автореферат диссертации по информатике, вычислительной технике и управлению, 05.13.16, диссертация на тему:Компьютерный анализ пространственной структуры бета-структурных доменов глобулярных белков

РГи Са

, . РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ ОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи УДК 677.322.53

Втюрин Николай Николаевич

КОМПЬЮТЕРНЫЙ АНАЛИЗ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ БЕТА-СТРУКТУРНЫХ ДОМЕНОВ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ.

специальность 05.13.16 (биол. науки) -Применение вычислительной техники, математического моделирования и математических методов в научных исследованиях.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1993 г.

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук А.А.Александров.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н.А.Колчанов

кандидат биологических наук В.А.Куличков

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии РАН.

Запита диссертации состоится " " 1993 г.

в . час. на заседании Специализированного Ученого совета

К-002.42.01 при Новосибирском Институте органической химии СО РАН по адресу: 630090» г.Новосибирск} 90( проспект Академика Лаврентьева, 9.

Автореферат разослан " $ " /¿ОЛ-^Д^? 1993

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института органической химии СО РАН.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат физико-математических наук

Фл

В.И.Смирнов

ОБЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Проблема взаимосвязи структуры и функции биологических молекул всегда была центральной в молекулярной биологии. Для белков эта взаимосвязь наиболее интересна и, по-видимому, наиболее сложна, так как белки -это биологические макромолекулы, построенные из довольно большого числа разных мономеров - двадцати аминокислот.

Развитие методов автоматического определения

нуклеотидных последовательностей привело к быстрому накоплению данных и об аминокислотных последовательностях. В настоящее время в банках первичных структур белков насчитывается до 40000 последовательностей. В то же время в банке пространственных структур белков - только около 1000 белков (851 на январь 1992 г. [Protein Data Bank Newsletter, 1992]), причем многие из них являются модификациями одних и тех же или близкородственных белков. За год банк первичных структур примерно удваивает своя объем. Банк

пространственных структур за это же время становится в полтора раза больше. То есть, через год в банке первичных структур будет приблизительно 80000 последовательностей, а в банке пространственных структур - около 1500. Такой большой разрыв обусловлен, во-первых', значительной сложностью и трудоемкостью метода рентгеноструктурного анализа (РСА) -практически единственного метода, позволяюаего определять пространственную структуру белков на атомном уровне. Во-вторых, метод РСА имеет принципиальное ограничение: далеко не для всех белков удается получить кристаллы, даюцие качественную диффракционную картину.

Попытки предсказать пространственную структуру белков на основе аминокислотной последовательности, предсказав сначала участки вторичной структуры, и перебрав затем все варианты взаимодействия этих элементов в пространстве, не дали впечатляющих' результатов. Ксли на этом пути и удается

получить какие-то координаты, то больного доверия такие координаты не вызывают. Дело в том, что вторичная структура реальной белковой молекулы является функцией не только первичной структуры, но и конкретной третичной структуры данного белка, а именно эту структуру еще только предстоит определить. По-видимому, этим обстоятельством определяется тот предел правильности в предсказаниях вторичной структуры белков, какой мы имеем в настоящий момент, - 64% правилных предсказаний. Предел этот скорее всего принципиальный и не связан с техническими недоработками алгоритмов Предсказания вторичной структуры.

Таким образом, проблема определения пространственных структур белков обостряется с каждым годом. В связи с этим актуальность анализа уже существующих пространственных структур тоже возрастает, тем более, что материала для такого анализа уже достаточно (около 1000 структур).

В настоящей работе проведен анализ пространственных структур доменов глобулярных белков, содержащих бета-листы, • стабилизацию структуры которых вносит значительный вклад гидрофобное ядро. Анализ проведен для 58 доменов глобулярных белков из банка пространственных структур.

Пель и задачи исследования.

Целью настоящей работы был поиск основных факторов, определяющих архитектуру доменов глобулярных белков, содержащих бета-структуру, Под архитектурой чдесь понимается взаимное расположение в пространстве элементов вторичной структуры, без учета того, как эти элементы соединены петлями вдоль полипептидной цепи. Попутно ревалась следующая задача: выяснить, по возможности, как много различных типов архитектур возможно для доменов, содержащих бета-структуру.

Научная новизна.

Осуществлен оригинальный метод анализа бета-структуры белков, сочетающий построение пространственных моделей, теоретический и компьютерный анализ пространственных

структур белков.

Впервые анализ проводился на уровне архитектур, в указанном выше смысле, а не конкретных структур или топология, что во многом и определило получение результатов.

Впервые выявлено, что основным фактором, определяющим архитектуру доменов глобулярных белков, содержащих бета-структуру, является стремление гидрофобных групп образовать локальную плотную упаковку на поверхности бета-структурного листа.

Показано, что на число возможных архитектур доменов, структура которых держится в основном иа гидрофобном ядре и содержащих бета-структру, сильные ограничения накладывает геометрические параметры бета листа.

Показано, что значительное число таких доменов с известной пространственной структурой попадают в один из выявленных типов архитектур.

Теоретическая и практическая ценность.

Полученные в настоящей работе результаты имеют принципиальное значение для проблемы получения информации о пространственной структуре белков на основе их аминокислотной последовательности. Вместе с результатами работ Мурзина A.B. по альфа-спиральным белкам они показывают, что для любого белка с неизвестной пространственной структурой существует больаая вероятность того, что в банке, уже ревенных пространственных структур есть домены с таким же типом архитектуры. То есть задача состоит не в том, чтобы предсказать элементы вторичной структуры по первичной и скомбинировать из них третичную, а в том, чтобы правильно найти уже, как правило, существующий аналог архитектуры в банке пространственных структур, получив тем самым больную часть домена в почти готовом виде и уже после этого "доводить" более тонкие детали вторичной, супервторичной и доменной структуры.

Результаты данной работы могут применяться при

проведении рентгеноструктурных исследований белковых молекул и исследований методом ядерного магнитного резонанса, при проведении белковоинхенерных работ и других работ по исследованию трехмерной структуры белковых молекул.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 12-ой кристаллографической конференции (Москва, 1989), всесоюзном симпозиуме по химии белков (Тбилиси, 1990) и международной коференции "Моделирование и компьютерные методы в молекулярной биологии и генетике" (Новосибирск, 1990).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из Введения, трех Глав, Заключения, Выводов, Примечаний,

Благодарностей и Списка цитируемой литературы (92 работы). Объем диссертации 67 страниц текста, 42 рисунка, 1 таблица. Общий объем диссертации 98 страниц.

Первая глава посвящена анализу литературных данных об особенностях структурной организации глобулярных белков.

ГЛАВА 2. АНАЛИЗ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ

БЕТА-СТРУКТУРНЫХ ДОМЕНОВ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ.

2.1. Анализ располохения боковых гидрофобных групп на

плоском бета-листе.

Для анализа особенностей строения бета структуры из объемных СPK моделей был собран участок плоского бета-структурного листа с боковыми гидрофобными группаи на одной стороне и гидрофильными - на другой. Для того, чтобы решить, какие именно боковые гидрофобные группы использовать для анализа, был рассчитан объем средней боковой гидрофобной группы, с учетом частот встречаемости гидрофобных групп в 207 неродственных белках. Этот объем оказался с хорошей

точностью равен объему боковой группы Val (75 и 83 ангстрем5 соответствённо). Если далее отвлечься от детализации размеров и формы боковых гидрофобных групп, а считать их карами некоторой средней величины, с объемом в 75 ангстрем1, то получившуюся картину схематически мохно представить, как это изображено на рис.2.

Из рисунка видно, что такие гидрофобныные группы среднего размера невозможно расположить с одной стороны плоского бета-листа без наползания групп друг на друга в направлении водородных связей. Единственный способ устранить это наползание - скрутить лист так, как показано на рис.1. Бета-структура позволяет делать такое скручивание в определенных пределах за счет удлиннения водородных связей на краю бета-листа, и такое скручивание моделировалось также на объемных CPK моделях. При таком скручивании гидрофобные группы в центре рис.2. обозначенные знаком "+", расположатся выме плоскости рисунка, а отмеченные знаком "-" - ниже, благодаря чему и устранится наползание. По видимому, скручивание листа только одним из двух возможных способов обуславливается энтропийным фактором по Чотиа , то есть, в конечном счете, ассимметрией аминокислотных остатков. Центры С-альфа атомов такого листа располагаются на поверхности второго порядка, которой трудно однозначно подобрать название в рамках рассматриваемого приближения (рис.11. Эту поверхность можно представить как небольшой участок однополостного гиперболоида или гиперболического

параболоида. Существенно, что при таком скручивании одновременно с устранением наползания уменьиаются наибольшие промежутки между боковыми гидрофобными группами вдоль одной из диагоналей (вдоль этой диагонали лист приобретает кривизну, которая способствует уменьшению этих промежутков). Вдоль такой диагонали получается упаковка гидрофобных групп, напоминающая упаковку шаров в плоском слое с координацией шесть. Далее будем называть такую упаковку локальной плотной

Рис.1. Схематическое изображение скрученного бета-листа с прямыми стрендами.

Рис.2. Схематическое изображение упаковки гидрофобных групп

среднего размера на одной из сторон бета-листа с соблюдением реальных относительных размеров гидрофобных групп и параметров бета-листа.

Толстыми линиями указаны направления стрендои. Большие кружки - гидрофобные группы, направленные на читателя, маленькие - центры С-альфа атомов, боковые группы которых направлены за рисунок.

упаковкой.

Нужно подчеркнуть, что это локальная плотная упаковка, аналогичная плотной упаковке щаров в плоском слое с координацией весть, но на поверхности, имеющей существенную кривизну, которой нельзя пренебречь, и существующая только в окрестности диагонали. Поэтому, по мнению автора, такая упаковка качественно отличается от плотной упаковки щаров в слое.

Как видно из рис.2. наибольмие промежутки вдоль диагоналей между боковыми гидрофобными группами сравнимы с размерами самих боковых гидрофобных групп. Так как боковая группа валина (Val, СНз-СН-СНз), объем которой приблизительно равен среднему объему боковой гидрофобной группы, значительно больве воды (НгО), то это невыгодная конформация с точки зрения гидрофобных взаимодействий, а гидрофобные взаимодействия вносят, по видимому, определяющий вклад в стабильность доменов, структура которых держится за счет гидрофобного ядра. Зададим себе вопрос, каким образом можно наиболее эффективно устранить эти промежутки равномерно на всей поверхности бета-листа, не увеличивая энергию остальных взаимодействий. Единственный способ - это изогнуть лист. Анализ, проведенный на объемных СРК моделях показал, что за счет изменения углов Фи и Пси у аминокислот, составляющих бета-лист, его можно изгибать так, что не меняется длина водородных связей между стрендами, а меняется только^ угол, между >Л-Н и 0=С< диполями водородных связей основной цепи. Энергия водородной свя\и слабо зависит от этого угла. При таком изгибании, конформации отдельных аминокислот, составляющих бета-лист, остаются в пределах разрешенных конформаций на карте Рамачандрана (нет перекрывания Ван-дер-Ваальсовых радиусов атомов) даже с учетом боковых групп. То есть, бета-лист можно изгибать без уменьшения энергии водородных связей так, что расстояние между С-альфа атомами аминокислот вдоль цепи,

определяемое фиксированной длиной пептидной группы, и расстояние мехду С-альфа атомами аминокислот в направлении водородных связей сохраняются. Такой лист мохно равномерно изгибать в сторону боковых гидрофобных групп для их сближения только по поверхности конуса или циллиндра. Поверхность конуса не подходит, так как она не

обеспечивает одинаковое сближение боковых гидрофобных групп на всей поверхности листа. Остается изгибание листа по поверхности циллиндра так, чтобы направление наибольшей кривизны совпадало с направлением наибольших промежутков между боковыми гидрофобными группами для максимального их сближения (направление одной из диагоналей).

2.2. Анализ формирования бета-структурных доменов.

Если продолжить изгибание, упаковывая группы вдоль такой диагонали, то, при достаточном числе стрендов, бета-лист может резко уменьшить свою энергию при образовании замкнутого по водородным связям циллиндра. Это выгодно из-за максимальной реализации гидрофобных взаимодействий и водородных связей. Анализ бета листов, собранных из объемных моделей СРК, показал, что минимальное число стрендов, при котором бета-лист может замкнуться сам на себя, равно пяти. Проведенный анализ банка пространственных структур белков с помощью стереоскопических рисунков, микрофиш и различных программ визуализации белковых молекул показал, что из числа белков, ревенных рентгеноструктурным анализом, известно несколько бета-структурных доменов, имеющих в разной степени замкнутую на себя по водородным связям бета-структуру (таб.1). Предположим сначала, что бета-лист во всех этих доменах образует идеальный циллиндр. Зная геометрию бета-листов из рентгеноструктурных работ (Н = 4,7 ангстрем -среднее расстояние между С-альфа атомами соседних стрендов бета-структуры и С = 7 ангстрем - расстояние между С-альфа

Табаава 1.

1аравтервве варааетрв простравствеввоа cTpyiTjpi ceieicri (en струвтураи rnieioi.

Ceaeamo

loaea D na "/»£*' v v" *Я|1 ""I1

i'

бета-струвтурвад доаев с щешш воваамо) íiotboi

УШ0110*

гадро^обввв

rpf ПП

56°

Бета-гавербоювд-5 Ста^яиоюпот ауввеааа < 2 5 10.5 2.1 5?» Ш 110 И 8

Бета-гвпербовоад-6 Травсвв DIP * 8 б .8.5 1.4 46» 10? 132 16 1

5ета/бета-с5вдвач, I(G Fab Не» 1-аа даст 2-оа ист 8 3 12 15 1 15

livla/6eT»-raatpSoao»»-8 Тр*о5о|ос+ат t азоаерааа TIK 15 8 8 1 31« 122 Ш 12 25

iifcía/6tT«/mJ«-c3»im ^ааводовсав 21 5 Н 13

*

D n s

<¿> V

loacaa i «тори бета-струвтура аааввута.

Обаее пело ddioSbii довевов, вавествв! автору. Число стревдов ■ доаеае.

Сдааг по »(пород«»« caasaa (a ааввоввевотвн octbtbbi). Угоа iciij ваврвваеваеа стревдов a rimo« o»a гапербоаоада (ааааввдра), Удельаиа об 'en aa ввутревнад octitoi, расситаввва ш вдеааьвого ganaaipa, с уюто« чвсаа стревдов a ciura do водородваа еввма а реавноа доаеве. Vag Гдеиш об'ев aa авутреввва ocnjoi, pacciaraaaai «aa вдевашго gaaaaiipa, с lacaoa стревдов рши ntii стрецо» a peíalas» шик « catara no iiitpiun ciajaa panero ynotií-jij utij стревдов i реадьаоа доаеае, то есть ш оптавааьви усаоваа ввотвог увавовва ввутр'в даааадра (oraoieiae s/n=2)

ННва - Часдо raapofoiaai групп вавраввевпвх внутрь гапербоаовда (даааввдра) два аавввутвв бета-аастоа,

- lacio гавро^обавв груш ва сторове бета-иста, участаукеа а обрааоваваа гадро^обвого адра два «оаевов с аааувогаобуаавово! увааиоа.

- lacia гвярфбви групп аа одвоа п сторов бета-ааста дав доаева (аааодовсава,

№ар - Чаем гааро)обввх групп с ввеввеа сторон гавербоаовда {вааааадрв) дав аааввутвв бета-аастоа.

- Час» гавро^обава групп аа сторове бета-васта, ве умствуввеа а обрааоваваа гадро^обвого «дра два доаевоа с аааувогаобуаавово! унтов.

- fació гвдро^обвах групп ва другое сторове бета-ааста дав доаева (а'юювеваа.

2

атомами в положениях i, i+2 вдоль цепи, то есть боковые группы которых располагаются по одну сторону бета-листа) можно рассчитать удельный объем, приходящийся на аминокислотный остаток, боковая группа которого направлена внутрь циллиндра (назовем его внутренним остатком). Этот объем зависит от числа стрендов, замыкающих циллиндр (п), и от сдвига по водородным связям (s) при замыкании (формула 1). Сдвиг по водородным связям можно объяснить на примере развертки сетки водородных связей трипсина DIP (рис.6). Левый иэолейцин (I) нижнего стренда находится напротив, если смотреть по водородным связям, остатка, расположенного правее правого тирозина (Y) верхнего того же еамого, поскольку циллиндр замкнут, стренда. Расстояние "s" между ними вдоль стренда в остатках, с учетом деформации сетки водородных связей между первым и вторым сверху стрендом, равно 8.5.

Из таб.1 видно, что для всех замкнутых доменов, несмотря на разное число стрендов и разный сдвиг по водородным связям, удельный объем на внутренний остаток сохраняется с точностью 15%. Результат вполне понятный в том смысле, что плотность упаковки в гидрофобном ядре не должна зависеть от числа стрендов. То есть с увеличением числа стрендов такой замкнутый циллиндр стремится сохранить удельный объем на внутренний остаток за счет "отставания" сдвига по водородным связям "s". Однако для достижения оптимальных условий локальной плотной упаковки (рис■3) необходимо вполне определенное отношение сдвига по водородным связям к числу стрендов равное двум (s/n = 2).

Наиболее точно это отношение- выполняется только дли 5-

0 0 Ф Q

Ф Ф ()/<) (КО О С)

0 Ф 0 0

Рис.3. Схематическое изображение локальноя плотной упаковки боковых гидрофобных групп в замкнутых бета-листах домена с идеальной локальнол плотнол упаковкой боковых гидрофобных групп и доменов типа стафиллококковоя нуклеаэы. Жирные стрелки указывают направление сближения внутренних боковых гидрофобных групп при скручивании бета-листа. Размеры кружков не в масштабе.

Рис.4. Схематическое изображение пространственноя структуры домена стафилококковой нуклеаэы [Richardson, J.S. 1981].

Заштрихованы участки, формирующие активный центр.

ти стреядового циллиндра стафиллококковой нуклеазы, s/n = 2.1 (смотри таб.1. рис.3.4). Для циллиндров с большим числом стревдов входят в противоречие две тенденции: стремление к локальной плотной упаковке и образованию замкнутого циллиндра с одной стороны и стремление сохранить удельный объем на внутренний остаток с другой. Из проведенного анализа банка пространственных структур следует, что с определенной степенью успеха компромисс находят нестистрендовые домены типа трипсина (отношение s/n равно 1.4). Боковые гидрофобные группы при изгибании бета-листа в таких доменах приближаются друг к другу, как показано на рис.5 (смотри также таб.1. рис.6.7.8). Ясно, что для семи - восьми-стрендовых циллиндров требования локальной плотной упаковки внутренних гидрофобных групп, при условии сохранения удельного объема на внутренний остаток, выполняются еще хуже, чем в структурах типа трипсина. В результате циллиндр не образуется, а образуется чисто двухслойная структура, что можно видеть на развертке сетки водородных связей домена иммуноглобулина (смотри таб.1. рис.9.10).

Исходя из вышеизложенного совсем непонятно

существование структуры восьмистрендового замкнутого циллиндра триозофосфатизомераэы (TIM). Боковые группы внутренних остатков этого домена сближаются как показано на рис.11 (отношение s/n = 1). Непонятно до тех пор, пока мы не посмотрим на наружную поверхность циллиндра и не "обнаружим", что "плохой" угол внутри циллиндра автоматически приводит к оптимальной упаковке гидрофобных групп на наружной стороне циллиндра (рис.11). Оказывается на наружной стороне циллиндра в TIM находится в два раза больше гидрофобных групп - 26, чем на внутренней - 12. Наружные гидрофобные группы прикрыты гидрофобными группами восьми альфа-спиралей (рис.12). Отсюда следует вывод, что гидрофобным ядром домена TIM ' является не совокупность

Рис.5. Схематическое изображение фокальной плотной упаковки боковых гидрофобных групп в замкнутых бета-листах доменов типа трипсина.

Жирные стрелки указывают направление сближения

внутренних боковых гидрофобных групп при изгибании

(

бета-листа.

Размеры кружков не в масштабе.

Рис.6. Схема сетки водородных связей одного из доменов трипсина DIP [Levitt, М., and Greer, J. 1977].

Боковое гидрофобные группы, направленные внутрь циллиндра-гиперболоида, обведены жирной полоской, наружу - заштрихованной полоской. Верхний и нижний стренды - один и тот же стренд.

Рис,7»

Схематическое изображение пространственной структуры домена трипсина [Я1сЬаг<180П, -КБ. 1981] .

Рис.8.. Точное стереоскопическое (объемное) изображение пространственной структуры домена трипсина в ракурсе предыдущего рисунка.

Последовательно соединенные С-альфа атомы полипептидной цепи..

Схематическое изображение пространственноя домена Fab фрагмента иммуноглобулина Q New.

структуры

Рис.10. Точное стереоскопическое (объемное) изображение пространственной структуры домена Fab фрагмента иммуноглобулина G New в ракурсе предыдущего рисунка. Последовательно соединенные С-альфа атомы полипептидной цепи.

Pnc.ll» Схематическое изображение локальной плотной упаковки боковых гидрофобных групп в замкнутых бета-листах доменов типа триоэофосфатизомераэы. Жирные стрелки указывают направление сближения внутренних боковых гидрофобных групп при изгибании бета-листа. Тонкие линии показывают направление сближения внешних по отномению к циллиндру-гилерболоиду боковых гидрофобных групп. Размеры кружков не в масштабе.

Схематическое изображение пространственной структуры домена триоэофосфатизомераэы [Richardson, J.S. 1981).

гидрофобных групп внутри циплиндра, а циллиндрическая прослойка гидрофобных групп между циллиндром бета-структуры и альфа-спиралями. Поэтому в таб.1 нет смысла сравнивать удельный об'ем на внутренний остаток TIM с доменами типа трипсина и стафиллококковой нуклеаэы, структура которых держится на одном внутреннем гидрофобном ядре. Для этих доменов (стафилококковой нуклеаэы и трипсина) удельный объем сохраняется с точностью 7Х.

Гидрофобные группы снаружи циллиндра, стремясь к локальной плотной упаковке изгибают циллиндр наружу так, что линии наибольшей кривизны располагаются параллельно оси циллиндра. И циллиндр это уже не циллиндр, а однополостный гиперболоид, образованный приблизительно прямыми стрендами (образующими гиперболоида), расположенными под углом 37° к главной оси гиперболоида (рис.12). Прямые альфа-спирали, расположенные под тем же углом к главной оси гиперболоида, дополнительно способствуют выпрямлению стрендов. Наиболее наглядным примером такой конструкции является сегмент Иуховской башни на Каболовке. Гидрофобные группы, выстилающие гиперболоид изнутри, стремятся образовать хоть какую-то, далекую от идеальной, локальную упаковку, группируясь вокруг окружности наибольшей кривизны (плоскость окружности перпендикулярна главной оси гиперболоида).

На примере TIM становится понятно, Ъак домен с помощью того же самого твиста реиает задачу плотной упаковки гидрофобных групп одновременно на обеих сторонах бета-листа. Гидрофобные группы на разных сторонах листа группируются вдоль приблизительнй перпендикулярных диагоналей и, стремясь к плотной упаковке, изгибают лист вдоль этих диагоналей в свою сторону.

С той же задачей сталкивается домен флаводоксина, тоже относящийся к альфа/бета доменам, но бета-лист которого не образует замкнутую структуру.. Обе стороны этого листа одинаково заселены гидрофобными группами (таб.1) и каждый

кластер гидрофобных групп изгибает лист вдоль своей диагонали в свою сторону. Лист, образованный приблизительно прямыми стрендами, опать же получается скрученным. Альфа-спирали, располагаясь вдоль стрендов, прикрывают своими гидрофобными группами гидрофобные группы с обеих сторон Овта-писта, дополнительно способствуя выпрямлению стрендов

•(рис, 13114) •

Из таб.1 видно, что один из листов, как и во фяаводоксине, одинаково заселен гидрофобными группами с обеих сторон. Бета-лист приобретает ту же скрученность (с упаковкой гидрофобных групп вдоль разных диагоналей с разных сторон), что и в домене флаводоксина. Гидрофобные группы на этом бета-листе, образующие кластер, не входящий в гидрофобное ядро домена, участвуют в образовании гидрофобного ядра между доменами при димеризации доменов. Второй лист, имеющий гидрофобный кластер только с одной стороны, прикрывает своими гидрофобными группами гидрофобные группы на первом листе, образуя вместе с другим листом гидрофобное ядро домена, и повторяет форму первого.

Таким образом, архитектура доменов, содержащих бета-структуру, подчиняется определенным, довольно жестким физическим и геометрическим ограничениям, что сильно уменьшает возможный спектр таких архитектур. По мнению автора, число различных типов архитектур бета-структурных доменов не превыиает 12-13. В настоящей работе описано с разной степенью проработки семь таких типов.

ГЛАВА 3. КЛАССИФИКАЦИЯ БЕТА-СТРУКТУРНЫХ ДОМЕНОВ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ.

Итак, значительное число доменов, содержащих бета-структуру, подразделяются на несколько четко очерченных групп (таб.11. особенности архитектуры которых зависят от

Рис.13. Схематическое изображение пространственной структуры домена флаводоксина (ШсЬагёвоп, .КБ. 1981] .

Рис.14. Точное стереоскопическое (объемное) изображение пространственной структуры ' домена флаводоксина в ракурсе предыдущего рисунка.

Последовательно соединенные С-альфа атомы полипептидной цепи.

числа и взаимного > расположения вдоль цепи элементов вторичной структуры (бета-стрендов и альфа-спиралей), образующих домен. А именно:

I. Класс бета-доиенов.

3.1. Семейство: Бета-гиперболоид-5 (beta-hyperboloid-5). Описание: Домены типа стафиллококковой нуклеазы. Пять

стрендов антипараллельной бета-структуры замкнуты

водородными связями в гиперболоид (замыкание из-за нечетного числа стрендов осуществляется параллельными стрендами). Идеальные условия внутри гиперболоида для локальной плотной упаковки гидрофобных групп (отношение сдвига по водородным связям к числу стрендов равно 2.1).

Характерный пример: Домен стафиллококковой нуклеазы, (staphylococcal nuclease), 2SNS, (таб.1, рис.3.4).

Число известных структур: Семейство представлено по крайней мере одним доменом (из чксла известных автору ревенных пространственных структур).

3.2. Семейство: Бета-гиперболоид-6 (beta-hyperboloid-6). Описание: Домены типа трипсина.

Несть стрендов антипараллельной бета-структуры замкнуты в гиперболоид. Условия для локальной плотной упаковки гидрофобных групп внутри гиперболоида хуке, чем в домене типа стафиллококковой нуклеазы (отношение равно 1.4). Особенности бета-структуры этой группы доменов вытекают из положения этой группы между группой стафиллококковой нуклеазы с ее почти идеальным гиперболоидом и группой доменов с иммуноглобулиновой укладкой где бета-структура образует два слоя.

Характерный пример; Домен трипсина DIP (tripsin-DIP), 4РТР, (таб.1. рио.5.6.7.8).

Число известных структур: Семейство представлено по

крайней мере восемью доменами.

Два домена трипсина DIP (tripsin-DIP), 4РТР; два домена альфа-химотрипсина (MRC) (alfa-chymotripsin, MRC, cow), 4СНА; два домена альфа-химотрипсина (Michigan) (alfa-chymotripsin, Michigan, cow), 5CHA; домен химотрипсиногена А (chymotripsinogen A, bovine), 2CGA; домен эластаэы (elastase, porcine), 3EST.

Необходимо подчеркнуть, что у всех перечисленных доменов число стрендов, образующих гиперболоид "п" равно 6, и сдвиг по водородным связям "з" равен 8.5.

3.3. Семейство: Бета/бета-сэндвич (beta/beta-sandwich).

Описание: Домены с иммуноглобулиновой укладкой. Больное число (7-8) стрендов не позволяет найти компромисс между стремлением к локальной плотной упаковке гидрофобных групп внутри гиперболоида и тенденцией сохранить удельный объем на внутренний остаток при замыкании структуры. Бета-лист распадается на два листа с формой учаска однополостного гиперболоида или гиперболического параболоида образованного приблизительно прямыми стрендами.

Характерный пример: Домен Fab фрагмента иммуноглобулина G New (immunoglobulin G Fab, Human myeloma New), 3FAB, (смотри таб.1. рис.9.10).

Число известных структур: Семейство представлено доменами с иммуноглобулиновой укладкой. По крайней мере 8 представителей данного семейства.

Четыре домена Fab фрагмента иммуноглобулина G New (immunoglobulin G Fab, Human myeloma New), 3FAB; два домена вариабельной части белка Бен-Джонса (Variable part of Bence-Jones, human myeloma REI), 1REI; два домена димера белка Бен-Джонса (Bence-Jonce dimer Meg, Human), 3MCG.

Во всех перечисленных Доменах число стрендов больне мести и все эти структуры не образуют замкнутого по водородным связям гиперболоида.

II. Класс альфа/бета доменов.

3.4. Семейство: Альфа/бета-гиперболоид-8

(alfa/beta-hyperboloid-8).

Описание : Домены типа триозофосфатизомеразы (TIM). Восемь прямых стрендов параллельной бета-структуры замкнуты водородными связями в гиперболоид. Идеальные условия локальной плотной упаковки боковых гидрофобных групп на наружной поверхности гиперболоида, где расположено две трети (25) всех боковых гидрофобных групп бета-гиперболоида. Эти две трети прикрыты таким же колическтвом боковых гидрофобных групп 8-ми альфа-спиралей. Образование такой структуры возможно при наличии в домене восьми бета-стрендов, чередующихся вдоль цепи с одной или двумя альфа-спиралями. Исключение составляет структура домена енолазы (enolase), архитекутра которого имеет тот же вид восьмистрендового бета-гиперболоида, прикрытого восьмью спиралями, но в гиперболоиде есть один стренд, антипараллельный к соседним с ним стрендам, то есть нарушается условие строгого чередования бета-структурных и альфа-спиральных участков вдоль цепи.

Характерный пример: Домен триозофосфатизомеразы (Triose phosphate isomerase, chicken), 1TIM, (таб.1. рис.11.12).

Число известных структур: Семейство представлено по крайней мере 15 доменами. На этом семействе удобно продемонстрировать, как домены с одинаковой архитектурой и в большинстве случаев с одинаковой топологией обладают совершенно разными функциями (рис.15). Однако активный центр во всех доменах этого семейства располагается в полости, образованной С-концами бета-стрендов. Необходимо отметить что все эти ферменты слабо гомологичны между собой по первичной структуре.

KDPG альдолаза (KDPG aldolase), 1KGA;

Рис.15. Схематическое изображение доменов семейства алъфа/бета-гиперболоид-8: триоэофосфатизомераэы, первого домена пируват киназы и КОРв альдолазы с разными каталитическими функциями и с одинаковой архитектурой и топологией.

Триозофосфатиэомераэа (Trióse phosphate isomerase, chicken), 1TIM; Дрохжевая еяояаза (Yeast enolase), 2ENL; Первый из трех доменов пируват киназы (Pyruvate kinase, cat), 1PYK; Триптофан синтаза (Tryptophan synthase), 1WSY; Така-амилаза (Taka-amylase), 2TAA; Триметиламиндегидрогеназа

(Trimethylamine dehydrogenase); Ксилозоизомераза (Xylose isomerase), 1XIA; Флавоцитохром Вг (Flavocytochrome Вг), 1FCB; Гликолат оксидаза (Glycolate oxidase)., 1G0X; Ру-Бис-Ко (RuBiaCo, Rhodospirillum rubrum), 2RUB; Два домена N-(5'-Фосфорибозил)антранилат изомераза-индол-3-глицерол-фосфат синтаза (N-(5'-Phosphoribosyl)anthranilate isomerase-indole-3-glycerol-phosphate synthase); Муконат лактоназа (Muconate lactonizing enzyme), 1MLE; Манделат рацемаза (Mandelat racemase).

Необходимо подчеркнуть, что у всех перечисленных доменов число стрендов, образующих гиперболоид "п" равно 8, и сдвиг по водородным связям "s" равен тохе 8.

3.5. Семейство: Альфа/бета/альфа-сэндвич

(alfa/beta/alfa-Bandwich).

Описание: Домены типа флаводоксина. Несколько приблизительно прямых стрендов параллельной или смешанной бета-структуры образуют бета-лист, с каждой стороны которого гидрофобные группы образуют локальную плотную упаковку вдоль своей диагонали и изгибают лист в свою сторону. Спирали прикрывают эти кластеры своими гидрофобными группами с обеих сторон. Несмотря на только что описанное сходство архитектур, члены этого семейства гораздо более разнообразны по топологии по сравнению с другими семействами.

Характерный пример: Домен флаводоксина (Flavodoxin, Clostridium Мр), 3FXN, (таб.1. рис.13.14).

Число известных структур: Семейство представлено по

крайней мере 21 доменом.

Домены с чисто параллельными бета-листами:

Первый домен лактат дегидрогеназы (Lactate

dehydrogenase, dogfish), 4LDH; Первый домен D-глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (D-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, lobster), 1GPD; Второй домен алкоголь дегидрогеназы (Alcohol dehydrogenase, horse), 4ADH; Аденилат киназа (Adenilate kinase, porcine), 3ADK; Второй домен фосфоглицераткиназы (Phosphoglycerate kinase, yeast), 2PGK; Второй домен фосфофруктокиназы (Phosphofructokinase), 3PFK; Второй каталитический домен аспартат транскарбамилазы (Aspartate transcarbamylase); Второй домен фосфорилазы (Phosphorylase); Первый домен арабинозо-сзязывавцего белка (Arabinose binding protein), 1АВР; Первый домен роданезы (Rodanese), 1RHD; Флаводоксин (Flavodoxin, Clostridium Mp), 3FXN; Субтилизин (Subtilisin BPN', Bacillus

amyloliquifacience).

Домены со смешанными параллельно-антипараллельными бета-листами:

Первый и второй домены гексокиназы В (Hexokinase В III, yeast), 2УНХ; Третий домен пируват киназы (Pyruvate kinase), 1PYK; Фосфоглицерат мутаза (Phosphoglycerate mutase, yeast), 3PGM; Карбоник ангидраза В (Carbonic anhydrase В, human), 2САВ; Карбоксипептидаза В (Carboxipeptidase В, bovine), 1СРВ; Дигидрофолатредуктаза (Dihydrofolate reductase), 4DFR; Тиоредоксин (Thioredoxin), 1SRX; Второй домен ДНК полимеразы I (DNA plymerase I, Esherichia coli), 1DPI.

3.6. Неканонические семейства.

До настоящего момента все нане исследование проводилось в предположении, что объем средней гидрофобной группы равен

75 ангстрем'. 'Это предположение приблизительно верно для всех рассмотренных выше доменов. Но конечно же это только нулевой уровень анализа. Конкретный аминокислотный состав гидрофобных ядер доменов конечно же может влиять на форму бета-структурных листов. Однако значительное число доменов, поддающихся анализу даже на этом нулевом уровне, без учета конкретного аминокислотного состава, говорит о том, что этот нулевой уровень выбран правильно, и что стремление гидрофобных групп к локальной плотной упаковке на поверхности бета-структурного листа определяет основные особенности архитектуры бета-структурних доменов.

В качестве примера влияния аминокислотного состава гидрофобного ядра на форму бета-структурного листа можно привести пример домена глутатион редуктазы (Glutathione reductase), который содержит уплощенный лист бета-структуры (beta-sheet-E). Средний объем боковых гидорофобных групп в гидрофобном ядре мехду антипараллельным бета-листом-Е и двумя альфа-спиралями равен не 75, а 89 ангстрем3. Но архитектура такой - структуры все таки является альфа/бета/альфа-сэндвичем.

Более впечатляющим примером является: структура белков конканавалина (Concanavalin, 3CNA), и лектина гороха (Pea lectin). Один из бета листов у этих структур необычно плоский и необычно больпих размеров. Другой же бета-лист изогнут в сторону, противоположную гидрофобному ядру. Средний объем боковых гидрофобных групп в гидрофобном ядре этих структур равен 108 ангстрем3. Такого рода структуры не принадлежат ни к одному из перечисленных выве . семейств и составляют отдельное семейство, которое можно назвать beta/beta-sandwich-big (класс бета-доменов).

Эти факты говорят о том, что в рамках нашего приближения, уменьшение наползания идеальных сфер с объемами, равными среднему объему гидрофобных групп (75 ангстрем3), является менее значительным фактором, приводящим

к скручивании (твисту) -бета-листов, чем уменьшение наибольших промежутков между гидрофобными группами вдоль одной из диагоналей бета-структрного листа. Конкретная форма боковой гидрофобной группы конечно же не сферическая, за исключением глицина (Gly, G) и аланина (Ala, А), и аппроксимация боковой группы эллипсоидом может быть более подходящей для некоторых случаев. Однако в данной работе специально использована сферическая аппроксимация, для того чтобы наиболее ярко показать обцее распределение боковых гидрофобных групп на поверхности плоского бета-листа, без конкретных деталей, затушевывающих главные особенности этого распределения и для того, чтобы наиболее ярко было видно, что максимальные промежутки между боковыми гидрофобными группами, расположенные вдоль диагоналей бета-листа имеют размеры, сравнимые с размерами самих боковых гидрофобных групп. Эта главня картина распределения боковых 9-идрофобных групп в нашем приближении не зависит от того, является ли бета-лист антипараллельным, параллельным или смешанным.

В отдельное семейство небоходимо выделить также малые белки (до 80 аминокислот), в которых не набирается "критическая масса" гидрофобных групп и основным стабилизирующим фактором являются несколько ковалентных S-S связей (назовем это семейство условно SS-small). Архитектура такого типа структур уже в меньшей степени определяется локальной плотной упаковкой боковых гидрофобных групп и может быть более разнооборазной. Характерным примером такой структуры может _ служить домен трипсинового 1 ингибитора (Bovine pancreatic tripsin inhibitor, BPTI), 6PTI.

Однако как в семействе SS-small, так и в семействе beta/beta-sandwich-big (назовем эти семейства

неканоническими в отличие от предыдущих семейств) сохраняется в .разной степени общая тенденция к скручиванию как больших бета-листов, так и бета-структурной шпильки из двух стрендов.

выводы.

1. С целью выявление основных факторов, определяющих архитектуру Вета-структурных доменов глобулярных белков, осуществлен комплексный анализ, сочетающий построение пространственных моделей, теоретический и компьютерный анализ пространственных структур бета-структурных белков. Анализ пространственной структуры проведен для 58 различных бета-структурых доменов глобулярных белков, в стабилизацию структуры которых значительный вклад вносит гидрофобное ядро. Анализ проводился в основном с помощью различных программ визуализации белковых структур, а также с помощью стереоскопических рисунков, микрофии со стереоскопическими изображениями белков, и с использованием объемных пространственных моделей белков типа СРК.

2. Показано, что основным фактором, определяющим архитектуру доменов глобулярных белков, содержащих бета-структуру, является стремление гидрофобных групп образовать локальную плотную упаковку на поверхности бета-структурного листа.

3. Показано, что стремление гидрофобных групп к локальной плотной упаковке на поверхности бета-структурного листа является одной из основных причин твиста бета-структурных листов.

4. Показано, что на число возможных архитектур бета-структурных доменов, структура которых держится в основном на гидрофобном ядре, сильные ограничения накладывают геометрические параметры бета листа.

5. Показано, что значительное число таких доменов (58) с известной пространственной структурой попадают в одно из выявленных семейств архитектур (бета-гиперболоид-5, бета-гиперболоид-6, бета/бета-сэндвич, альфа/бета-гиперболоид-8, альфа/бета/альфа-сэндвич, ЭБ-втаИ, ЬеЪа/Ье1а-5апак1сЬ-Ь^).

6. Показано, что гидрофобным ядром доменов типа триозофосфатизомеразы (алЫ$а/бета-гиперболоид-8) является не ансамбль боковых гидрофобных групп в центре бета-структурного гиперболоида, а прослойка боковых гидрофобных групп между бета-гиперболоидом и окружающими его альфа-спиралями.

7. Проведено четкое разграничение между замкнутыми бета-листами и чисто двухслойными бета-структурами и установлена зависимость этого параметра бета-структуры от числа бета-стрендов, составляющих домен.

Для чисто бета-структурных доменов с антипараллельной бета-структурой эта зависимость следующая:

а) при числе стрендов меньие или равном четырем бета-лист не может иметь замкнутую структуру;

б) при числе стрендов равном пяти домен имеет идеальный замкнутый бета-лист;

в) при числе стрендов равном аести домен еще имеет замкнутый бета-лист, но этот лист как бы начинает разделяться на два отдельных бета-листа;

г) при числе стрендов больше или равном семи домен полностью разделяется на два отдельных бета-листа.

Для альфа/бета доменов с параллельной и смешанной бета-структурой эта зависимость следующая:

а) При числе стрендов равном восьми и при условии регулярного чередования вдоль цепи восьми бета-стрендов и, как правило, восьми спиралей (в некоторых доменах за стрендом может следовать не одна а две спирали) бета лист замкнут;

б) в остальных случаях домен имеет незамкнутый бета-

лист.

Полученные в настоящей работе результаты имеют принципиальное значение для проблемы получения информации о

пространственной структуре белков на основе их аминокислотной последовательности. Вместе с результатами работ Иурзина A.B. [Мурзин, A.B., Финкельитейн, A.B. 1983] по альфа-спиральным белкам они показывают, что для любого белка с неизвестной пространственной структурой существует больная вероятность того, что в банке уже решенных пространственных структур есть домены с таким же типом архитектуры. То есть задача состоит не в том, чтобы предсказать элементы вторичной структуры пог первичной и скомбинировать из них третичную, а в том, чтобы правильно наити уже, как правило, существующий аналог архитектуры в банке пространственных структур, получив тем самым большую часть домена в почти готовом виде и уже после этого "доводить" более тонкие детали вторичной, супервторичнои и доменной структуры.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Lobsanov Yu.D., Pletnev V.Z., Vtyurin N.N., Lubnin M.Yu.

Mokulskii, H.A.

X-ray Study of the Carbohydrate Complex of Pea Lectin

(Pisum Sativum).

Twelfth European Crystallographic Meeting. Moscow. USSR.

August 20-29, 1989. Collected Abstracts. 1989, v.2,p.389.

2. Лобсанов, Ю.Д., Плетнев, B.3., Вторив, H.H., Яубнин И.С.,

Мокульский H.A.

Структурные аспекты углеводной специфичности лектина

гороха.

Тезисы всесоюзного симпозиума по химии белков. г.Тбилиси.

21-26 мая 1990, стр. 24-25.

3. Втврин, Н.Н.

Роль локальной плотной упаковки гидрофобных групп в бета-структурных белках.

Биополимеры и клетка. 1990, том 6, NX3, стр.15-24.

4. N.Vtyurin.

The Role of Local Tight Packing of Hydrophobic Groups in Beta-Structure Proteins.

In: Abstracts of the International Conference "Modelling and computer methods in molecular biology and genetics", Novosibirsk, 1990, p.74

5. Лобсанов, О.Д., Плетнев, В.З., Втврин, Н.Н., Лубяин М.Ю., Монульския М.А., Урхумцев А.Г., Лунин В.В., Лузянина Т.Е.

Рентгеноструктурные исследования комплекса лектина из гороха с углеводом при разрешении 2.4 ангстрем. I. Атомная модель.

Биоорганическая химия. 1990. т.16, N% 12, с.1589-1598.

6. Vtyurin, N.

The Role of Local Tight Packing of Hydrophobic Groups in Beta-Structure.

Proteins: Structure, Function, and Genetics. 1993, v.15, NX1, p.62-70.

Подписано к печати 21-10-1993

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. л. 3. Уч.-изд. л. 2,2 Тираж юо экз. Заказ 131

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10