//, где g(y) - спектр распределения разности фаз ц/ = (p(r+s,z) - <p(r,z) в поперечной плоскости рассеянного пучка. Функция распределения разности фаз

О 50 100 150 200

S, мкм

g<^^/) зависит от характера светорассеяния лазерного излучения, определяемого типом неодиородностей объекта и схемой наблюдения рассеянного излучения (отраженный ; или проходящий пучок).

Основными фазовыми неоднородностями растительной ткани являются клеточные стенки, межклеточные и внутриклеточные воздушные пространства, клеточные органеллы, зерна крахмала. Физическое моделирование связи интерференционной картины (ИТК) и спекл-картины с микроструктурой организацией верхней и нижней стороны зрелого листа яблони, проведенное на базе поляризационного интерферометра с разностью хода з = 75 мкм, подтверждает работоспособность интерферомет-рических методов оценки структурных различий растительной ткани (рис. 3).

Рис. 3. Вид интерференционных картин, полученных при отражении лазерного пучка от верхней (слева) и нижней (справа) сторон листа яблони с помощью поляризационного интерферометра.

Обоснована ' неразрушающая диагностика метаболической активности тканей, основанная на регистрации клеточной и цитоплазматической подвижности, по флуктуации СПК или по интенсивности мерцания спекл-картины рассеянного лазерного пучка во времени. Перемещение клеточных и субклеточных структур приводит к изменению пространственного распределения фазовых неодиородностей, формирующих интерференционную и спекл-картины, поэтому распределение интенсивности на выходе поляризационного интерферометра описывается выражением: Кг, 0 = 1о + 1е + 2 V/"/' со$(Л<р +АЧ/(Ц), где /' - интенсивность обыкновенного луча, Г- интенсивность необыкновенного луча, А<р - дегерминированная разность фаз, вносимая интерферометром. - разность фаз, вносимая неподвижными фазовыми рассеивателями, ЛЩ) - переменная разность фаз, вносимая подвижными рас-сеивателями. При этом каждая из отдельных волн будет испытывать различные значения фазового сдвига, вызванного движущимися частицами объекта, что в свою очередь является причиной флуктуации интенсивности и контраста детерминированной интерференционной картины и недетерминированной спекл-картины (мерцание спеклов). Физическое моделирование, проведенное на базе специализированного стенда (рис.4) с использованием живых и высушенных тканей растений, подтверждает связь мерцания спеклов с метаболической активностью клеток (рис. 5).

Рис. 4. Схема стенда для проверки гипотезы оценки жизнеспособности растительных тканей по мерцанию спекл-картины. 1 - гелий-неоновый лазер ЛГН -222, 2 - фокусирующая линза, 3 - затвор, 4 - объект, 5 - ограничивающая диафрагма, 6 - фотодиод ФД-7К, 7 - дифференциальный усилитель У7-6, 8 - цифровой мультиметр «Метех МЕ-31», 9 - компьютер.

200 180

Рис.5. Флуктуация интенсивности спеклов, полученная при различных функциональных состояниях листа яблони: живой и сухой лист.

40 20 о

о

50

100

150

200

250 300

Время, с

Экспресс-анализ функционального состояния фотосинтетического аппарата растений может быть осуществлен по степени изменения интенсивности зондирующего излучения растительной тканью (концентрация хлорофилла), по характеристическим показателям индукции флуоресценции хлорофилла (фотосинтетиче- I екая активность) и по изменению параметров светорассеяния в процессе ускоренной искусственной фотодеструкции, инициированной интенсивным лазерным излучением (устойчивость к фотоокислению).

При использовании зондирующего пучка с длинной волны, соответствующей максимуму поглощения хлорофилла в синей или красной областях спектра, рассеянный от растительного объекта оптический поток представляет собой двухкомпо-нентный (комбинированный) сигнал, состоящий из доли прошедшего (отраженного) через лист зондирующего излучения Р,' (рэлеевский компонент) и флуоресценции хлорофилла Рфх (флуоресцентный компонент). Расчетами, проведенными для типового, фотосинтетически активного листа показано, что доля каждой из составляющих светорассеяния в энергетическом эквиваленте примерно одинакова и составляет 2,4...3,8 % от величины падающего потока. Вклад каждого компонента в информационный электрический сигнал на выходе фотоприемного устройства в значительной степени зависит от типа спектральной фильтрации измеряемого потока, спектральной чувствительности фотоприемника и длительности измерений. Последнее вызвано двумя конкурирующими процессами: медленной индукцией флуоресценции хлорофилла (МИФХ), когда флуоресценция снижается по мере освеще- | ния хлоропластов и фотодеструкцией (выцветанием) хлорофилла (ФДХ), приводящей к увеличению доли р/с увеличением световой экспозиции. Амплитуда и скорость спада Рфх зависят от интенсивности засветки и функционального состояния хлоропластов. Величина и скорость подъема Р'„* - от концентрации пигментов, ре-докс-потенциала клетки, спектрального состава и интенсивности зондирующего потока. Физическое моделирование, проведенное с использованием интактных и тер-моинактивированных листьев смородины черной, продемонстрировало практическую возможность оценки функционального состояния фотосинтетического аппарата растений по параметрам комбинированного сигнала светорассеяния (рис. 6).

Теоретически обоснованы основные требования к характеристикам зондирующего лазерного излучения, геометрии оптического тракта, элементам оптико-электронной схемы, алгоритмам сбора и обработки данных экспериментального оборудования, предназначенного для комплексной диагностики структурно-функционального состояния растительных тканей листьев и поверхности плодов.

Расчетным путем установлены условия совмещения оптических схем измерения параметров интерференционной картины, динамики спеклов и фотоконверсии комбинированного сигнала светорассеяния. Для этого необходимо выполнение следующих условий: длина волны зондирующего излучения Я - любая в диапазонах 430...480 нм или 630...680 нм; ширина спектра АХ <2,0нм; выходная мощность — не менее 0,6 мВт (по критерию порога чувствительности датчика НТК) и не более 30 мВт (по критерию лазерной безопасности); угловой размер источника - менее 0,01 рад. Теоретически определены соотношения параметров основных элементов оборудования, обеспечивающие оптимальную геометрию оптической схемы и оптимальный контраст НТК при одновременной оценке параметров детерминированной и недетерминированной интерференции: 10R,< Кцтк)J2sin(xJ2)<0.5R (оптимальная геометрия НТК); arctg2г„//, < 4x10' рад (оптимальный контраст ИТК), где К,Пк - коэффициент передачи оптического тракта между интерферометром и фотоприемной матрицей; /,, - апертура интерференции поляризационного интерферометра; R - размер матричного фотоприемника; 2га- диаметр пучка; Ii - расстояние от объекта до входной диафрагмы поляризационного интерферометра.

Четвёртая глава посвящена установленным закономерностям изменения параметров светорассеяния монохроматического излучения растительной тканью, содержащей хлорофилл. Проведены исследования зависимости комбинированного сигнала и его компонент от характеристик зондирующего потока и функционального состояния фотосинтетического аппарата (ФСА) растений. На этой базе, с позиций комплексной диагностики, проведена оптимизация параметров оптико-электронного оборудования и алгоритмов обработки регистрируемого сигнала. ! При освещении хлорофилл-содержащих тканей излучением синей или красной

области спектра формируется комбинированный сигнал светорассеяния (КОМБ), состоящий из флуоресцентного (ФХ) и рэлеевского компонент. Благодаря этому, при соответствующем подборе параметров излучения, конструкции прибора и ре-j жимов измерения, возможна оценка функционального состояния фотосингетическо-го аппарата по трем категориям: по показателям медленной индукции флуоресцен-| ции хлорофилла (МИФХ), по кинетике искусственной ускоренной фотодеструкции хлорофилла (ФДХ) и по степени восстановления ФСА после фотоингибирования.

Зависимость интенсивности комбинированного сигнала от длительности засветки представляет собой многофазную кривую, которая отражает определенные физические и фотохимические процессы, индуцированные оптическим излучением (рис. 7):

1 фаза (участок О-А) - спад интенсивности светорассеяния с выходом на шгато. I Кинетика и амплитудная выраженность этого спада обусловлены двумя конкурирую-| шими процессами: медленной индукцией флуоресценции хлорофилла (вызывает сниже-

£ 5 о

0 25 50 75 100 125 150 175 200

Время, мин

Рис. 6. Изменение комбинированного сигнала светорассеяния листьев смородины черной после пятиминутного прогревания при температуре: 1 - 30°С, 2 - 50°С, 3 - 80°С. Значения интенсив-ностей нормированы относительно начальных значений засветки (относительные единицы).

ние) и фотодеструкцией (вызывает увеличение) сигнала. При снижении фотохимической активности клеток сокращается длительность данной фазы, уменьшаются относительная амплитуда перепада интенсивности и скорость изменения сигнала;

2 фаза (участок А-В) - нижний стационарный уровень интенсивности светорассеяния. Аналогично первой фазе, также обусловлен двумя процессами, но сигнал не снижается и не увеличивается благодаря тому, что спад флуоресценции компенсируется увеличением рэлеевского компонента из-за снижения поглощения света по мере выцветания хлорофилла. Длительность данной фазы зависит от фотосинтетической активности ФСА и устойчивости к фотоокислению. У ослабленных растений вторая фаза может вообще отсутствовать - увеличение интенсивности наступает сразу же или после небольшого и непродолжительного спада;

3 фаза (участок В-С-Э) - рост интенсивности светорассеяния, вызванный постепенным выцветанием хлорофилла. На этом отрезке преимущественную роль играют процессы ФДХ, которые вносят существенно больший вклад, чем МИФХ. Скорость увеличения сигнала определяется компетентностью антиоксидантной защитной системы, препятствующей фотоокислению хлорофилла;

4 фаза - верхний стационарный уровень вследствие полного разрушения хлорофилла в зоне засветки. Две последние фазы необратимы, более того, реакция фотоокисления хлорофилла не прекращается и при снятии возбуждающего света.

Рис. 7. К описанию основных закономерностей и характеристических показателей кинетики комбинированного сигнала, обусловленного изменением интенсивности светорассеяния хлоро-филл-содержащих тканей растений в процессе длительной засветки монохроматическим излучением.

Для количественного описания кинетики светорассеяния предложены следующие характеристические показатели:

{Ср = (la-lcn)/lo ~ коэффициент фотоконверсии первой фазы светорассеяния - относительное изменение интенсивности в течение фазы О-А, где /„- уровень сигнала в начале засветки, при времени Ти; lcm - уровень сигнала в стационарной фазе, при времени Tcm-,

|а| - скорость снижения интенсивности светорассеяния в течение первой фазы О-А (скорость фотоконверсии). Данный показатель определяется из уравнения, описывающего процесс спада сигнала: lj ", где / - длительность засветки;

Т„ - длительность спада (переходных процессов первой фазы О-А);

- длительность засветки до наступления видимых признаков фотодеструкции хлорофилла, выраженных подъемом интенсивности;

Kß=[I1(t) - Icm]/ICm ~ коэффициент фотоконверсии третьей фазы светорассеяния B-D - относительное изменение интенсивности сигнала /j в течение некоторого времени /, отсчитываемого с начала наступления третьей фазы;

|/?|- скорость увеличения сигнала в течение третьей фазы B-D. Определяется из уравнения, описывающего процесс подъема сигнала: /„„£

Оптимизация спектрального состава зондирующего потока и режимов измерения (,пропускание, отражение) проведена для двух длин волн, соответствующих областям сильного поглощения хлорофилла - 470 нм и 655 им, с интенсивностью, выровненной по квантовому эквиваленту (6500 мкМольхм'2-с'). Критерием оптимизации являлась максимальная разница характеристических показателей между листьями с высокой (Fv/Fm > 0,75) и низкой (Fv/Fm < 0,4) удельной фотосинтетической активностью. Выявлено, что работа в синей спектральной области дает преимущества по чувствительности оценок фотосинтетической активности, а в красной -фотодеструктивных процессов. Критерием оптимизации схемы измерений являлось достижение больших/меньших значений характеристических показателей комбинированного сигнала светорассеяния листьями с высокой удельной фотосинтетической активностью (Fv/Fm > 0,65). Первая фаза кинетики светорассеяния регистрируется практически одинаково для обеих схем измерения (табл. I). При необходимости анализа полного профиля фотодеструкции предпочтителен режим пропускания, так как в этом случае момент наступления фотодеструкции Тф,> регистрируется существенно раньше и значения показателей Кр и ß также значительно больше, чем при оценке отраженного потока.

Таблица I

Характеристические показатели комбинированного сигнала светорассеяния листьев цисуса ромболистного, снятые в режиме пропускания и отражения

Показатели Режим отражения Режим пропускания

К„.% 40,2 ± 12,3 41,2 ± 10,8

а * 100 при t =120 с - 9,9 ± 1,4 - 10,7 ±0,6

Тс„, с 344,6 ± 24,8 180.5 ± 12,4

Тф,), мин 106,4 ±32,6 18.7 ±6,8

Kß при t = 180 мин 0,314 ± 0,08 1,71 ±0,7

fl * 100 (120-240 мин) 0,44 ±0,1 0,9 ± 0,2

Оптимизацию режимов измерения медленной индукции флуоресценции хлорофилла по параметрам комбинированного сигнала проводили на длине волны 470 нм в диапазоне плотности мощности от 100 до 2400 Вт/м2 (рис. 8). Регистрацию рассеянного объектом излучения осуществляли с помощью кремниевого линейного фотоприемника с соотношением спектральной чувствительности в красной и синей областях спектра равной 5/1. Измерения проводили на зрелых здоровых листьях лимона с высокой функциональной активностью ФСА (/у/Рт > 0,6). Максимальную корреляцию (> 0,98) коэффициента Кр и скорости фотоконверсии а между кривыми МИФХ и КОМБ наблюдали при плотности мощности 800 Вт/м*.

Влияние содержания хлорофилла и состояния ФСА листьев на характер кинетики светорассеяния исследовали в двух вариантах функционального состояния фотосисте-мы-2 по критерию удельной фотосинтетической активности (УФА): низкая (Р^/Рт < 0,4) и высокая (Fv/Fm > 0,75) и в двух вариантах концентрации хлорофилла по критерию коэффициента пропускания листа на длине волны 650 нм (А"„л = 3,5 ±0,3 %- темно-зеленый лист; и Кч,= 12,7 ±0,8% - светло-зеленый лист). Ослабление фотосинтетической активности быстрее приводит к падению устойчивости растений к интенсивному свету - фотодеструктивные процессы начинаются существенно раньше и проходят более интенсивно. Выявлено, что характеристические показатели первых фаз светорассея-

ния О-А-В-С практически совпадают у листьев с близким состоянием фотосистемы-2, независимо от их оптической плотности (рис. 9).

Время, с

12-

KOMB

100

Время, с

Рис. 8. Типовые кинетики светорассеяния листьев с высокой функциональной активностью (Ру/Ят > 0,6) в процессе длительной засветки интенсивным монохроматическим излучением. МИФХ - медленная индукция флуоресценции хлорофилла (слева), КОМБ - комбинированный сигнал (справа). Интенсивность зондирующего излучения: 1-100 Вт/м2; 2 - 200 Вт/м2; 3- 400 Вт/м2; 4 - 800 Вт/м2; 5 - 1600 Вт/м2; 6 - 2400 Вт/м2.

е §

250

150 •

100

50

-Кпр=12,74% -Кпр-3,73%

250 200 150 100 50 0

-Кпр=12,74% -Кпр=3,73%

15

Время, мин

Время, мин

Рис. 9. Изменение интенсивности комбинированного сигнала светорассеяния (в относительных единицах, приведённых к начальным значениям) при различной фотосинтетической активности и оптической плотности (концентрации хлорофилла) листьев. А - низкая УФА (Р^т < 0,4); Б - высокая УФА ^/Рт > 0,75).

Оптимизацию диапазона интенсивностей зондирующего потока проводили на основании кинетик светопропускания живых (Fv/Fm > 0,5) и термоинактивирован-ных (Рч/Рт <0,15) листьев. Выявлено, что минимальное значение интенсивности зондирующего потока должно составлять 100 Вт/м2, т.к. при меньших значениях плотности мощности резко снижаются величины показателей Л}/ и |а| даже у здоровых листьев (рис. 10). Экспериментально доказано, что первые фазы кривых светорассеяния «МИФХ» и «КОМБ» от объектов с высокой функциональной активно-

стью (Л'/ґ/и > 0,6) имеют значительную корреляционную связь (не менее 0,96) как при одинаковых, так и при различных плотностях мощности зондирующего потока. Это допускает использование интенсивностей засветки в диапазоне от 800 до 6500 мкМольхм"2-с' при оценке показателей МИФХ как в красной, так и в синей областях спектра без потери информативности (рис. II).

Плотность мощности излучения. Вт/м2

Рис. 10. Зависимость характеристических показателей первой фазы кинетики светорассеяния хлорофилл-содержащей ткани от плотности мощности зондирующего излучения красной области спектра (650 нм). На примере листьев с Fv/Fm = 0,54...0,62.

коме

Рис. 11. Кинетики светорассеяния здоровых листьев (Fv/Fm > 0,6) при использовании излучения синей (слева) и красной (справа) областей спектра. 1 - 800 мкМольхм" с"; 2 -1625 мкМольхм"2 с3 - 3250 мкМольхМ-2с"1; 4 -6500 мкМольхм ^с"1.

Кривые светорассеяния «МИФХ» и «КОМБ» хлорофилл-содержащей ткани с низкой активностью фотосинтеза (Fv/Fm < 0,25) хорошо согласуются только в диапазоне интенсивностей, не вызывающих фотодеструкцию хлорофилла в процессе измерений (рис. 12А). Когда же интенсивность зондирующего потока превышает адаптивные возможности хлорофилл-белкового комплекса к избыточному свету, быстрое фотоингиби-рование и последующее фотоокисление хлорофилла приводят к различному характеру изменения этих кривых. Сигнал светорассеяния, зафиксированный неселективным фотоприемником от объекта, возбуждаемого красным излучением (КОМБ), после незначительного снижения быстро растет, тогда как флуоресцентная составляющая (МИФХ) неуклонно спадает (рис. 12Б). Это позволяет увеличить достоверность оценок функционального состояния растений, а также использовать комбинированный сигнал для ана-

лиза их устойчивости к фотоингибированию. Показано, что оптимальный диапазон плотности мощности засветки, вызывающей ускоренное искусственное выцветание хлорофилла в рамках фотохимических реакций составляет 2000 - 6000 Вт/м2, дальнейшее увеличение интенсивности сглаживает различия между характеристическими показателями фотодеструкции листьев с высокой и низкой фотосинтетической активностью.

А Б

Время.с Время,с

Рис. 12. Типовые кинетики светорассеяния листьев с низкой функциональной активностью (Я/^т < 0,25) в процессе засветки излучением синей (МИФХ) и красной (КОМБ) областей спектра: А - с интенсивностью 1600 мкМольхм2с"', не вызывающей фотодеструкцию в течение времени измерений; Б - с интенсивностью 6500 мкМольхм"2с1, приводящей к разрушению хлорофилла в процессе измерений.

Оптимизация длительности измерений при анализе устойчивости ФСА к фотодеструкции по показателям комбинированного сигнала. Определены коэффициенты корреляции между характеристическими показателями всех фаз профиля светорассеяния. Измерения проводили в режиме пропускания, с использованием зондирующего излучения красной области спектра плотностью мощности 3200 Вт/м2. Выявлена высокая степень статистической связи (более 0,8) между показателями первой и третьей фаз кинетики светорассеяния. Это позволяет сократить длительность измерений при анализе устойчивости к фотодеструкции до единиц секунд. Например, для листьев смородины черной, уравнение регрессии, по которому можно осуществлять прогноз величины показателя Тф,, по результатам пятисекундных измерений, будет выглядеть следующим образом: Тф,-, = 57,94(Кр) - 69,44 (К2 = 0,964).

Оптимизация циклического режима измерений при оценке степени восстановления ФСА после фотоиигибировапия. С помощью серии одно- и многофакторных экспериментов выявлен оптимальный алгоритм циклических измерений: первая засветка и регистрация кинетики светорассеяния - темновая пауза, вторая засветка и регистрация кинетики светорассеяния. Установлена степень влияния интенсивности фотоинги-бирующего излучения, длительности засветок и темновых пауз на скорость восстановления ФСА. Определены режимы, позволяющие осуществлять весь цикл измерений за 1,5-2 минуты. Использование предложенной методики искусственной ускоренной фотодеслрукции лазерным пучком, режима циклической засветки, совмещения действующего и измерительного каналов, позволяют существенно сократить энергоемкость и трудоемкость измерений по сравнению с традиционными методами.

Пятая глава посвящена экспериментальной оптимизации параметров оптической схемы (рис.13) для оценки степени пространственной когерентности светорассеяния и динамики спеклов. Установлена линейная зависимость периода интерференционной картины (Г) от удаления плоскости изображения от поляризационного интерферометра (Л), что позволяет согласовать геометрию НТК с любым фотоприемником. При использовании матричного фотодетектора изображение НТК должно включать от 1,5 до 2,5 периодов для надёжной регистрации максимумов и минимумов полос.

2 3 4

/

Рис. 13. Геометрия оптического тракта. 1 - лазерный излучатель, 2 - объект, 3 - поляризационный интерферометр, 4 - плоскость регистрации с фотоприемной матрицей.

Угловой размер источника зондирующего излучения, который определяется соотношением диаметра зондирующего пучка к расстоянию до входной апертуры интерферометра (2гД/Л является основным фактором, влияющим на аппаратурный контраст НТК и средний размер спеклов. Установлено, что период (7) и геометрия полос ИТК не зависят от углового размера источника, тогда как контраст ИТК и средний размер спекла (4,,) в значительной степени определяются угловым размером зондирующего пучка (рис. 14, 15). При 2/у7, > 0,1 рад, аппаратный контраст ИТК становится менее 50 %, средний размер спеклов - менее 2 пиксель. Для того, чтобы удовлетворить требованиям максимально высокого аппаратного контраста ИТК, достаточного размера спекла (несколько пиксель) и отношения Шнр > 5, угловой размер должен лежать в пределах от 0,02 до 0,06 радиан. Соответственно, оптимальный диапазон варьирования | диаметра пучка для типового расстояния /, > 35 мм составляет 0,8. ..2 мм.

А Б

3 30 ■

X

й 20 ■

Рис. 14. ИТК-А

0.04 0,08 0.12 0,16 0.2 0,24

Угловой размер источника, рад

0.0» 0,12 0,16 0,2 0,24 Угловой размер источника, рад

Зависимость от углового размера источника излучения аппаратного контраста и среднего диаметра спеклов - Б.

Влияние интенсивности зондирующего потока на параметры интерференционной и спекл-картин (рис. 14 и табл.2) оценивали в диапазоне мощностей от 1 до 14 мВт и в диапазоне плотностей мощности от 60 до 5500 Вт/м3. В процессе измерения параметров НТК и спекл-картины предусматривали меры для обеспечения работы на линейном участке передаточной функции фотоприемного устройства. Параметры спеклов от стационарного фазового экрана измеряли в центре максимума ИТК.

Рис. 15. Интерферограммы, полученные от стационарного фазового экрана при различных угловых размерах источника излучения. 1 - 0,01 рад; 2 - 0,06 рад; 3 - 0,24 рад.

Таблица 2

Зависимость параметров спекл-картины стационарного фазового экрана от интенсивности зондирующего пучка

Параметры спекл-картины Интенсивность зондирующего потока

390 Вт/м2 1570 Вт/м2 5500 Вт/м2

Средний размер спекла, пиксель 12,27 ±2,34 13,06 ±2,6 11,84 ±2,22

Средняя интенсивность спекла в течение 30 секунд измерений, усл. ел. 19,87 ±0,053 91,7 ±0,045 387,84 ± 0,3

Ср. кв. отклонение 0,1867 0,652 3,015

Коэффициент вариации, % 0,94 0,711 0,78

Выявлено отсутствие зависимости контраста ИТК и среднего размера спеклов от интенсивности оптического зондирующего пучка. Изменение интенсивности спеклов от времени при условии неподвижности рассеивателей также минимально зависит от мощности излучателя. Это упрощает процесс наладки устройства контроля при переходе на другой объект, с другими оптическими параметрами или при смене фотоприемника. Регулируя мощность зондирующего луча, можно устанавливать необходимые для регистрации уровни сигналов, не внося существенных искажений в аппаратные параметры ИТК и спекл-картины.

Оптимизирован режима сглаживания высокочастотного шума детерминированной интерференционной картины с помощью программы Ма1Ьсас)е (на примере тестовых ИТК с максимальным контрастом и максимальным, размером спеклов). Обоснован алгоритм свертки изображения по вертикали и сглаживания по горизонтали «скользящим средним» (рис. 16).

Оптимизация режимов измерения мерцания биоспекюв при оценке метаболической активности растительных тканей, не содержащих хлорофилл (сухие и живые лепестки ромашки садовой) проведена для следующих параметров измерительного

оборудования: размер зоны измерения (интегрирования спеклов), скорость и длительность регистрации данных, алгоритм обработки данных. Установлено, что корректная оценка функционального состояния непигментированных тканей проходит в широком диапазоне: интенсивности зондирующего излучения (от 60 до 2500 Вт/м"), зоны интегрирования спеклов (один-два порядка), частоты съема данных (от 0,2 до 5 I ц) и длительности наблюдений (от единиц секунд до десятков минут).

Рис. 16. Исходной профиль ИТК тест-объекта (А) и профили распределения интенсивности при: Б - свертка по вертикали, без сглаживания по горизонтали; С - свертка по вертикали и сглаживание по горизонтали скользящим средним с шириной окна 36 пиксель.

Оптимизация алгоритмов анализа мерцания спеклов проведена в отношении следующих пяти приемов математической обработки данных: коэффициент вариации (Ктг); максимальная амплитуда первой производной (А1ц'""х)\ число переходов первой производной через нулевой уровень №,"); число пересечений первой производной (Ммч) некоторого порога д; быстрое преобразование Фурье (БПФ). Сравнивали расчётные показатели ряда данных, полученные при измерении непигментированных участков листьев пестролистных растений с разным функциональным состоянием: живой (Л^/я>0,65) и инактивированный высокой температурой (Ру/Рм < о,3) (рис. 17). Критерий выбора алгоритма - достижение при минимальном времени измерений наибольших и достоверных различий между функционально активными и не активными листьями.

120

150 180

Время измерений, с

Рис. 17. Изменение интенсивности спеклов во времени, измеренное от непигментированных тканей растений (на примере лилейника полосатого).

На графике хорошо заметен сложный характер изменения сигнача. Выделяются низкочастотные колебания с периодом несколько десятков секунд, модулированные сигналом более высоких частот. Для инактивированной ткани характерна низкая

амплитудная выраженность всех составляющих, особенно высокочастотной. Присутствие высокочастотных колебаний дает возможность осуществить количественную оценку метаболической активности ткани по мерцанию спеклов в течение не- ' скольких секунд. Выявлено, что для экспресс-диагностики наиболее репрезентативны алгоритмы расчета коэффициента вариации и числа пересечений первой производной установленного порога (Ы,ц''). Они позволяют получить высокий уро- | вень различий за минимальное время измерений и количество отсчетов (табл. 3).

Таблица 3

Уровень значимости различий мерцания спеклов живой и термоинактивированной не-пигментированной растительной ткани при различных алгоритмах обработки сигнала

Длительность измерений, с (количество отсчетов) Уровень значимости различий

К,иг Adr* N„q(q=2) БПФ

1,5 с (8 отсчетов) 0,920 0,850 Менее 0,20 0,950 Менее 0,70

3 с (16 отсчетов) 0,950 0,900 Менее 0,20 0,980 Менее 0,75

6 с (32 отсчета) 0,980 0,920 Менее 0,20 0,980 Менее 0,75

12 с (64 отсчета) 0,980 0,950 Менее 0,20 0,990 Менее 0,85

192 с (1024 отсчета) 0,990 0,990 0,20 0,999 Менее 0,90

В шестой главе приведены основные результаты экспериментальных исследований функционального состояния растений и плодов, которые подтвердили теоретические положения и позволили выявить специфику светорассеяния лазерного из- | лучения растительной тканью в зависимости от ее структурно-функционального состояния. Установлено, что между основными морфофизиологическими параметрами растительной ткани и амплитудно-фазовыми характеристиками светорассеяния существуют значимые корреляции. Например, связь когерентности рассеянного света (С) с содержанием крахмала (г = - 0,92) совпадает с теоретической моделью - чем выше содержание крахмала в листьях, тем больше центров рассеяния и тем сильнее снижается статистическая упорядоченность света.

Показано, что существенное снижение степени когерентности лазерного пучка происходит при взаимодействии с более чем десятью клеточными слоями, что позволяет проводить оценку структурного статуса любых растительных тканей и органов в режиме отражения и листьев - в режиме как отражения, так и пропускания.

Использование параметра «пространственная когерентность» при оптической диагностике плодов и овощей значительно увеличивает точность распознавания механических дефектов по сравнению со стандартными спектрофотометрическими методами. При этом величина информационного сигнала практически не зависит от помологического сорта, биохимического состояния покровных и сочных тканей плода, времени нанесения повреждений, а определяется только их микроструктурным состоянием (табл. 4). Когерентность отраженного излучения от неповрежденной поверхности большинства фруктов, овощей и корнеплодов свыше 30%, а в зоне механических повреждений типа сдира, прокола, сетки и т.п. - менее 12 %.

Выявлено, что когерентность светорассеяния лазерного пучка от экваториальной зоны плодов груши коррелирует (г > 0,92) с их твердостью, измеренной с помощью пенетрометра (табл. 5). Эта закономерность использована для оценки скорости дозаривания плодов груши (рис. 18) и качества плодов яблони после длительного хранения в обыкновенной (ОГС) и модифицированной (МГС) газовой среде (рис. 19). Величина когерентности светорассеяния от поверхности здоровых плодов 1

и овощей и динамика восстановления показателей в процессе заживления механических повреждений тесно связаны с лежкоспособностыо, устойчивостью к болезням и регенерационным потенциалом покровных тканей (рис. 20).

Таблица 4

Показатель «когерентность светорассеяния» поверхности яблок

сортов Мартовское и Антоновка Обыкновенная различного качества

Покровная окраска Состояние мякоти плода Неповрежденный плод Дефект типа «Сднр кожицы»

Бело-желтая Светлая Побуревшая 0,47 ± 0.03 0.44 ±0.12 0,07 ± 0.02 0.08 ± 0.02

Желто-зеленая Светлая Побуревшая 0,48 ± 0.04 0.42 ± 0.19 0,08 ± 0.02 0.06 ± 0.02

Темно-зеленая С вел лая Побуревшая 0,52 ± 0.06 0.45 ±0.13 0,12 ±0.04 0.08 ±0.02

Светло-красная Светлая Побуревшая 0,48 ± 0.04 0.48 ± 0.09 0,10 ±0.03 0.09 ± 0.02

Темно-красная Светлая I !обуревшая 0,50 ±0.02 0.47 ± 0.08 0,11 ±0.03 0.12 ±0.05

Таблица 5

Результаты инструментальных измерений степени зрелости плодов

Тип плодов, сорт Незрелые плоды Зрелые плоды

Когерентность, О, % Твердость, кг/см" Когерентность, О, % Твердость, кг/см

Груша: Красавица Черненко Августовская Роса Осеннее Яковлева Январская 16,2 ± 1,7 13,9 ± 0,8 11,8 ±2,2 14,5 ± 2,8 6,8 ± 0,4 4,6 ± 0,4 4,4 ± 0,4 5,8 ± 0,4 3,83 ± 1,4 3,65 ± 0,7 6,3 ±13,7 7,2 ± 0,8 1,2 ±0,34 0,65 ± 0,05 1,5 ±0,22 1,2 ±0,35

о -1-.-1-1->-'-1-1

О 3 6 9 12 15 18 21 24 Длительность дозаривания, дни

Рис. 18. Динамика изменения когерентности светорассеяния плодов груши сорта Елена в процессе дозаривания.

□огс

вМГС

Ренет Кичунова Мартовское

Рис. 19. Сравнительная оценка когерентности светорассеяния плодов яблони после 6,5 месяцев хранения в ОГС и МГС.

Разнокачествениость нижней и верхней стороны листа. Как показано на примере зрелых листьев яблони и вишни, величина практически всех амплитудно-фазовых и динамических показателей светорассеяния на 30-200 % выше у верхней стороны листьев (табл. 6). В связи с этим, с целью увеличения динамического диапа-

зона варьирования показателей при тестировании растений по листовым пластинкам, измерения следует проводить от верхней стороны листа.

Рис.20. Когерентность светорассеяния покровной ткани плодов цукини до и после механического повреждения кожицы. Gain Zucchini - устойчивый сорт, Gelb Zuccini - неустойчивый сорт.

Таблица 6

Характеристические показатели светорассеяния листьев яблони и вишни с различным типом микроструктурной организации тканей верхней и нижней стороны листа

Параметр Яблоня Вишня

Низ листа Верх листа Низ листа Верх листа

1с.усл.ед. ¡87,23 ±3,02 119,44 ±4,66 166,92 ±2,64 129,22 ±2,1

G. % 29,15 ±3,31 83,40 ± 0,67 59,95 ± 2,75 82,51 ±0,89

Rc, пиксель 3,36 ±0,152 5,01 ±0,203 4,41 ±0,125 5,03 ± 0,098

к, 0,508 ± 0.024 0,781 ±0,013 0,438 ±0,011 0,725 ±0,015

а,о 0,216 ±0,023 0,569 ±0,034 0,168 ±0,024 0,448 ± 0,006

am 0,708 ± 0,056 1,464 ± 0,042 0,529 ± 0,025 1,446± 0,040

(*6(i 1,156 ±0,057 1,724 ± 0,022 0,949 ± 0,030 1,535 ±0,052

Тс„, с 73,82 ± 2,76 63,64 ± 4,53 90,82 ±5,17 89,16 ± 4,32

Fm, усл. ее). 104,15 ± 1,6 88,34 ±2,7 108,37 ±0,6 82,56 ± 1,5

Fr. усл. ед. 90,83 ± 3,02 58,72 ± 1,67 100,16 ±1,26 61,93 ± 1,31

Fm/F, 1,153 ± 0,028 1,505 ±0,020 1,084 ±0,014 1,337 ±0,032

Установлено, что лазерная диагностика, основанная на регистрации когерентности светорассеяния, имеет существенно большую чувствительность, чем метод флуоресценции хлорофилла к изменениям, происходящим в растительной ткани при грибном заражении (рис. 21). Это позволяет использовать разработанное оборудование в исследованиях развития грибной инфекции, в том числе на фоне действия химических средств защиты, а также оптимизировать режимы обработки растений.

На примере однолетних и многолетних растений показано, что вирусная инфекция проявляется в снижении показателей когерентности и приведенной когерентности (С//) светорассеяния лазерного пучка в режиме пропускания через зрелый лист (аутотрофная стадия развития). Данные лазерного метода диагностики хорошо согласуются с результатами иммунно-ферментного анализа (ИФА). Различия б оптических показателях между контрольными и зараженными растениями достаточны для выявления ослабленных вирусами образцов уже на латентной стадии патогенеза (рис. 22).

Установлено, что процессы старения и заболевание хлорозом сопровождаются значительным (более чем в 2,5 раза) снижением степени когерентности и радиуса корреляции отраженного от поверхности листьев лазерногопучка.

Показана целесообразность использования разработанных методов диагностики для экспресс-оценки реакции растений на токсичные соединения (соли тяжелых ме-

таллов, хлоридное засоление и т.п.). Наиболее чувствительными являются динамические показатели комбинированного сигнала, описывающие скорость изменения когерентности и интенсивности светорассеяния в процессе непрерывного зондирования лазерным лучом листовой пластинки в течение 20-60 с. Так, например, фотосинтетическая активность листьев малины, инкубированных трое суток в 10 мМ растворе хлорида никеля снизилась по показателю удельной фотосинтетической активности, параметру^/Г. (флуориметр итог, Германия) в 1,4 раза, а по динамическому показателю а,(разработанный прибор ЬРТ-ЗКС) - в 5 раз.

1.1 1

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5

- Патоген "

- в, Пат.+ фунг.

- Рч/Рт, Патоген

- Гч/Гт, Пат.+ фунг

- Контроль

0,7

ё о,б 8

I 0,5 Ф

£^0.4

О ф

|5 о.э

| 0.2 £

а. 0.1 С

о

А

"А

96

120

Контроль

АСІвУ

Длительность вегетации, часы

Рис. 21. Оценка функционального состояния листьев огурца после искусственного заражения грибной инфекцией и химической обработки по фотосинтетической активности Р\//Рт и когерентности светорассеяния в (в относительных единицах к контролю).

Исследования, проведенные на многолетних растениях яблони, мандарина, лимона, чая и однолетних растениях показали, что дефицит микро- или макроэлементного питания, проявляется в изменении приведенной когерентности светорассеяния листовых пластинок (рис. 23). Параметры фотоконверсии комбинированного сигнала листьев однолетних растений также значительно варьируют (до 240 %) в зависимости от способов внесения питательных веществ, что позволяет использовать созданные методы и устройства при оптимизации агроприемов с внесением удобрений

Рис. 22 Приведенная когерентность светорассеяния листьев здоровых и инфицированных различными вирусами растений яблони (сорт Вишневое). АС1_3\/ - вирус хлоротической пятнистости листьев; АЭР\/ - вирус ямчатости древесины; АБС\/ - вирус бороздчатости древесины

Контроль

Рис. 23. Амплитудно-фазовая характеристика (6//) зондирующего лазерного излучения, рассеянного листовыми пластинками чая при различном внекорневом питании.

Разработанные методы лазерной диагностики использованы для количественной оценки генетической специфичности растений и связанных с ней хозяйственно-ценных признаков: скороспелость растений фейхоа; потенциальная устойчивость

сортов озимой пшеницы, крыжовника и черной смородины к мучнистой росе (табл. 7); степень плоидности сортов чая и др. Наиболее информативно использование распределения показателей в двумерном пространстве признаков «степень когерентности - интенсивность светорассеяния» лазерного излучения в режиме отражения от верхней стороны листа.

Таблица 7

Параметры светорассеяния листьев озимой пшеницы, смородины черной и крыжовника с различной полевой устойчивостью к мучнистой росе

Сорта G,% I, усл.ед. IO()xG/l Полевая оценка устойчивости к мучнистой росс

Озимая пшеница

BATIS 32,7±0,98 192±9,3 17,3±0,9 Устойчивый

CORTEZ 29,7±0,80 243±1 1,3 12,4 ±0,5 Неустойчивый

Смородина черная

ТИТАНИЯ 32,82±0,5 147,2± 1 ¡ ,4 23.7±1,3 Высокая

ЗЕЛЕНАЯ ДЫМКА 25,76±0,4 147,6±6,9 18,8±0,6 Средняя

ПАМЯТЬ МИЧУРИНА 24,2±0,6 150,6±8,8 16,1 ±0,8 Низкая

Крыжовник

КАЗАЧОК 34,17+0,9 103,7±18,3 32,95±2,2 Устойчивый

ЮБИЛЯР 32,57+0,9 174,8±15,4 18,6±1,6 Неустойчивый

Установлено, что ингибирующее действие экстремальных температур проявляется в уменьшении показателей комбинированного сигнала светорассеяния, а также в гашении мерцания слеклов. Лазерный метод позволяет проводить экспресс-диагностику чувствительности растительных организмов к тепловой (или холодо-вой) нагрузке и выявлять температуры и длительность их экспозиций, приводящие к необратимым повреждениям структуры и функций тканей.

Определение устойчивости фотосинтезирующих тканей к фотоингибированию и фотодеструкции по характеристическим параметрам комбинированного сигнала светорассеяния было проведено при следующих модификациях устойчивости растений к избыточному свету: генетическая специфичность (светолюбивые и тене-устойчивые виды), световые условия формирования ФСА листа (100 % и 25 % освещенность относительно экологической нормы) и ингибирование фотосистемы-2 температурой +55°С. Между вариантами опыта получены достоверные различия оценок по таким показателям, как К( и Тст которые хорошо согласуются со временем начала выцветания хлорофилла Т,^,. (табл. 8).

Таблица 8

Показатели устойчивости к фотоповреждению

Объект Kf, от.ед. а (пр t=30c) Г,„. с ТфА. с

Папоротник (тенелюбивый вид) 0,67±0.09 -0.18+0,04 75±12,5 155±22,8

Актинидия (тенеустойчивый вид) 0,45+0,07 -0,15±0,02 56±8,2 190+30,0

Груша (светолюбивых вид) 0,87±0,04 -0,34+0,06 480±37,5 610±26,5

Береза (свстоустойчивый вид) 0,86+0,04 -0,48±0,03 620±29,0 2100±75,4

Смородина черная, свстовыс листья 0,80=0,04 -0,22±0,02 280±18,4 630=19,3

Смородина черная, теневые листья 0,55±0,06 -0,17±0,03 190±22,3 440±24,6

Смородина, ингибирование ФС-2 0,31 ±0,09 -0,016±0,008 23±6,4 52±16,4

Разработан неразрушающий оптический метод оперативной, сравнительной оценки чистой продуктивности фотосинтеза (ЧПФ) растений и изменчивости этого показателя под влиянием климатических и агротехнических условий выращивания, поражения вредителями и болезнями. Метод базируется на величине расчетного показателя функционального состояния (ПФС) листьев, который определяется как отношение коэффициента фотоконверсии к коэффициенту пропускания листа: ПФС=Кп/Кпр. Экспериментально доказано, что коэффициент корреляции ЧИФ и ПФС не менее 0,89 и что показатель ПФС может быть использован для оптимизации типа формировки кустов смородины черной (табл. 9).

Таблица 9

Сравнительная оценка сортов и типов формировок смородины

Название сорти Тип формировки ЧПФ, г/м'сутки Кц, отн. ед. А'„,„ % ПФСхЮО

Маленький принц куст . 7,29±0,12 0,367±0,020 3,14+0,60 6,66±0,85

шпалера 8,89±0,19 0,439±0,026 2,79±0,46 9,58±0,98

Тамерлан КУСТ 9,79±0,08 0,336±0,030 3,41=0,55 6,42=1,01

шпалера 10,51 ±0,13 0,493±0,023 3,37±0,60 9,59=0,77

Титания куст 10,60±0,25 0,495±0,022 3,39=0,43 11,16±0,80

шпалера 14,88±0,49 0,612±0,030 2,47±0,38 17,56±1,71

Параметры, описывающие мерцание спеклов, наиболее чувствительны при анализе метаболической активности тканей, не содержащих хлорофилл (корни, семена, луковицы и лепестки цветов, некоторые виды плодов и овощей, непигментирован-ные участки тканей пестролистных видов растений) при их высыхании или после действия критических температур (как высоких так и низких). Например, по мере высушивания цветка орхидеи, исчезают высокочастотные флуктуации интенсивности спеклов и появляется низкочастотный тренд (рис. 24), что приводит к более чем 2-х кратному снижению коэффициента вариации.

Время, с ВРе"*- с

Рис. 24. Типичные графики изменения интенсивности спеклов у лепестка орхидеи. А - на 1 день срезки цветка {Кт,= 12,6 + 1,8). Б - на 8 день после срезки (К„аг= 5,3 ± 2,2).

Оценена также возможность использования разработанных методов и оборудования для исследования функционального состояния растений или водорослей in vitro. В связи с необходимостью проведения дистанционных измерений через стекло или пластик и невозможностью точной фиксации объектов в наибольшей степени подходят критерии, основанные на кинетических параметрах изменения комбинированного сигнала или его флуоресцентной составляющей. Например, с помощью разработанных методов зарегистрировано достоверное изменение функционального состояния суспензии хлореллы при снижении рН среды культивирования под действием анодной фракции электролиза минерализованного питательного раствора. Действие ингибитора модифицировало характер фотоконверсии флуоресцентной компоненты комбинированного сигнала светорассеяния (рис. 25), которое не зависит от концентрации клеток.

Рис. 25. Изменение флуоресцентной компоненты комбинированного сигнала светорассеяния суспензии хлореллы при разных значениях рН. Значения рН на графике сверху вниз: 6,39 (контроль); 2,56; 2,31; 2,21; 2,16; 2,13.

20

Седьмая глава посвящена практической реализации разработанных методов и технических средств. На основании теоретических расчетов и данных экспериментальной оптимизации, подготовлено техническое задание на создание оборудования комплексной диагностики структурно-функционального состояния растительных организмов. Принцип конструирования был основан на использовании единого оптического тракта «открытого» типа, позволяющей осуществлять количественную оценку всех обоснованных амплитудно-фазовых показателей светорассеяния растительной ткани и использовании многофункционального программного обеспечения, реализующего различные алгоритмы съема и обработки данных. Это позволяет проводить модификацию и наладку приборов под конкретные задачи, а также осуществлять ремонт и замену узлов. Базовые элементы конструкции включают в себя: оптический узел со встроенным полупроводниковым лазером, поляризационным интерферометром и элементами регулировки диаметра и плоскости поляризации пучка; узел питания и управления током накачки излучателя; узел фотоприемника с интерфейсом связи с компьютером; узел дистанционного управления процессом измерений; узел управления циклической засветкой; универсальную компьютерную программу сбора и обработки данных.

Разработана и изготовлена экспериментальная серия приборов оптической диагностики растений и плодов полевого и исследовательского назначения, в том числе встраиваемые в стандартные микроскопы (табл. 10, рис. 26).

Таблица 10

Лазерные приборы комплексной диагностики растений и плодов

11араметры Модель прибора

LPT-2K(2C) LPT-3KC 1.РТ-4КМ-Ст I.PT-5 КС

Условия применения лабораторные и полевые лабораторные и полевые встраиваемые в микроскоп лабораторные и полевые

Режим измерений пропускание пропускание и отражение пропускание пропускание и отражение

Измеряемые показатели I; К, ; а ' г I; К,; а; /?,; Ктг(спеклов) С; I; С/1; К, ; а 1 G; I; С/1; Кр; а(; Rc\ Кт„(спеклов)

Размер объекта, мм, >10 >5 >\ >5

Толщина объекта, мм <5 не ограничена <5 не ограничена

Тип питания. по шине IJSB по шине USB по шине USB по шине USB

Потребляемая мощность, Вт, не более 0,35 0,40 0,40 0,50

Сменные модули нет есть нет есть

Размеры прибора, мм 42x46x138 58x68x120 150x250x400 74x94x155

Рабочая температу ра, ° С -5...+50 +5...+40 + 15...+30 +5...+40

Вес (без ПК), г 180 450 240 540

Системные требования к компьютеру Частота процессора 1 ГГц, 512 Mb ОЗУ, 50 МЬ свободного места на диске, USB 2.0, Windows XP\Vista\7

LPT-3K LPT-3KC LPT-3C

Рис. 26. Приборы многопараметрической диагностики растений и плодов.

Приборы позволяют работать с листьями, различными плодами, побегами, растениями в культуре in vitro без нарушения их целостности и стерильности. Расчетная интенсивность отказа оборудования составляет менее 1,5-10' (1/ч), «то обеспе-

чивает достаточную вероятность надежной работы приборов в течение 5 летнего срока эксплуатации. Среднегодовой экономический эффект внедрения одного прибора составляет не менее 160 тыс. руб. Срок окупаемости только за счет сокращения эксплуатационных затрат - I год.

Результаты исследований используются в научной и учебно-образовательной работе ГНУ ВНИИГиСПР им. И.В.Мичурина, ГНУ ВНИИС им. И.В.Мичурина (г. Мичуринск), ГНУ ВСТИСП (г. Москва), ГНУ ВНИИЦиСК (г. Сочи), в Институте садоводства и овощеводства Рейнского университета (г. Бонн, Германия), ФГБОУ ВПО «Пермская сельскохозяйственная академия имени академика Д.Н. Прянишникова», РУП «Институт плодоводства Республики Беларусь», ФГБОУ ВПО «Мичуринский Педагогический институт» и ФГБОУ ВПО «Мичуринский государственный аграрный университет». Приборы и методы прошли испытания их практического применения в хозяйствах Тамбовской, Белгородской области и Татарстана. Результаты исследований используются при подготовке научных кадров; применяются в экологическом практикуме учащихся средних школ; оказались востребованы при выполнении государственного контракта №ГК-7039 «Разработка методологии недеструктивного мониторинга и контроля физиологического состояния плодов с целью создания инновационных и экологических подходов к максимизации сроков хранения и сохранения качества биологической продукции» ФГБОУ ВПО МичГАУ; перспективны для оценки функционального состояния и оптимизации агротехнологических приемов выращивания растений яблони, смородины, земляники, лимона, чая, цветочных культур, хлореллы, растений in vito и др. Отдельные технические решения и методики используются при разработке и эксплуатации оптико-электронного оборудования в ЗАО НИЦ «САМТЭС» и ООО «ЭЛМАС» (г. Москва). Результаты исследований и документация переданы для освоения мелкосерийного производства приборов серии LPT в ООО «НТОП «Сатурн-!» и ООО «Современные системы управления» (г. Москва).

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. По результатам анализа научной и патентной литературы, а также собственных исследований разработана концепция неразрушающей многопараметрической диагностики растений и плодов, основанная на количественной оценке структурно-функционального состояния растительных организмов по амплитудно-фазовым параметрам светорассеяния когерентного оптического излучения и динамики их све-тоиндуцированного изменения.

2. Теоретически и экспериментально обоснован способ количественной оценки структурных перестроек растительных тканей по степени пространственной когерентности и радиусу корреляции рассеянного лазерного пучка. На базе физико-математической модели стационарного случайного фазового экрана определены необходимые условия наблюдения интерференционной и спекл-картин в режиме пропускания и отражения когерентного излучения от листьев и в режиме отражения от целых плодов. Разработана методика калибровки видеосигнала цифровых 8-ми битовых видеокамер, позволяющая увеличить линейность и динамический диапазон внутрикадро-вой оцифровки и тем самым снизить ошибку при оценке контраста интерференционной картины при различных уровнях входного сигнала. При расчете контраста интерференционных полос эффективная фильтрация высокочастотного шума осуществляется методом «скользящего среднего» с шириной окна от 0,03 до 0,12 от периода интерференционной картины.

3. Показано, что при оптических измерениях живых фотосинтезирующих организмов на длинах волн, соответствующих максимальному поглощению хлорофилла, рассеянное излучение представляет собой комбинированный сигнал, состоящий из двух компонент: люминесцентного и рэлеевского, имеющих соизмеримые интенсивности и существенно разную статистическую упорядоченность. Установлено, что зависимость интенсивности комбинированного сигнала от длительности засветки представляет собой многофазную кривую, отражающую процессы медленной индукции флуоресценции (МИФХ) и фотодеструкции хлорофилла (ФДХ). Выявлены основные закономерности светоиндуцированного изменения комбинированного сигнала и его компонент от спектрального состава, плотности мощности зондирующего излучения, продолжительности воздействия и функциональной активности фо-тосинтезирующего аппарата. Для комплексной экспресс-диагностики хлорофиллсо-держащих тканей по их фотосинтетической активности и устойчивости к фотоокислению обосновано, использование кинетики фотоконверсии комбинированного сигнала светорассеяния в течение 15...60 секунд непрерывной засветки монохроматическим излучением красной или синей областей спектра.

4. Предложен способ количественной недеструктивной оценки метаболической активности растительных клеток и субклеточных структур по вариабельности амплитудно-фазовых параметров рассеянного лазерного пучка. Определены оптимальные условия измерений в пределах детерминированной интерференционной картины, задаваемой поляризационным интерферометром и алгоритмы обработки сигнала, обеспечивающие режим экспресс-диагностики, для чего достаточно осуществить несколько десятков отсчетов интенсивности спекл-картины в течение 3-8 секунд с зоной интегрирования 1,5...2 среднего диаметра спеклов внутри интерференционного максимума. Обоснован количественный критерий метаболической активности растительных тканей по коэффициенту вариации интенсивности мерцания спеклов.

5. Теоретически и экспериментально обоснованы параметры оптико-" электронного оборудования комплексной диагностики растений и плодов: длина волны зондирующего излучения - 450...470 нм и 630...660 нм, ширина спектра А А <2,0 нм, нижний порог выходной мощности излучателя 0,5 мВт, верхний - 30 мВт; угловой размер лазерного пучка от 0,02 до 0,06 радиан; разность хода поляризационного интерферометра 50...85 мкм, угол рассогласования между анализатором и поляризатором - менее ± 5"; фотоэлектронный преобразователь - матричный, со спектральной чувствительностью, присущей кремниевым датчикам; рабочее поле матрицы должно вмещать от 1,5 до 2,5 периодов интерференционной картины; оптимальная плотность мощности для оценки фотосинтетической активности в синей области спектра 800 Вт/м2; в красной области спектра: 600 Вт/м2 - для оценки фотосинтетической активности и метаболической подвижности и 3000 Вт/м" - для оценки устойчивости к фотодеструкции. При расчете динамических параметров комбинированного сигнала светорассеяния следует использовать степенную аппроксимация вида V = /(Л для экспресс-оценки восстановления фотосинтетического аппарата после фотоинги-бирования - циклическую засветку одной и той же точки листа красным светом с плотностью мощности 800 Вт/м" по схеме: 15 секунд засветки первого измерения, 30...60 секунд темповая пауза и 15 секунд засветки второго измерения.

6. Теоретически и экспериментально обоснованы следующие базовые количественные показатели структурно-функционального состояния растительной ткани, рас-

считанные по результатам измерения амплитудно-фазовых параметров светорассеяния и динамики фотоконверсии:

й, % - степень пространственной когерентности светорассеяния. Определяется по контрасту полос детерминированной интерференционной картины поляризационного интерферометра. Типовая величина степени когерентности отраженного от растительных организмов лазерного пучка лежит в диапазоне от 4 % до 60 % с нормой в области от 30 % до 60 % для здоровых листьев и плодов большинства исследованных видов сельскохозяйственных растений. Величина С зависит от числа, размеров и пространственного распределения фазовых неоднородностей (зерна крахмала, межклеточные стенки, воздушные межклеточные и внутриклеточные полости), а также доли люминесцентного компонента в комбинированном сигнате. Данный показатель наиболее чувствителен к микроструктурным перестройкам, вызванных вирусной и грибной инфекцией, механическими повреждениями ткани и их заживлением, процессами созревания плодов, роста, старения растений и т.п. Существует сортовая и видовая специфика величины С светорассеяния листьев и плодов.

/, усл. ед. - средняя интенсивность светорассеяния. Определяется как усредненная интенсивность всей интерференционной картины в первые секунды засветки. Этот показатель коррелирует с оптической плотностью исследуемого растительного объекта, у фотосинтезирующих органов - с концентрацией фотосинтезирующих пигментов. При его использовании для оценки абсолютного содержания хлорофиллов или других пигментов необходима калибровка прибора под конкретный вид растительного организма; для относительных оценок - достаточно фиксации определенного режима работы.

А'/, отн. ед. - коэффициент фотоконверсии комбинированного сигнала светорассеяния. Определяется как относительная амплитуда изменения средней интенсивности светорассеяния в течение определённого времени засветки. При зондирующем излучении синей области спектра (450 нм...470 нм) - идентичен удельной фотосинтетической активности фотосинтезируюшего аппарата, рассчитываемой по кривой медленной индукции флуоресценции хлорофилла. При зондирующем излучении красной области спектра (630 нм.,.660 нм) - коррелирует как с активностью фотосинтеза, так и устойчивостью к фотодеструкции. Для ряда плодовых и ягодных культур определены диапазоны величин показателя, определяющие уровень функциональной активности фото-синтезирующего аппарата при использовании излучения синей (красной) области спектра соответственно: высокая - более 0,65 отн. ед. (0,48 отн. ед.); средняя -0,4...0,65 отн. ед. (0,25...0,48 отн. ед.); низкая - менее 0,4 отн. ед. (0,25 отн. ед.).

а, усл. ед. - динамический показатель или скорость фотоконверсии комбинированного сигнала светорассеяния. Определяется как показатель степенной функции У = На кривой, описывающей светоиндуцированное изменение средней интенсивности светорассеяния в течение определённого времени засветки. При зондирующем излучении синей области спектра (450 нм...470 нм) идентичен скорости тушения флуоресценции, рассчитываемой по кривой медленной индукции флуоресценции хлорофилла. При зондирующем излучении красной области спектра (630 нм...660 нм) -коррелирует как со скоростью тушения флуоресценции, так и с динамикой фотодеструкции хлорофилла. Отражает адаптивные возможности хлоропластов к изменению световых условий. В значительной степени зависит от редокс-потенциала, устойчивости хлорофилл-белкового комплекса и компетентности антиоксидантных механизмов. Реагирует на самые ранние отклонения в работе фотосинтетического аппарата и имеет существенно большую чувствительность, чем К/, Для большинства фотосинтези-

рующих растительных организмов с высокой активностью фотосинтезирующего аппарата величина а, лежит в диапазоне от минус 0,8 до минус 2,4 усл. ед. Смена знака показателя на положительный свидетельствует о необратимых фотоокислительных процессах. Оба показателя: Кг и а, - перспективны для оценки функционального состояния фотосинтезирующих органов растений под влиянием климатических факторов, средств зашиты растений, микро и макроэлементного питания, токсичных веществ, ультрафиолетового излучения и т.п.

Кт/1;), %. - коэффициент вариации интенсивности спеклов. Вычисляется при статистической обработке временного ряда данных регистрации интенсивности определенной зоны недетерминированной спекл-картины внутри максимума детерминированной интерференционной картины. Связан с такими показателями метаболической активности, как движение цитоплазмы, транспортные процессы, раскрытие-закрытие устьиц и т.п. Предназначен для количественной оценки функционального состояния нефотосин-тезирующих тканей и органов (корни, одревесневшие побеги, семена, луковицы цветов и т.п.), в то же время может использоваться и для анализа фотосинтезирующих растительных тканей, но с учетом влияния индукции флуоресценции. Наибольшая чувствительность отклика показателя зарегистрирована при высыхании растительной ткани, повреждении низкими или высокими температурами.

7. Экспериментальными испытаниями установлена высокая эффективность использования методов и приборов комплексной лазерной диагностики для решения широкого круга исследовательских и прикладных задач: оценка устойчивости к различным неблагоприятным факторам (дефицит питания, хлороз, избыточная освещенность, высокие и низкие температу ры, вирусная инфекция, грибные болезни, окислительный стресс, токсичные вещества); определение эффективности средств защиты растений; оптимизация микро- и макроэлементного питания; контроль качества и зрелости плодов; оценка генетической специфичности и связанных с ней хозяйственно-ценных признаков; исследования процессов развития, старения и регенерации растительных тканей. По результатам исследований разработаны новые методы и средства структурно-функциональной диагностики растительных организмов, которые по сравнению с известным оптическим оборудованием аналогичного класса (хлорофилл-флуорометры, портативные спектрометры, системы технического зрения) позволяют получить дополнительную информацию о структурных перестройках и метаболической активности клеток, увеличить чувствительность измерений и достоверность различий на ранних стадиях развития патологии, дают возможность работать с различными органами и тканями растений, в том числе и не содержащих фотосинтезирующие пигменты. При этом все измерения проходят в рамках единой оптической схемы, за один измерительный цикл в режиме реального времени.

8. Ра;зработаны и внедрены в научно-исследовательские институты, учебно-образовательные организации, агропромышленные и научно-технические предприятия методы и компьютеризированные оптико-электронные приборы комплексной диагностики растительных организмов, даны рекомендации производству. Для освоения мелкосерийного производства подготовлено несколько моделей прибора, предназначенных для учебно-демонстрационных целей, работы в полевых условиях, в хранилищах и ла-бораторно-исследовательского назначения, в том числе встраиваемые в оптический тракт микроскопов. Технико-экономическими расчетами показаны высокая надежность и эффективность использования нового оборудования, срок окупаемости которого только за счет сокращения эксплуатационных затрат не превышает одного года.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях

1. Будаговская, О.Н. Оптическая дефектоскопия плодов. - Тамбов: Пролетарский светоч, 2009. - 277 с.

2. Будаговская, О.Н. Лазерная диагностика растений / О.Н. Будаговская, A.B. Буда-говский, И. А.Будаговский - Мичуринск: Издательский Дом «Мичуринск», 2010. — 60 с.

3. Будаговский, A.B. Лазерная техника и технологии в растениеводстве. Научно-информационное издание / A.B. Будаговский, О.Н. Будаговская. - Тамбов, 2011. -38 с.

В изданиях, предусмотренных перечнем ВАК

4. Патент РФ № 2016671 МКИ5 В07С5/342. Способ определения качества плодов и устройство для его осуществления / Будаговская О.Н., Будаговский A.B. - Заявка № 490704313 от 31.01.91. -Зарег. в Госреестре изобретений РФ 30.07.94 - 7 с.

5. Патент РФ № 2113707 МКИ5 G01N21/27, В07 5/342. Прибор для измерения механический повреждений на плодах / Будаговская О.Н., Гончаров С.А, Горшенин В.И., Ларшин Ю.П. - Заявка № 97102921/13 от 25.02.97,-Опубл. 20.06.98, Бюл. № 17.

6. Патент РФ № 2222177 МПК7 A01G 1/00, А 01Н 1/04. Способ оценки скороспелости растений фейхоа/Будаговская О.Н., Будаговский A.B., Огиенко Н.Г. - Заявка № 2001129543/12 от 01.11.2000. - Опубл. 27.01. 2004, Бюл. № 3.

7. Патент РФ № 2225691 МПК7 A01G1/00, А01Н1/04. Способ диагностики потребности растений в микроэлементном питании / Будаговская О.Н., Будаговский A.B., Притула З.В., Белоус О.Г., Абильфазова Ю.С. - Заявка № 2002108804/12 от 05.04.2002. - Опубл. 20.03.2004, Бюл.№ 8.

8. Патент РФ №2342825 МПК7 АО 1G 7/00. Неразрушающий способ функциональной диагностики растений / Будаговский A.B., Будаговская О.Н., Будаговский И.А. - Заявка № 2007104756/12 от 07.02.2007. - Опубл. 10.01.2009, Бюл. № I.

9. Патент РФ №2352104 МПК7 A01G7/00. Способ оценки фотосинтетической активности растительных организмов / Будаговская О.Н., Будаговский A.B., Будаговский И. А. - Заявка № 2007121425/12 от 07.06.2007. - Опубл. 20.04.2009, Бюл. № 11.

10. Патент РФ № 2360402 МПК7 A01G7/00. Способ оценки реакции растений на токсические вещества / Будаговский A.B., Будаговская О.Н., Соловых Н.В., Шорников Д.Г. - Заявка № 2007139421/12 от 23.10.2007. - Опубл. 10.07.2009, Бюл. № 19.

11. Патент РФ № 2364077 Оптический способ оценки устойчивости растений к фо-тоингибированию и фотодеструкции / Будаговская О.Н., Будаговский A.B., Будаговский И.А. - Заявка № 2007135704/12 от 26.09.2007. - Опубл. 20.08.2009, Бюл. № 23.

12. Патент РФ № 2384045 МПК7 A01G7/00. Способ оценки реакции растений яблони на латентную вирусную инфекцию / Будаговская О.Н., Семина Н.П., Гончаров С.А. - Заявка № 2008115264/12 от 17 апреля 2008 г. - Опубл. 20.03.2010. Бюл.8.

13. Патент РФ №2448454 Оптический способ оценки чистой продуктивности фотосинтеза листьев смородины черной /Будаговская О.Н., Будаговский A.B., Жидехина Т.В., Родюкова О.С.. - Заявка № 20100126711 от 29.06.2010. - Опубл. 10.01.2012. - Бюл. № 1.

14. Патент РФ №2453106 Неразрушающий оптический способ оценки зрелости плодов/ Будаговская О.Н., Будаговский A.B., Ильинский A.C., и др. - Заявка № 2010129128/12 (041328).- Зарегистрир. 13.07.2010 - Опубл. 20.06.2012. - Бюл. № 17.

15. Будаговская, О.Н. Использование фазовых характеристик света для оценки качественного состояния покровных тканей плодов / О.Н. Будаговская //Достижения науки и техники АПК. - 1994. - № 3. - С.40-41.

16. Бородин, И.Ф. Лазерная диагностика состояния поверхности плодоовощной продукции / И.Ф. Бородин, О.Н. Будаговская //Доклады РАСХН. - 1995. - № 2 . - С. 44-47.

17. Будаговская, О.Н. Анализ качества поверхности плодов методами фазовой оптики / О.Н.Будаговская // Техника в сельском хозяйстве. - 1997. - №2. - С. 12-16.

18. Будаговская, О.Н. Неразрушающий метод структурно-функциональной диагностики растительных тканей / О.Н.Будаговская //Достижения науки и техники АПК. -2000, №7.-С. 8-9.

19. Будаговская, О.Н. Лазерная диагностика вирусных заболеваний яблони / О.Н. Будаговская, Н.П. Семина// Плодоводство и ягодоводство России: сборник научных трудов /ГНУ ВСТИСП. - М„ 2004. - Т. XI. - С. 354-360.

20. Будаговская, О.Н. Устройство синхронного ввода видео- и внешнего аналогового сигнала в э.в.м. / О.Н. Будаговская, И.А. Будаговский // Приборы и техника эксперимента. -2004. - № 5. - С. 69-71.

21. Будаговская, О.Н. Лазерная диагностика растений / О.Н. Будаговская // Механизация и электрификация сельскохозяйственного производства. - 2004. - № 9. - С. 24-26.

22. Будаговская, О.Н. Автоматизированная система контроля структурных перестроек растительных тканей / О.Н. Будаговская., А.В.Будаговский, И.А.Будаговский // Приборы и техника эксперимента. - 2007. - №1. -С.161-162.

23. Будаговский, A.B. Оценка действия экстремальных температур методом лазерного анализа микроструктуры растительных тканей /А.В.Будаговский, О.Н. Будаговская, Ф. Ленц //Вестник РАСХН. - 2008. - №1 - С. 69-72

24. Бородин, И.Ф. Применение эффекта фотоиндуцированной изменчивости оптических свойств хлорофиллсодержащих тканей для диагностики функционального состояния растений / И.Ф. Бородин, A.B. Будаговский, О.Н. Будаговская, И.А. Будаговский, Ю.А. Судник // Доклады РАСХН. - 2008. - № 5. - С. 62-65.

25. Будаговский, A.B. Новый подход к проблеме функциональной диагностики растений /A.B. Будаговский, О.Н. Будаговская, Ф. Ленц //Аграрная наука. - 2009. -№9.-С. 19-21.

26. Соловых, Н.В. Биотехнологические и биофизические методы оценки солеустой-чивости земляники /Н.В. Соловых, А.В.Будаговский, О.Н.Будаговская // Вестник РАСХН. - 2009. - № 1. - С. 53-55.

27. Будаговская, О.Н. Оптико-электронный прибор для количественной оценки микроструктуры растительной ткани / О.Н. Будаговская., A.B. Будаговский // Вестник МичГАУ. - Мичуринск-наукоград, 2009. - № 1. - С. 82-85.

28. Будаговская, О.Н. Лазерная диагностика латентной вирусной инфекции яблони / О.Н.Будаговская., Н.П. Семина// Аграрная наука.- 2010. -№ 10. - С. 23-24.

29. Будаговская, О.Н. Исследование процесса искусственной ускоренной фотодеструкции фотосинтезируюшего аппарата растений / О.Н. Будаговская, И.Ф. Бородин // Доклады РАСХН. - 2011. - № 1. - С. 20-24.

30. Будаговская, О.Н. Портативный лазерный прибор для оценки устойчивости растений к фотоингибированию и фотодеструкции /О.Н. Будаговская, A.B. Будаговский, И.А. Будаговский, С.А. Гончаров // Приборы и техника эксперимента. - 2011.-№ 1.-С. 163-164.

31. Будаговская, О.Н. Новые оптические методы и приборы количественной оценки адаптивного потенциала садовых растений /О.Н. Будаговская //Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. тр. /ГНУ ВСТИСП. - М„ 2011. - Том 27, Часть 1. - С. 74-79.

32. Будаговский, A.B. Экспресс-диагностика действия токсичных соединений на фотосинтетическую активность садовых культур/ A.B. Будаговский, Н.В. Соловых, О.Н. Будаговская, Ф. Ленц, Д.М. Шорников, М.Ю. Пимкин, М.Л. Дубровский //

Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. тр. ВСТИСП - М., 2011. - Том 27, Часть 1.-С. 80-87.

33. Будаговская, О.Н. Оптические методы диагностики зрелости и качества плодоовощной продукции /О.Н. Будаговская // Вестник МичГАУ. - Мичуринск-наукоград, 2011. - Ч. 2, Т. 2. - С. 84-93.

34. Будаговская, О.Н. Новый подход в решении проблемы недеструктивной оценки твердости плодов /О.Н. Будаговская, А.В. Будаговский, ИЛ. Будаговский, С.А. Гончаров А.С. Ильинский, Р.Д. Исаев, А.В. Кружков, Д.Г. Шоринков// Вестник МичГАУ. - Мичуринск-наукоград, 2011. - Часть 2, Том 2. - С. 62-66.

35. Матушкина, О.В. Проблема витрификации побегов при микроразмножении плодовых растений / О.В. Матушкина, И.Н. Пронина, О.Н. Будаговская // Аграрная наука.-2011,-№7,-С. 23-25.

36. Будаговская, О.Н. Нераэрушающая диагностика функционального состояния плодов в послеуборочный период/ О.Н. Буддговская, А.В. Будаговский, И.А. Будаговский // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. тр. /ГНУ ВСТИСП. -Москва, 2012. -Т.ЗЗ. -С.43-52.

37. Жидехина, Т.В. Оптический метод сравнительной оценки чистой продуктивности фотосинтеза листьев у смородины/ Т.В. Жидехина, О.Н. Будаговская // Плодоводство и ягодоводство России: сб. науч. тр. /ГНУ ВСТИСП. - М'., 2012. - Т. 33. - С. 161-168.

38. Будаговский, А.В. Влияние концентрации кислорода на состояние фотосин-тезирующего аппарата яблок в период хранения/ А.В. Будаговский, О.Н. Будаговская, И.А. Будаговский, А.С. Ильинский, С.Б. Карпов, В.Ю. Пугачев // Вестник МичГау -Мичуринск-наукоград, 2012.-№ 1.-Ч. 1.-С. 193-197.

39. Будаговский, А.В. Реакция растительных организмов на лазерное облучение различного спектрального состава /А.В. Будаговский, Н.В.Соловых, О.Н. Будаговская, И.А. Будаговский, A. Michenko, М. Hermander // Доклады РАСХН. - 2012. - № 5. - С. 21 -24.

Публикации в международных изданиях:

40. Budagovskii, A. Low-intensity laser radiation is means for quality retention and assessment of agricultural produce / A. Budagovskii, O. Budagovskaja, G. Gudi, A. ilinski //Agri-food quality - 95. Interdisciplinary opportunities and objectives for the year 2000 and beyond: International conference abstracts. - Norwich, UK, 1995. - P. 245.

41. Budagovski, A. Application of Coherent Laser Radiation for Detection of Plant Surface State and its Genotipe / A. Boudagovski, O. Boudagovskaja, A. Ilinski, N. Savelev // Abstractbook of 12th International Congress on Photobiology. Vienna, September 1-6, 1996. - Vienna, Austria, 1996,- P.250.

42. Boudagovskaja, O. Fruit and vegetables quality detection method based on the model of scattering of coherent radiation in biological tissues / O. Boudagovskaja, A. Boudagovski, A. Ilinski //Food quality modeling. - Leuven, Belgium, 1997. - P. 33.

43. Boudagovskaja, O. Structure-functional relations of biological systems can be revealed by statistics of scattered coherent radiation / O. Boudagovskaja, A. Boudagovsky // Non-equilibrium and coherent systems in biology, biophysics and biotechnology: Abstractbook of 2nd International Alexander Gurvvitsch Conference. Moscow, September 610. 1999. - Moscow, 1999. - P. 6.

44. Budagovsky, A.V. Application of laser irradiation for the estimation of functional state and the resistance to biotic and abiotic stresses in horticultural plants /

A.V. Budagovsky, O.N. Budagovskaya, S.A. Goncharov, Yu.G. Belyachenko, F. Lenz,

B. Oertel // EUCAR.PIA Fruit Breeding Section Newsletter, 2001. -№ 5.- C.31-32.

45. Budagovsky, A. Analysis of the Functional State of Cultivated Plants by means of Interference of Scattered Light and Chlorophyll Fluorescence / A. Budagovsky, O. Budagovskaya, F. Lenz, A. Keutgen, K. Alkayed //Journal of Applied Botany. - 2002, V. 76. - P. 115 -120.

46. Budagovsky, A. Biological structure as a converter of coherent radiation / A. Budagovsky, O. Budagovskaya, I. Budagovsky //Biophotonics and Coherent Systems in Biology: Proceedings of the 3th Gurwisch Conference. - N.Y.: Springer, 2006. - P. 47-64.

47. Budagovskay, O.N. Laser Diagnostics Top Fruit Plants /O.N. Budagovskay, A.V. Budagovsky // Mezinarodni (Conference o perspektivach pestovani ovocnych Druhu v Evrope: international Conference in European Fruit Growing: Proceedings. - Lednice/ Czech Republic October 18-20.2006. - Lednice, 2006. - P.280.

48. Budagovsky, A.V. The effect of photoinduced changes in plant tissues optic properties / A.V. Budagovsky, O. N.Budagovskaya, I.A. Budagovsky// International conference on laser application in life sciences: LALS 2007,- 11-14 June 2007. - Moscow, 2007. - P. 30, Tul 02P2.

49. Michenko, A. Lazer diagnostics of fruits in storage / A. Michenko, M. Hermander, O.N. Budagovskaya // Computing science and automatic control: 9th International conference, Mexico, September 26-28, 2012. - IEEE catalog number: CFP12827-CDR. -P. 198-200.

50. Michenko, A. Non destructive assessment of the maturity of fruits / A. Michenko, O.N. Budagovskaya // Articilo aceptado por referero XIII congreso nacional de ingeniería electromecánica y de sistemas (XIII CNIES). - Mexico, 2012. - P. 1-3.

Подписано к печати 30.04.2013. Формат 60*84/16. Усл.-печ. л. 2,2. Тираж 100 экз. Заказ № 904.

Отпечатано в издательском центре ФГБОУ ВПО МГЛУ: 127550, Москва, Тимирязевская, 58

На правах рукописи

05201351351

БУДАГОВСКАЯ Ольга Николаевна

ЛАЗЕРНО-ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И ТЕХНИЧЕСКИЕ СРЕДСТВА МНОГОПАРАМЕТРИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ РАСТЕНИЙ И ПЛОДОВ

05.20.02 - электротехнологии и электрооборудование в сельском хозяйстве

диссертация на соискание учёной степени доктора технических наук

Научный консультант:

доктор технических наук, профессор А.М. Башилов

МОСКВА 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ............................ 5

ВВЕДЕНИЕ............................................................................ 10

ГЛАВА 1. СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ ДИАГНОСТИКИ РАСТЕНИЙ И ПЛОДОВ............................................................................. 27

1.1. Актуальность проблемы; современные требования к методам и средствам диагностики функционального состояния растений и плодов........................................................................................ 27

1.2. Современные методы и средства функциональной диагностики растений................................................................................. 30

1.3. Формализация проблемы. Цель и задачи исследования............... 90

1.4. Выводы главы 1................................................................. 95

ГЛАВА 2. МЕТОДОЛОГИЯ И ТЕХНИЧЕСКАЯ БАЗА ИССЛЕДОВАНИЙ....................................................................................... 96

с

2.1. Программа и структура исследований.................................... 96

2.2. Методы и материалы исследований........................................ 97

2.3. Техническая база исследований............................................. 102

2.4. Методика калибровки 8-ми битовых цифровых видеокамер......... 121

2.5. Выводы главы 2................................................................... 133

ГЛАВА 3. ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ЛАЗЕРНЫХ МЕТОДОВ МНОГОПАРАМЕТРИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ РАСТЕНИЙ И ПЛОДОВ................................................................................. 134

3.1. Теоретическое обоснование лазерного метода неразрушающей количественной оценки структурных перестроек растительной ткани.... 134

3.2. Теоретическое обоснование лазерного метода оценки метаболической активности растительных тканей.......................................... 150

3.3. Теоретическое обоснование лазерного метода оценки функционального состояния фотосинтетического аппарата растений................ 155

3.4. Теоретическое обоснование параметров оптического стенда для проведения комплексных исследований светорассеяния лазерного излучения растительными тканями................................................... 169

3.5. Выводы главы 3............................................................... 185

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ОБЩИХ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ИЗМЕНЕНИЯ ИНТЕНСИВНОСТИ СВЕТОРАССЕЯНИЯ ХЛОРОФИЛЛ-СОДЕРЖАЩИХ ТКАНЕЙ........................................................................ 187

4.1. Общие закономерности изменения интенсивности светорассеяния хлорофилл-содержащих тканей растений в процессе длительной засветки интенсивным монохроматическим излучением........................... 188

4.2. Оптимизация спектрального состава зондирующего потока......... 194

4.3. Оптимизация режимов измерения медленной индукции флуорес- 197

ценции хлорофилла, возбуждаемой синим светом..............................

4.4. Оптимизация схемы измерений: отражение или пропускание...... 202

4.5. Влияние содержания хлорофилла и состояния ФСА на характер кинетики светорассеяния............................................................... 204

4.6. Оптимизация диапазона регулирования интенсивности зондирующего потока красной области спектра.................................:.......... 208

4.7. Оптимизация длительности измерений при анализе устойчивости ФСА к фотодеструкции по параметрам комплексного сигнала............. 216

4.8. Оптимизация алгоритма обработки сигнала............................. 218

4.9. Оптимизация параметров устройства для исследования скорости и степени восстановления после искусственного фотоингибирования...... 223

4.10. Заключение и выводы главы 4............................................. 228

ГЛАВА 5. ОПТИМИЗАЦИЯ ПАРАМЕТРОВ ОБОРУДОВАНИЯ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ КОГЕРЕНТНОСТИ И ДИНАМИКИ СПЕКЛОВ......................................................................... 233

5.1. Влияние расстояния между поляризационным интерферометром и плоскостью изображения ИТК на период интерференционной картины.................................................................................. 233

5.2. Оптимизация углового размера источника............................... 234

5.3. Исследование зависимости аппаратного контраста ИТК от угла поворота поляризатора............................................................... 236

5.4. Влияние мощности зондирующего потока на параметры интерференционной и спекл-картины................................................... 239

5.5. Оптимизация режима сглаживания спекл-шума при оценке параметров интерференционной картины............................................. 240

5.6. Оптимизация режимов измерения мерцания биоспеклов при оценке метаболической активности непигментированных растительных тканей........................................................................................................ 245

5.7. Выводы главы 5............................................................... 257

ГЛАВА 6. ИССЛЕДОВАНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ РАСТЕНИЙ С ПОМОЩЬЮ РАЗРАБОТАННЫХ МЕТОДОВ.............. 261

6.1. Связь амплитудно-фазовых характеристик светорассеяния с мор-фофизиологическими параметрами растительной ткани................................................261

6.2. Оценка товарного качества плодов................................................................................262

6.3. Неразрушающая оценка зрелости и регенерационной способности плодов. Оптимизация режимов хранения плодов............................................................265

6.4. Оптические параметры верхней и нижней стороны листа............................272

6.5. Процессы старения листьев, хлороз................................................................................274

6.6. Исследование влияния вирусной инфекции..............................................................277

6.7. Динамика развития грибной инфекции........................................................................281

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

Сокращения

ACLSV - вирус хлоротической пятнистостью листьев яблони;

ArMV - вирус арабис мозаики;

ASGV - вирус бороздчатости древесины яблони;

ASPV - вирус ямчатости древесины яблони;

CCD-камера - видео-камера на основе прибора с зарядовой связью;

CMV - вирус огуречной мозаики;

DV - двулучепреломляющий элемент;

ZYMV - вирус желтой мозаики цукини;

АФК - активированные формы кислорода;

БИФХ - быстрая индукция флуоресценции хлорофилла;

БПФ - быстрое преобразование Фурье;

ВНИИЦиСК - Всероссийский научно-исследовательский институт цветоводства и субтропических культур; ГИ - голографическая интерферометрия; ЗФ - замедленная флуоресценция; ИК - инфракрасный;

ИОС - измерительная оптическая система;

ИТК - интерференционная картина;

ИФА - иммуноферментный анализ;

КОМБ - комбинированный сигнал;

КР - комбинационное рассеяние;

ЛДА - лазерная допплеровская анемометрия;

МГС - модифицированная газовая среда с ультранизким содержанием кислорода;

МИФХ - медленная индукция флуоресценции хлорофилла;

МКС - метод квазиупругого светорассеяния;

МЭ - микроэлемент;

ОГС - обыкновенная газовая среда;

ОС - окислительный стресс;

ПЗС -приборы с зарядовой связью;

ПИ - поляризационный интерферометр;

ППКФ - поперечная пространственная корреляционная функция; ПФС - показатель функционального состояния; РЦ - реакционный центр;

СПК - степень пространственной когерентности;

СТЗ - система технического зрения;

УФ - ультрафиолетовый;

ФА - функциональная активность;

ФАР - фотосинтетически активная радиация;

ФДХ - фотодеструкция хлорофилла;

ФС - функциональное состояние;

ФС-2 - фотосистема-2;

ФСА - фотосинтетический аппарат;

ФСР - функциональное состояние растений; ФХ - флуоресценция хлорофилла; ФЭУ - фотоэлектронный умножитель; Хл Ъ - хлорофилл «Ь»; Хл а - хлорофилл «а»;

ХПЛЯ - хлоротическая пятнистость листьев яблони; ЧПФ - чистая продуктивность фотосинтеза; ЯМР - ядерно-магнитный резонанс;

Спекл-картина - пятнистая структура рассеянного лазерного излучения.

Обозначения

сг,2 - дисперсия коэффициента а,;

расходимость зондирующего лазерного пучка; Я - длина волны; А (р - разность фаз;

АЧ/(^ - переменная разность фаз, вносимая подвижными рассеивателями; Ф(а) - случайное пространственно-угловое распределение фазы спекл-поля; А 4*0 - разность фаз, вносимая неподвижными фазовыми рассеивателями; (Ли - коэффициент рассеяния;

- коэффициент экстинкции; /4 - коэффициент поглощения; \к\ - волновое число;

\у(з)\ - функция пространственной когерентности от разности хода; ЛЯ - ширина спектра; а - размер частиц; А - числовая апертура;

А(х, у, г, ^ - комплексная амплитуда электромагнитной волны; Я; - ширина неоднородности (столбика) фазового экрана; В± - поперечная пространственная корреляционная функция; С - концентрация оптически активного вещества; И — диаметр;

с1 - разрешающая сила оптической системы ;

с1± - поперечный размер спекла;

с11| - продольный размер спекла;

с1а— диаметр входной апертуры оптической системы;

с1хр - средний диаметр спекла;

Е - электрическое поле электромагнитной волны;

^ - частота съема видеоданных;

- число степеней свободы;

Ёу - переменная (вариабельная) флуоресценция;

= У— потенциальный квантовый выход (квантовая эффективность) ФС-2; /0 - частота волны зондирующего пучка;

- интенсивность флуоресценции при полностью открытых реакционных центрах;

Fp, Fm - максимальная интенсивность флуоресценции при полностью закрытых реакционных центрах;

FJFT - коэффициент тушения флуоресценции;

FT - стационарный уровень флуоресценции;

G - когерентность;

G(kx, ку, z) — угловой спектр;

g(y/) - спектр распределения разности фаз;

G/I - приведенная когерентность;

Gk - когерентность с алгоритмом компенсации;

h - толщина объекта;

hDV - толщина двулучепреломляющего элемента; I(r,z) - интенсивность света; Г - интенсивность необыкновенного пучка; Ii(a,z) - угловое распределение интенсивности;

Imax> 1min, hP ~ максимальное, минимальное и среднее значение интенсивности ИТК;

10 - интенсивность падающего света;

Т - интенсивность обыкновенного луча;

10х - интенсивность монохроматического источника;

Is - угловое распределение интенсивности, формируемое спекл-модулированным полем;

К - коэффициент, учитывающий площадь фоточувствительной площадки и длительность экспозиции;

Kix - коэффициент, учитывающий потери при взаимодействии с объектом; К2х - коэффициент, учитывающий потери в оптическом тракте; К3х - коэффициент трансформации углового размера пучка в процессе светорассеяния и передачи через поляризационный интерферометр; Kf - коэффициент фотоконверсии интенсивности светорассеяния; к0 - волновой вектор;

китк - коэффициент передачи оптического тракта между интерферометром и матрицей;

Ктр ~ коэффициент отражения; кп - коэффициент поглощения;

Knom - уровень потерь на всех элементах оптического тракта; кпр - коэффициент пропускания;

ктр(^д) — коэффициент трансформации энергетических величин в квантовые; Кэс - эффективность светосбора рассеянного объектом излучения; Kvar(G) - вариабельность изменения когерентности; Kvar(I) - вариабельность изменения интенсивности; Кд - коэффициент действия фактора воздействия;

L - длина оптического пути; расстояние от плоскости падения луча на объект

до плоскости наблюдения;

10 - расстояние от излучателя до объекта;

// - расстояние от объекта до входной диафрагмы поляризационного интерферометра;

- 10-ВВЕДЕНИЕ

Рост населения Планеты, сопровождающейся снижением плодородных площадей, требует рационального использования ресурсов и энергии, затрачиваемых на производство и хранение сельскохозяйственной продукции. Этому способствует прецизионное земледелие, которое невозможно без адекватной комплексной оценки жизнедеятельности возделываемых культур. Несмотря на социальную и научную значимость, проблема диагностики растительных организмов разработана недостаточно и требует качественно новых решений.

Специфика оценки функционального состояния растений заключается в том, что они представляют собой открытые динамические системы со способностью к онтогенезу (индивидуальному развитию) и гомеостазу (поддержанию параметров и функций при изменении условий внешней среды). Ответные реакции таких организмов могут иметь различные проявления, которые в существенной степени зависят от фазы развития, условий обитания, а также вида раздражителя и его интенсивности. Из этого вытекает необходимость многопараметрических измерений в сочетании с высокой скоростью и минимальным влиянием на исследуемый объект.

Существующие методические подходы, как правило, позволяют регистрировать лишь отдельные биологические показатели: биохимические, физиологические, морфологические и т.п. Однако наиболее полную информацию о жизнедеятельности растений представляет анализ их структурно-функционального статуса, включающий микроструктурные тканевые и клеточные перестройки, фотосинтетические процессы и метаболическую активность. В доступной нам научной литературе не были обнаружены ссылки на универсальные подходы, обеспечивающие комплексную экспресс-диагностику неинвазивными способами. Для этого используют разнообразные методы и устройства, что делает измерения длительными, трудоёмкими, дорогостоящими и во многих случаях разрушающими.

Российский и зарубежный опыт в области измерений биологических объектов показывает широкие возможности оптического излучения. Его примене-

-3607.2. Определение расчетной надежности прибора многопараметрической диагностики растений и плодов

Эффективность практического применения приборов лазерной диагностики растений и плодов в немалой степени зависит от надежности их функционирования. В качестве показателей надежности выбраны среднее время безотказной работы и вероятность безотказной работы в течение сезонной эксплуатации прибора.

Расчет надежности был проведен по методическим рекомендациям [42, 245] в предположении, что устройство работает в фазе постоянной интенсивности отказов, а распределение отказов от времени наработки P(t) изменяется по экспоненциальному закону:

P(t) =exp(-Avt), (7.2.1)

где А0 - интенсивность отказов.

Интенсивность отказов прибора определяли как сумму интенсивностей отказов отдельных его элементов, поскольку отказы различных элементов являются, как правило, независимыми событиями:

а„=|Ал, (7.2.2)

где Я, _ интенсивность отказа г'-го элемента, пэ - число однотипных элементов, а т- число групп однотипных элементов.

Величины интенсивностей отказов элементов, входящих в состав разработанного оптико-электронного оборудования (табл.7.2.1), получены из справочных данных и на сайтах производителей [42, 141, 245]. Расчетная интенсивность отказа оборудования в целом составляет А0 =1,42 х 10'4 (1/ч).

Планируемый срок эксплуатации прибора - три года. При коэффициенте использования рабочего времени 0,5 наработка за этот срок составит около 3600 часов. Тогда, по формуле 7.1, вероятность надёжного функционирования оборудования в течение запланированного времени работы приблизительно равна 0,73. Среднее время работы измерительного модуля до отказа можно определить по формуле:

Приложение 1

излучателя, например, при наладке, то следует замкнуть переключатель П2. При этом излучатель отключаться не будет, а индикатор при пересветке сработает.

R1 - 10 кОм, R2 - 5,1 кОм, R3 - СП5-3,100 кОм, R4 - 100 кОм, R5 - 1,5 кОм, DA1 -К140 УД7, VD1-VD3 - Д223А, УТ1-КТ315Б; ГК1, ГК2 - РЭС55А; П1-ПЗ - МТЗ.