автореферат диссертации по безопасности жизнедеятельности человека, 05.26.02, диссертация на тему:Люминесцентный анализ лимфоцитов периферическойкрови в оценке функционального состоянияиммунной системы организма

На правах рукописи

ЮСУПОВА ЛИРА БАТУЕВНА

Люминесцентный анализ лимфоцитов периферической крови в оценке функционального состояния иммунной системы организма

05.26.02 - защита, безопасность, спасение и жизнеобеспечение населения в чрезвычайных ситуациях

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандитата биологических наук

Архангельск - 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институ! онкологии и медицинской радиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь (г.Минск).

Научный руководитель: Научный консульнант: Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Океанов А.Е.

кандидат физико-математическ, наук, доцент Козлов В.Д. доктор биологических наук, профессор Рувинова Л.Г. кандидат биологических наук Безрукова А.Г.

Ведущая организация: Институт экспериментальной

медицины РАН Защита состоится" 1997г. в /¿-ч'лс

на заседании диссертационного совета Д.084.60.01 п Архангельской государственной медицинской академ по адресу: 163061, г.Архангельск, Троицкий проспект, ^

С диссертацией можно ознакомиться в библиоте Архангельской государственной медицинской академии.

Автореферат разослал ¿¿¿¿¿Ж 1997 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

И.В.Евсее

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В условиях раззития современной технологии, ядерной энергетики, уровня урбанизации возрастает вероятность влияния экстремальных факторов, таких как ионизирующее и СВЧ-излучение, токсические вещества, промышленные аллергены, стресс на значительные контингента населения. Встает проблема проведения опенки состояния здоровья людей, подвергшихся воздействию неблагоприятных факторов в плане опенки риска развития патологических состояний.

За сохранение антигенной и структурной целостности организма отвечает иммунная система /Петров Р.В., 1982; ßarnei , 1969/. В организме лим&оиднне клетки всегда находятся в рабочем состоянии и определенный уровень их активации является нормальным состоянием иммунной системы /Петров Р.В./. Благодаря исследования!.! лимфоцитов, накоплены многочисленные факты о том, что патологические процессы сопряжены с повреждением и гибелью одних, активацией и пролиферацией других типов клеток, т.е. как с гипофункцией, так и с гиперфункцией иммунной системы, либо отдельных ее звеньев.

В ответ на действие внепних и внутренних раздражителей организм отвечет комплексом не специфических реакций /стресс-реакций/, имеющих адаптационный характер /Селье, i960/. Возникновение стресс-реакции происходит не только в результате экстремальных воздействий чрезвычайных раздражителей, но и при. длительном действии слабых раздражителей /Горизонтов и др., 1983/. Неспецифическая активация иммунной системы отмечается при действии малых доз ионизирующей радиации /Кузин, 1977/'. Стимуляция еялунного ответа лимфоцитов специфическим антигеном приводит не только к активации антиген-чувствительных клеток, но и к неспецифической активации клеток других клонов за счет выделяемых цитокинов /Петров Р.В., 1994; Роит, 1991/.

Воздействия промышленных аллергенов в концентрациях, не превышающих предельно допустимых значений, могут приводить как к развертыванию гпперэргической /аллергической/ реации, так и к адаптации /Адо, 1976/. Если изучению аллергических реакций посвящено большое количество работ, то'вопросы адаптации к аллергенам и сенсибилизации организма в клинически невыраженной форме остались малоизученными.

Нельзя упускать из внимания то, что кроме экстремальных факторов иммунологические сдвиги вызывают стрессы, хронические заболевания. Исследования действия ионизирующего излучения на больных хроническими заболеваниями такяе не проводились.

В описании динамики изменений лимфоцитов периферической крови-в ответ на действие экстремальных факторов и в чрезвычайных ситуациях преобладают морфометрические методы и иммунологический анализ природы мембранных рецепторов. Достаточное внимание уделялось исследованиям иммуногенеза и патогенеза на клеточном уровне с использованием биофизических методов. В то же время действие экстремальных факторов малой интенсивности на лимфоциты периферической крови люминесцентными методами с использованием интеркалирующих красителей практически не изучалось.

Цель работы - выявление изменений функционального состояния лимфоцитов периферической крови в результате воздействия не специфических /ионизирующая радиация/ и специфических /промышленный аллерген/ воздействий в малых дозах.

Задачи работы:

- изучить влияние малых доз ионизирующей радиации на интенсивность люминесценции лимфоцитов крови здоровых людей и больных хроническими заболеваниями яедудочно-кишечного тракта и гинекологическими заболеваниями;

- сопоставить результаты люминесцентного анализа лимфоцитов крови обследуемых людей с данными, полученными при облучении и стрессировании лабораторных животных;

- изучить влияние промышленного аллергена на интенсивность ' люминесценции окрашенных акридиновым оранжевым лимфоцитов крови

работников аллергоопасной профессии и разработать подходы для выявления сенсибилизации организма ¿Л уИго .

Научная новизна. Получены новые данные об изменении функционального состояния лимфоцитов периферической крови в результате воздействия малых доз ионизирующей радиации и промышленного аллергена.

Впервые показано, что действие малых доз ионизирующей ради ации приводит к повышению матричной активности хроматина и уров ня РНК в лимфоцитах крови здоровых лиц; приближении исследуемых величин у больных хроническими заболеваниями нелудочно-кикечно-

го тракта и гинекологических больных с гистологически невыяв-леиными элементами клеточной пролиферации и дисплазии к значениям интенсивности люминесценции лимфоцитов крови здоровых людей контрольной группы; увеличении отклонений от нормы данных характеристик у больных хроническими гастритами, язвенной болезнью лелудка, полипами шейки матки с элементами пролиферации и дисплазии эпителия к доброкачественными опухолями матки.

Результаты исследовании мембранных иммуноглобулиновых рецепторов лимфоцитов позволили сделать вквод о достоверном снижении количества 1д&"*В-лимфоцитов в крови людей, облученных в дозе 0,05 Гр и Еыше.

Впервые предложен метод оценки состояния хроматина лимфоцитов, относящихся к различным субпопуляциям, в мазках /авторское свидетельство № 1732221/, который может оказаться полезным при формировании групп лиц с повышенным риском возникновения онкологических заболеваний.

Установлено, что продолжительный контакт с промышленным аллергеном монет приводить к сенсибилизации организма, характеризующейся увеличением интенсивности люминесценции лимфоцитов крови по сравнению с контролем.

Впервые люминесцентным методом показана возможность выявлять специфическую сенсибилизацию организма к протшшленному аллергену ¿п тгЦго , что расширяет возможности диагностики сенсибилизации организма на доклинических стадиях аллергических заболеваний.

Практическое значение -работы. Определение значений интенсивности люминесценции лимфоцитов в области 640 нм и 530 нм по сравнению с определением параметра <?С , равного отношению этих величин, позволяет повысить точность определения отклонений в системе иммунитета на 33-65 %.

Выявленные благодаря оптимизации методики эксперимента половые и возрастные отличия в значениях и 1640 окрашенных акридиновым оранжевым лимфоцитов /выше у лиц ненекого пола во всех возрастных группах/ также способствуют более точному диагностированию функциональных отклонений в иммунной системе.

Полученные результаты способствуют углублению представлений о реакциях организма в ответ на действие неспецифических /малые дозы ионизирующей радиации/ и специфических /промышлен-

ный аллерген/ экстремальных факторов.

Данные люминесцентного анализа лимфоцитов открывают новые возможности в контроле за лечением ряда хронических заболеваний к легли в основу разработанного в НИК онкологии и медицинской радиологии комплексного подхода для формирования групп повышенного риска возникновения злокачественных опухолей.

Выявление снижения количества З^В^-лимфоцитов в крови особенно важно при оценке ущерба, нанесенного здоровью людей, пострадавших в результате воздействия малых доз ионизирующей радиации, в том числе в результате аварии на Чернобыльской АЭС.

Результаты по моделированию иммунной реакции ¿а ггИго могут оказаться полезными в ранней диагностике аллергических заболеваний /включая доклинические формы/.

На официальную защиту выдвинуты следующие основные положения :

1. Обследование лиц, находящихся в состоянии хронического стресса /больных хроническими гнойно-воспалительными заболеваниями, астено-невротическим синдромом или синдромом хронической усталости и иммунной дисфункции, злокачественными новообразованиями/ продемонстрировало подавление матричной активности хроматина и снияение уровня РНК в лимфоцитах периферической крови.

2. Воздействие малых доз ионизирующей радиации вызывало неспецифическую активацию лимфоцитов крови здоровых людей и интактных животных, проявляющуюся в увеличении Гс^ и ^¿д окрасе иных акридиновым орашевым /АО/ лимфоцитов, такке как и моделирование стресса сп 1Г1Г0 и ¿п иНго у интактных лабораторных яивотных.

3. Обследование больных хроническими гастритами без дисплазии и пролиферации эпителия выявило активацию лимфоцитов и наличие резистентности по отношению к малым дозам ионизирующей радиации. Обследование больных хроническими гастритами и язвенной болезнью нелудка с гистологически выявленными элементами дисплазии и пролиферации позволило выделить среди них две группы: с повышением и со снижением функциональной активности лимфоцитов. Действие малых доз радиации усилйвало напряженность в системе иммунитета.

4. Инкубация крови сенсибилизированного организма /человека и лабораторных животных/ со специфическим аллергеном приводила к

достоверному повышению интенсивности люминесценции окрашенных АО лимфоцитов з области 640 нм на 38 к более $ /Р<0,001/. Усовершенствованный метод люминесцентного анализа лимфоцитов крови в мазках позволяет определять большее количество параметров /матричную активность хроматина лимфоцитов, в том числе относящихся к различным субпопуляциям и параллельно проводить их количественный подсчет; содержание РНК; выявлять сенсибилизацию к исследуемктл аллергенам/ и может быть рекомендован как один из объективных тестов опенки состояния организма в экстремаль шх условиях.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на Республиканской школе-семинаре "Актуальные проблемы радиационной медицины" /Алушта, 19Р7/; Совместном заседании Ученого Совета Белорусского санитарно-гигиенического института и МЗ БССР /Минск, 1987/; Ш съезде онкологов БССР /Линек, 1991/; Международном симпозиуме "BiontedicaC Optics Europe , 93" /Будапешт, IS93/; Расширенном заседании проблемной комиссии Научно-технического совета АША медико-биологических проблем Севера /Архангельск, 1996/; Заседании ме«отделенческой конГеренпик НИИ онкологии и медицинской радиологии МЗ РБ /Минск, 1996/.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ /в тог.-; числе одно авторское свидетельство об изобретении/.

Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав собственных исследований, заключения, вызодоз и списка литературы, включающего 129 отечественных и 64 иностранных источников. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 25 рисунками.

СОДЗРКАЮ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, научная новизна, сформулирована цель исследования, перечислены основные защищаемые положения, указана практическая значимость работы.

В первой главе дан обзор литературных данных по проблемам регуляции иммунного ответа, методам оценки состояния иммунной системы, в особенности функционального состояния иммукокомпе-тентных клеток /ККК/. Значительное.место в нем отведено анализу работ по использованию флуоресцентных зондов в исследовании

структурно-функционального состояния лимфоцитов. Описаны свойства АО взаимодействовать с двусотгралъными нуклеиновыми кислотами по механизму интеркаляции, испуская свет при возбуждении в области 530 нм, а также связываться с односпиральными нуклеиновыми кислотами /НК/, находясь при этом в дшерной форме и испуская излучение с максимумом 640 нм /Карнаухов, 1878\Hiffdn-а'.ег , К1дСег . 1969/. Обсуждена зависимость между связыванием АО стимулированными митогенами лимфоцитами и уровнем реакции бласттрансформации. Рассмотрены корреляционные связи между соотношением РНК/ДНК и'спонтанным синтезом иммуноглобулинов, флуоресценцией ДНК и размерами ИКК. Обсуждены возможные механизмы активации и апоптоза клеток лимфоидного ряда.

Во второй главе представлены материалы и методы исследования. В качестве объекта исследования использовались лимфоциты периферической крови здоровых детей и взрослых, больных хроническими гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области, СХУ, хроническими заболеваниями ЗЕКТ, женщин, больных гинекологическими заболеваниями, проживающих в Минской области /контрольная группа/, и в Гомельской области, в районах с повышенным фоном ионизируюсь й радиации, а также здоровых мужчин работников Полоцкого завода стекловолокна, контактирующих по роду своей деятельности с промышленным аллергеном дициандиамид-формальдегидной смолой /ДЦУ/. Всего 544 чел.

Экспериментальные исследования по изучению действия экстремальных факторов проведены на крысах-самцах линии Вистар весом 180-200 г в озрасте 15-1Е месяцев /контрольная группа -8, облученные в дозе 0,25 Гр на установке У17 - 6, облученные, подвергнувшиеся действию двигательного болевого стресса - 6 , стрессированные - 6/. Облученные ¿а. у ¿¿го тимоциты выделены из селезенки 6 животных.

Метод определения специфической сенсибилизации организма к промышленному аллергену разрабатывался на самцах морских свинок в возрасте 20 - 24 месяцев.С целью экспериментальной индукции аллергической реакции морским свинкам весом 350-400 г внутрикожно вводили умеренный химический аллерген ДНУ в дозах I, 5, 20, 25, 40 мкг /по 8 животных в каждой группе/ и ферментный препарат растительного происхождения ц-эрвилазу в дозе 100 мкг. Контроль - 7 или 8 животных. Все эксперименты

на животных проводились в зимний период времени.

Мазки крови фиксировали и окрашивали АО по стандартной методике /Зеленин и др., 1982; Карнаухов, 1978; RigLer , 1966/ с некоторыми модификациями: с целью предотвращения неспеиифиче-ской сорбции и агрегации молекул красителя концентрация АО была уменьшена до 5-Ю-® М; окрашивание проводили при температуре 20°С, при которой отношение сигнал/шум было наибольшим.

Для выявления лимфоцитов, несущих иымунсглобулиновые рецепторы, и определения связывания бромистого этидия /БЭ/ на фиксированные мазки наносили антитела /АТ/ к иммуноглобулинам /1д/-человека, или к IgG, меченные флуоресиеинизотиоцианатом /ФИТЦ/, двазды отмывали физиологическим раствором, окрашивали 10"^ М раствором БЭ и измеряли интенсивность люминесценции при 615 нм дифференцированно: у 1д+В-лимфоцитов, связывающих меченные ФИТЦ AT, и у 1д"Т-лимфоцитов, не связывающих AT.

После окрашивания мазки промывали в дистиллированной воде и исследовали на люминесцентном микроскопе ЖМАМ-И2, снабженном фотометрической насадкой 5МЭЛ-1А. Для этого под зонд насадки микроскопа подводили лимфоциты и измеряли интенсивность люминесценции качдого из гак в области 530 нм и 640 нм при окраске АО и в области 615 нм при окраске БЗ. Рассчитывали значения средних арифметических по интенсивности люминесценции не менее чем 20 клеток. Возбуждение люминесценции осуществляли ртутной дуговой лампой ДРШ-250 с длиной волны излучения 436 нм. Диаметр фотометрируемого участка равен 15 мкм. Все измерения скорректированы на спектральную чувствительность прибора путем нормирования полученных величин интенсивности люминесценции по отношению к соответствующим значения!«: стандартных лгаминетирующих пластинок.

Реакция специфической микропрепипитации /РСМП/, основанная на фотометрическом определении комплексов микропреципитата, проводилась по методике, разработанной Дуевой и соавторами в

1976 г.. Реакцию специфической агломерации лейкоцитов /РСАЛ/ проводили в соответствии с методикой, предложенной Сосонкиным в 1969 году.

Моделирование иммунной реакции и стресса in, Triiro проводили путем добавления к 0,025 мл гепаринизированнбй крови 0,0025 мл 0,01 % раствора соответствующего аллергена, 2-Ю-6 М.

раствора гидрокортизон ацетата, либо физиологического раствора /контроль/. После этого пробы помещались в термостат при 37°С на 2 часа.

Статистическую обработку данных и оценку достоверности результатов проводили методами вариационной статистики /Рокицкий, 1967/. Данные представляли в виде средней арифметической /X/ и ее средней ошибки /s,,/. Достоверность различий ме.--ду сравнивае-

Л

мыми величинами оценивали с помощью i-критерия Стьюдента. За достоверные принимали различия на уровне значимости 95 % при Р^ 0,05.

В третьей главе представлены результаты исследования влияния малых доз ионизирующей радиации на функциональные характеристики лимфоцитов крови, а такяе их обсуждение.

В первых двух разделах рассмотрены результаты, обосновывающие выбор оптимальных условий окрашивания лимфоцитов iri sita. растворами АО и БЭ; влияние гепарина на связывание АО ядерным хроматином.

В третьем разделе показано, что величины интенсивности люминесценции окрашенных АО лимфоцитов в области 530 нм /1^/ и 640 нм ЗД°Р0ВЫХ Детей 11 взрослых варьируют в зависимости

от пола и возраста; причем для лиц не некого пола характерны более высокие значения интенсивности люминесценции лимфоцитов во всех возрастных группах /Таблица I/. Данные отличия объясняются как действием половых горлонов /Амброзиус и др., 1981/, так и более высокой иммунореактивностью женского организма по сравнению с мужским Д1акинодан и Юнис, 1980/, сцеплением с Х-хромосомой ряда генов, контролирующих активность иммунной системы /Smith, Wd.rn.er , 1989/. Кроме того, у 29 детей с достоверно отличающимися величинами интенсивности лшинесценции лимфоцитов от значений, найденных для здоровых детей соответствующего пола и возраста, обнаружены аномальные клинико-гематологические показатели, связанные с наличием инфекционного заболевания, протекающего в скрытой форле.

В четвертом разделе показано, что у больных со сниженной функцией иммунитета шмунорезистентность женщин по отношению к действию стресс-факторов была выше, чем у мужчин: у больных хроническими гнойно-воспалительными заболеваниями мужчин выявлено снижение Ir™ и 1б40 на 60+8 /Р^ 0,001/ и 63+9 % /Р-=0,01/ по '

Таблица I

Средние значения интенсивности окрашенных АО лимфоцитов периферической крови здоровых детей и взрослых в области 530 нм и 640 нм /1+3у/.

Возрастная Интенсивность люминесценции

группа, лица мужского пола .тага венского пола годы -:-

1530,отн.ед. 1640,отн.ед. 1520,отн.ед. 1В40,отн.ед.

3-6 7 - 10 II - 15 20 - 39

40 - 59

более 00

24,36+1,52

20,00+1,01

23,10+1,05

25,68+ 2,60

26,48+1,30

30,35+2,02

2,42+0,30 1,89+0,38 1,50+0,10 2,18+0,34 2,89^0,46 3,02+0,30

25, ОС+0,92 25,25+1,71 29,75+1,49 30,03+1,24 34,13+1,40 34,36+1,06

2,58+0,50 2,70+0,96 2,30+0,98 2,49+0,10 2,52+0,15 3,00+0,14

сравнению с контролем соответственно; у женщин - на 39+10 % /Р < 0,02/ и 64+6 % /Р< 0,001/. У больных астено-невротическим синдромом эти величины были ниже нормы на 21+5 £ и 13+4 % у мужчин; у женщин с таким ке диагнозом имело место лишь понижение /на 18+12 % /. При этом значения параметра о1 / оС-1640/153д / были в большинстве случаев нормальными.

В пятом разделе исследовано влияние облучения в дозах 0,10-0,25 Гр на здоровых людей и (Зольных хроническими заболеваниями желудочно-кишечного тракта /1КТ/ Установлено, что воздействие малых доз ионизирующей радиации вызывает неспецифическую активацию лимфоцитов периферической крови здоровых людей, характеризующуюся повышением матричной активности хроматина и уровнем РНК в лимфоцитах, повышением в крови лимфоцитов с увеличенными размерами /до 10-12 мкм/, деконденсированным хроматином и широким ободком цитоплазмы. Наиболее радиочувствительными были 20-39-летние мужчины: у облученных здоровых мужчин этого возраста выше на 23,9+12,3 %, чем у здоровых необлученных мужчин; 1^0 выше на 79,8+20,4 % /Р-е0,01/. Менее радиочувствительными были мужчины 40-59 лет Д530 вние по сравнению с контролем на 23,2+11,6 1640 - на 6 2,6+34,4 Р<0,05/. У облученных здоровых 20-39-летних женщин значения практически не отличались от таковых, каиденннх для 20-39-летних женщин из контрольной группы, в то время как значения интенсивности люминесценции в области 640 нм были вше на 63,1+11,9 % /Р-с 0,01/. Наиболее радиорезистентными оказались женщины 40-59 лет /1530 выше на 16,2+6,7 % по сравнению с контролем; 1б40 - на 19,8+ 7,6 % /. Наши наблюдения определенно согласуются с литературными данными /Ярмоненко, 1988/, согласно которым мужчины более радиочувствительны, чем женщины, и что у лиц молодого возраста радиочувствительность более высокая.

Что касается больных хроническими гастритами, не сопровождающимися дисплазией и пролиферацией клеточных элементов слизистой оболочки желудка, то у них отмечалось повышение средне-групповых значений по сравнению с нормой /здоровые, контрольная группа/, менее выраженное у больных из районов с повышенным фоном ионизирующей радиации /не превышали соответству-щих величин, характерных для здоровых лиц, подвергшихся действию малых доз, а в ряде случаев приближались к норме, Рис.1/.

Рис. I. Значения интенсивности люминесценции в области 640 ил окрашенных АО лимфоцитов периферической крови мужчин в возрасте 20-39 лет: а - здоровых; б - больных хроническими гастритами без дисплазии и пролиферации эпителия; в и г - больных хроническими гастритами и язвенной болезнью желудка, сопровождающимися дисплазией и пролиферацией эпителия с величинами выше и нике нормы соответственно; П - контрольной группы; £3 - подвергнувшихся действию мрлых доз радиации.

При этом у больных хроническими гастритами без дисплазии, проживающих в районах с повышенным радиационным фоном, отклонения от нормы клинико-гематологических показателей отмечаются в меньшем числе случаев, чем у больных контрольной группы. Сделан вывод, что больше гастритами без дисплазии и пролиферации относительно резистентны к действию облучения в малых дозах.

Обследование большие язвенной болезнью яелудка и хроническими гастритш.;и, сопровождающимися дкеплазией и пролиферацией эпителия, позволило выделить среди них две группы: с повышенными и с пониженными по сравнению с нотой значениями интенсивности люминесценции в области 640 ны. Об увеличении активности иммунокомпетентных клеток у больных с высоким содержанием РНК в лимфоцитах свидетельствует также повышенное содержание в крови широкоплазменных лимфоцитов с деконденсированным хроматином. В свою очередь, отражением подавления синтетических процессов в лимфоцитах крови больных со сниженными величинами 1640, а следовательно, с низким уровнем РНК, является наличие в крови лимфоцитов с малым радиусом, низким ядерно-цитоплазма-тичееккм индексом и деконденсированным хроматином. У проживающих в районах с повышенным радиационным фоном больных амплитуда отклонений от нормы была выше, чем у больных гастритами с дисплазией из контрольной группы. Это свидетельствует о повышенной чувствительности больных хроническими гастритами с дисплазией к стрессорным воздействиям, таким как действие малых доз ионизирующей радиации. Усиление напряженности в системе иммунитета характеризуется не только значительным увеличением /активация/ и снижением интенсивности люминесценции лимфонитов по сравнению с контролем /хронический стресс/, но и параллельным повышением и енннением в крови относительного и абсолютного содержания лимфоцитов соответственно /Горизонтов и др., 1883; Селье, 1961/.

У мужчин, больных раком келудка 1-П стадии, реакция активации была более напряженной: 1530 составляла 43,05+2,55 отн. ед., что на 68+14 % выше 1530 лимфоцитов крови здоровых 20-39-летних муячин контрольной группы, а 16'40 была равной 3,90+1,05 отн.ед.; выше нормы на 77+48 %. В то же время на 1У стадии злокачественного роста имело место существенное снижение интенсивности люминесценции окрашенных АО лимфоцитов: 15ол равна

8,50+2,20 отн.ед. /в 3 раза ниже, чем у здоровых мужчин 20-39 лет/, а Т64о была равной 1,49+0,25 отн.ед. /ниже нормы на 32+ 15 % /. '

В шестом разделе представлены результаты обследования женщин, больных гинекологическими заболевания!.™. Действие малых доз ионизирующей радиации на больных эрозиями шейки матки без метаплазии приводило к увеличению связывания АО с ДНК и РНК лимфоцитов: более выраженному, чем у больных эрозиями из контрольной группы, но менее выраженному, чем у здоровых облученных женщин /Рис. 2/. Очевидно, здороЕке женщины менее резистентны по отношению к действию малых доз радиации, чем больше эрозией шейки матки. У женщин, больных полипами шейки матки, сопровождающимися дисплазией и пролиферацией эпителия, отмечались отклонения значений интенсивности люминесценции лимфоцитов от нормы как в сторону увеличения /необученные больные/, так и в сторону снижения /облученные/. У больных доброкачественными опухолями матки из районов с повышенным фоном ионизирующей радиации реакция активации была выражена в значительно большей степени, чем у больных с таким же диагнозом из контрольной группы.

Наличие раковой опухоли /рак шейки матки Ш-1У стадии/ приводило к уменьшению связывания АО хроматином в 2 раза и падению содержания РНК в лимфоцитах в 2,3 раза по сравнению со здоровыми 20-39-летними женщинами. Отличия достоверны, Р<0,01.

В седьмом разделе описаны результаты экспериментов по изучению действия малых доз ионизирующей радиации на лабораторных животных. При облучении в суммарной дозе 0,25 Гр у крыс отмечались следующие изменения в популяционном составе лимфоцитов периферической крови: у большей части клеток имело место возрастание Херц и 1£4о; У некоторых клеток - снижение 15^, карио-пикноз, нарушение структурной целостности мембраны, регистрируемое по увеличению ее проницаемости для ББ. Сходные изменения наблюдались в ходе развития двигательного болевого стресса. Отсутствие изменений спектральных характеристик лимфоцитов при облучении иг у^го в дозах ниже 10 Гр свидетельствовало об участии в реакции на малые дозы ионизирующей радиации гипофиз-адреналовой системы /Гаркави и др., 1990; Ярыоненко, 1588/. Моделирование стресса иг у Ого путем инкубации крови с гидрокортизон ацетатом в концентрации 2-Ю-7 М подтвердило данный

1640*

Рис. 2. Значения интенсивности люминесценции в области 640 нм окрашенных АО лимфоцитов периферической крови женщин: а - здоровых в возрасте 20-39 лет; б - больных эрозией шейки матки без дисплазии эпителия; в - больных полипами шейки матки с дисплазией и пролиферацией эпителия; г - больных доброкачественными опухолями матки; □ - контрольной группы; Е22 - подвергнувшихся действию малых доз ионизирующей радиации.

вывод. Стрессирование облученных крыс приводило к противоположному эффекту - существенному снижению и 154(3. Если у облученных нестрессированных животных в среднем отмечалось понижение Г^эд на 7+6 % и повышение на 33+9 % по сравнению с контролем; у стрессированных необученных крыс выявлена тенденция к повышению данных величин /на 52+7 % /Р^: 0,02/ и 26+20 % /Р<0,05/ соответственно/, то у стрессированных облученных животных Х^до оказалась ниже, чем в контрольной группе животных на 31+8 % /Р<0,05/, а 1640 - на 46+10%.

Восьмой раздел посвящен определению отклонений функциональной активности лимфоцитов той или иной субпопудяшш /Тили В-клетки/. Дифференциальное определение матричной активности хроматина лимфоцитов проводилось путем контрастирования мембранных структур лшинесцирующими АТ против иммуноглобулинов и определения интенсивности окрашенного бромистым этидием ядерного хроматина отдельно у Гд"^-лимфоцитов и 1д~-клеток. В ряде случаев стойкое снижение интенсивности люминесценции лимфоцитов периферической крови больных хроническими заболеваниями £КТ явилось основанием для проведения детального обследования, в ходе которого были выявлены злокачественные новообразования. Показана целесообразность использования данного подхода в контроле за лечением и уточнении диагноза. Разработанный способ позволяет параллельно проводить количественный подсчет клеток, относящихся к той или иной субпопуляции, в зависимости от используемых антител. На практике этот подход был использован для определения связывания антител 1д&- рецепторами В-лимфоцитов /девятый раздел/.

В результате обследования людей, облученных дозами радиации з пределах от 0,030 до 0,350 Гр, выявлено снижение в крови лимфоцитов, тлеющих на мембранах иммуноглобулиновые детерминанты класса &. Отличия, в содержании 1дС^-лимфоцитов в крови лиц постоянно проживающих в районах с повышенным радиационным фоном или имеющих инкорпорированные радионуклиды, по сравнению с контролем достоверны с вероятностью не менее 95 %, начиная с дозы облучения 0,05 Гр. Так, в крови здоровых необлученных 2039-летних и 40-59-летних люден содержание 1д5-+-клеток составляет 5,28+0,60 % и 7,38+0,70 % соответственно. При облучении в дозе 0,030-0,049 Гр эти величины составляли 4,10+0,15 % и 5,03+

0,60 Л; в дозе 0,050-0,099 Гр - 3,75+0,40 % к 3,67+0,45 % у 20-39-летних и 40-59-летних лиц соответственно. Еще более низким содержание 1д(3-+-лимфоцктов было в крови у людей, облученных в дозе от 0,100 до 0,199 Гр /2,70+0,25 % у 20-39-летних и 2,67+0,30 р у 40-59-летних обследуемых/. Самим низким содержание лимфоцитов с поверхностными иммуноглобулина;.® класса & было у облученных в дозе от 0,200 до 0,350 Гр: 1,37+0,18 % у 20-39-летних и 2,17+0,28 /> у 40-59-летних.

Четвертая глава содержит результаты исследований влияния промышленного аллергена дппиаюшамидфощальдегкдной смолы /ДНУ/ на функциональные характеристики лимфоцитов. Анализ литературы показал, что начало иммунного ответа:пролиферативного к непро-лиферативного характеризуется усилением синтеза РНК в лимфоцитах /Anc/reejf e.d. , 1978; ßrdu/istein е.л. , 1976/. Изучение изменений интенсивности люминесценции окрашенных АО лимфоцитов в результате развития иммунной реакции ¿п тгго и Ln vitro выявило повышение Iq^q, а, следовательно, усиление биосинтеза РНК в лимфоцитах. Одновременно с увеличением интенсивности люминесценции при просмотре в микроскоп отмечались агломерация, адгезия и увеличение ободка цитоплазмы иммуноком-петентных меток. У животных с положительной реакцией на спецк-пифический аллерген ¿л vi-tro пшерчувствительность к исследуемому аллергену подтверждалась кожнкыи пробами и реакцией специфической агломерации лимфоцитов /РСАЛ/. В некоторых случаях после инкубации крови животных со специфическим аллергеном лимфоциты либо не отвечали изменением люминесцентных показателей, либо претерпевали цитолиз. Повышение синтеза РНК в лимфоцитах и цитолиз связаны с аллергизацией и с ограничением иммунологического процесса соответственно /Адо, IS8I; Ляшенко и др., 1988/.

Для количественной оценки сенсибилизации рассчитывали увеличение Ig^Q в опытных образцах по сравнению с контрольными /физиологический раствор/: У = ( Ion/IK - I) -ЮО %, где 10П -интенсивность люминесценции в области 640 нм после инкубации крови с исследуемым аллергеном, I - интенсивность люминесценции лимфоцитов после инкубации с физиологическим раствором. Результаты анализа свидетельствуют о статистически значимом увеличении интенсивности люминесценции /У/ после инкубации крови

со специфическим аллергеном ¿п, ^¿-¿го У сенсибилизированных кивотнь'х по сравнении с нееенеибилкзированннш. Выявлена корреляционная зависимость результатов люминесцентного анализа лим-фогпгтов и ноетого тестирования /коэффициент корреляции г = 0,767; ¿-критерий Стьюдента ¿=7,17; Р<0,01/, указывающая на высокое совпадение данных тестов.

При добавлении к образцам крови штакткнх лиц различных аллергенов /ДЕДУ, ЛНХБ, малеиновкй ангидрид/ лшаь в 43 £ случаев наблюдалось увеличение Х^ /в среднем на 23,67+?,59 верхняя гранила доверительного интервала равна 37,9 % при уровне значимости 99,9 % /. Исходя из этого мы полагаем, что в отсутствие изменения реактивности лимфоцитов по отношению к аллергену показатель У не должен превышать 37,9 %. В соответствии с этим положительной реакцией на аллерген /л ^¿¿го считалось увеличение по сравнению с контролем не менее чем на 38 %.

В 49 % случаев инкубация крови с промышленным аллергеном ШУ приводила к достоверному увеличению 16/;0 по сравнению с контролем. Статистически подтверждается достоверность различий ме;--ду группами сравнения сенсибилизированных и не сенсибилизированных лиц, как по уровню реакции специфической микропреципитации и люминесцентного анализа / /-критерий Стьюдента 4,67; Р<0,001/, так и по частоте выявления / г* =3,95; Р < 0,001/. Следовательно, наличие в крови обследуемых гуморальных антигаптенш/х АТ, а такие регистрация положительной люминесцентной реакции после воздействия специфического аллергена гл го свидетельствует о сенсибилизации организма в клинически невыраженной фоте.

Следует отметить, что реактивность лимфоцитов в ответ на стимуляцию аллергеном ¿п ^¿±го у обследуемых с положительной реакцией на аллерген возрастала со стажем работы на аллер-гоопасном производстве и составляла 124,2+48,3 % в группе работников со стажем менее I года; 150,6+77,5 % у лиц со стажем 1-4 года; 169,0+44,4 % у работающих от 4 до 10 лет и 227,1+ 68,3 % у работающих более 10 лет.

В заключении отмечалось, что люминесцентный анализ лилфо-цитов использует микроколичества крови, не требует процедур отмывки и выделения ИКК, характеризуется простотой пробоподго-товки /мазок/, которая может проводиться в любых условиях;

длительностью хранения клинического материала, а также позволяет определять большое число параметров: матричную активность хроматина лимфоцитов, в том числе относящихся к различным суб-популяццям; содержание РНК; количественный подсчет лимфоцитов в тех или иных субпопуляциях; выявлять сенсибилизацию к иссле-'дуемым аллергенам я, таким образом, проводить комплексную оценку состояния игл,лунной системы, он может быть рекомендован для выявления заболеваний на доклинических и донозологических стадиях, в скрининговых обследованиях, для формирования групп повышенного риска возникновения аллергических и онкологических заболеваний, а также при контроле за лечением. Результаты обследования здоровых людей, больных хроническими заболеваниями, подвергшихся действию экстремальных факторов, заслуживают внимания с точки зрения организации лечебно-профилактической работы, разработки эффективных средств индивидуальной защиты населения в чрезвычайных ситуациях и определения компенсации за ущерб, нанесенный здоровью.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствование методики окраски лимфоцитов периферической крови люминесцирующш красителем акридиновым оранжевым и оценки интенсивности лотлинесценшш в области 530 нм /1530/ и 640 нм /1;з4о/ позволило повысить инфорлативность и точность метода в выявлении отклонений функциональной активности лимфоцитов на 33-65 %.

2. При облучении малыми дозами ионизирующей радиации /0,10,25 Гр/ у людей наблюдается увеличение интенсивности люминесценции окрашенных акридиновым оранжевым лимфоцитов, выраженное в различной степени в зависимости от пола и возраста.

3. У облученных в дозе 0,1-0,25 Гр больных хроническими гинекологическими заболеваниями и заболеваниями нелудочно-ки-шечного тракта, не сопровождающимися дисплазией и пролиферацией клеточных элементов, величины интенсивности люминесценции лимфоцитов крови были повышены по сравнению с контролем, но в меньшей степени, чем у необлученных больных с тем же диагнозом.

4. У облученных в дозе 0,1-0,25 Гр больных хроническими гинекологически.® заболеваниями и хроническими заболеваниями желудочно-кишечного "-пакта, сопровождающимися дисплазией и

пролиферацией эпителия, амплитуда отклонений от нормы значений! интенсивности люминесценции лимфоцитов была выг:е, чем у не облученных больных с аналогичным диагнозом.

5. При облучении крыс в дозе 0,25 Гр установлено увеличение интенсивности лшинесценшш лимфоцитов з области 640 нм на S3+9 % /Р-г 0,05/ по сравнения с контролем. Стрессированке облученных животных приводит к противоположным результатам: сниже-

/Р-= 0,05/.

6. йжунизадия морских свинок промышленным аллергенов ди-пйандиаыидформальдегидной смолой /ДЦУ/ приводит к повышению интенсивности люминесценции лимфоцитов крови в области 640 нм на 8-10 иммунные лимфоциты реагируют ¿/г viéro на антигенное воздействие достоверным увеличением Ig^o по CP02*®11™ с контролем. Выявлена положительная корреляционная зависимость результатов люминесцентного анализа и кожного тестирования /г = 0,767,

7,17; Р^0,01/.

7. В 4S % случаев инкубация крови работников аллергоопас-ного производства со специфическим аллергеном ДЦУ приводит к достоверному увеличению I^g по сравнению с контролем. Выявленное статистически высокое совпадение результатов люминесцентного теста и реакции спешфгческой мккропрештитации свидетельствует об информативности исследований такого рода в выявлении факта аллергизацки.

8. В связи с тем, что люминесцентный анализ лимфоцитов крови в мазках позволяет определять большое число параметров: матричную активность хроматина лимфоцитов, в том числе относящихся к различным субпопуляциям /АС ís I73222I/; содержание РНК; проводить количественный подсчет лимфоцитов, относящихся к различным субпопуляциям; выявлять сенсибилизацию к исследуемым аллергенам, он может оказаться информативным для оценки дисбаланса функций кмтлунной системы в экстремальных условиях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние гепарина на структуру ядерного хроматина лимфоцитов // Лабораторное дело.-1989.I.-C.29-30.

2. Малые дозы радиации - стресс-фактор, действующий на лимфоциты периферической крови // Сборник статей "Актуальные проблемы онкологии и медицинской радиологии".-Минск, 1989.-С.221-225 /в соавт. с А.М.Горчаковым/.

3. Уменьшение связывания IgG- -рецепторами лимфоцитов как следствие действия малых доз ионизирующего излучения // Сборник статей "Актуальные проблемы онкологии и медицинской радиологии". -Минск, 1990.-С.49-53.

4. Информативность люминесцентного анализа лимфоцитов при оценке состояния здоровья // Лабораторное дело.-1990.12,-С. 35-40.

5. Люминесцентный анализ лимфоцитов периферической крови в формировании групп онкологического риска // Тез. докл. Третьего съезда онкологов БССР 11-12 декабря 1991 г.-Минск, 1991.-С. III-ИЗ /в соавт. с М.И.Ивановской/.

6. Способ выявления хроматина крови на мазках // АС Л I73222I &0I Н 1/28. Опубликовано 07.05.1992. Бюллетень № 17 /в соавт. с А.Е.Океановым/.

7. Люминесцентный анализ лимфоцитов периферической крови при обследовании людей, занятых на аллергоопасном производстве // Клиническая лабораторная диагностика.-1993.3.-С.39-44 /в соавт. с В.В.Шевляковым/.

8. Люминесцентный анализ лимфоцитов периферической крови больных с хроническими заболеваниями желудочно-кишечного тракта // Клиническая лабораторная диагностика.-1994.4.-C.I8-22.

9. ütminesce/ti am £ijs<s of fyffip&octftes о/ jxr/'pte-raH h/ood in definite on cf Organism's stsis/i /¿?/iy ti> spetijic ¿¡угле //SPIF Ргесег^слдя. - /g&j. -20J/; ßiipsy. - SS-Sf.