автореферат диссертации по информатике, вычислительной технике и управлению, 05.13.09, диссертация на тему:Влияние электромагнитного излучения крайне высоких частот с различными биотропными параметрами на респираторный взрыв нейтрофилов

, ц Я» «9«

На правах рукописи УДК 591.111.1:538.569

Якушина Валентина Сергеевна

ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ КРАЙНЕ ВЫСОКИХ ЧАСТОТ С РАЗЛИЧНЫМИ БИОТРОПНЫМИ ПАРАМЕТРАМИ НА РЕСПИРАТОРНЫЙ ВЗРЫВ НЕЙТРОФИЛОВ

05.13.09 - управление в медицинских и биологических системах (включая применение вычислительной техники)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ТУЛА 1998

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН и Тульском

государственном педагогическом Университете им. Л.Н.Толстого

Научные руководители:

доктор биологических наук Чемерис Н.К. кандидат физико-математических наук Гапеев А.Б.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Панфилов О.П. кандидат физико-математических наук Храмов Р.Н.

Ведущая организация:

заседании диссертационного совета д uw.47.id при Тульском государственном Университете по адресу: 300600, г. Тула, ул. Болдина,

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Тульского государствеяного Университета (300600, г. Тула, пр. Ленина, 92).

Филиал Института биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (ФИБХ)

РАН, г. Пущино

часов па

12В.

Автореферат разослан " ¿¿I ¡Я^ 1998 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 063.47.05 . доктор медицинских паук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Осознанный интерес к биологическому действию электромагнитных полей (ЭМП) определяется тем фактом, что ЭМП являются физическим фактором среды, который оказывает существенное влияние на живые организмы различного уровня организации. В настоящее время область биологических исследований, называемая электромагнитобиологией, связана с оценкой действия ЭМП ira биологические объекты, выявлением возможных сенсоров ЭМП и изучением биофизических механизмов действия ЭМП на живые системы. Особое место в электромашитобиологии занимают исследования биологических эффектов низкоинтенсивного электромагнитного излучения (ЭМИ) крайне высоких частот (КВЧ). Актуальность исследований изменений различных физиологических процессов в биологических системах под действием ЭМИ КВЧ низкой интенсивности связана с несколькими обстоятельствами:

- имеется много литературных данных об эффективном действии ЭМИ КВЧ на биологические объекты различного уровня организации [Девятков и др., 1981; Grundler et al., 1992]. В настоящее время биотропное влияние КВЧ-излучения не вызывает сомнений. Однако, накопленный экспериментальный материал, свидетельствующий о широком спектре биологических эффектов ЭМИ КВЧ, не дает ответа на вопрос о биофизических механизмах действия КВЧ-излучения;

- успешное применение ЭМИ КВЧ в медицинской практике для диагностики, лечения и профилактики большого числа заболеваний [Бессонов, 1997; Теппоне, 1997; Rojavin & Ziskiii, 1998] может рассматриваться как один из факторов, объясняющих интерес к исследованию биологических эффектов ЭМИ КВЧ. КВЧ-терапия является новым методом воздействия на организм человека, основанном на использовании низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ. Следует отметить, что конкретные биофизические механизмы действия ЭМИ КВЧ на биологические объекты изучены недостаточно для объяснения ряда эффектов КВЧ-терапии.

Одним из основных вопросов при исследовании действия ЭМИ КВЧ на живые системы является вопрос о сенсоре и механизмах рецепции излучения. В качестве возможных мишеней рассматриваются биологические мембраны [Adey, 1986; Liburdy, 1985; Булгакова, 1996], ДНК [Belyaev et al., 1993], в качестве посредника действия излучения может выступать вода [Fesenko et al., 1995]. Накоплены данные, подтверждающие предположение о том, что ЭМИ КВЧ низкой интенсивности оказывает влияние на процессы, в которые вовлечены ионы Са2+ [Grundler et al., 1992; Walleczek, 1992; Гапеев и др., 1994]. Относительно биофизических механизмов действия низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ предложено несколько гипотез: гипотеза когерентных возбуждений и взаимодействий [Fröhlich, 1973; 1980; 1983], теория солитонов Давыдова [Давыдов, 1979], гипотеза об информационно-резонансном характере взаимодействия ЭМИ КВЧ с живыми

организмами [Девятков и др., 1991], концепция о влиянии ЭМИ КВЧ на биологическую систему на уровне Са2+~регулируемых процессов передачи внутриклеточных сигналов [Kaiser, 1994, 1995] и другие.

Цель и основные задачи исследования

Целью настоящей работы было изучение влияния ЭМИ КВЧ с различными биотропными параметрами на функциональную активность клеток иммунной системы - перитонеальных нейтрофилов мыши.

Исходя из цели работы были поставлены следующие задачи.

1) Изучить частотнозависимый характер ответа нейтрофилов на действие непрерывного и модулированного ЭМИ КВЧ.

2) Определить зависимость эффектов ЭМИ КВЧ на активность нейтрофилов от интенсивности излучения.

3) Провести сравнительный анализ особенностей действия непрерывного и модулированного ЭМИ КВЧ на интенсивность респираторного взрыва нейтрофилов.

4) Выяснить принципиальную возможность модификации эффектов непрерывного ЭМИ КВЧ при различных величинах магнитной индукции постоянного магнитного поля (ПМП).

5) Исследовать характер зависимости эффектов непрерывного ЭМИ КВЧ от величины магнитной индукции ПМП, при котором происходит облучение нейтрофилов.

Научная новизна и практическое значение работы

Установленные в работе особенности действия непрерывного и модулированного низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ на клетки иммунной системы -перитонеальные нейтрофилы мыши - вносят определенный вклад в решение вопроса о механизмах рецепции этого вида излучения. Обнаружена высокая чувствительность систем связанных биохимических реакций, вовлеченных в процесс генерации активных форм кислорода нейтрофилами при активации респираторного взрыва, к несущим и модулирующим частотам КВЧ-излучения.

Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о сильной зависимости эффектов непрерывного ЭМИ КВЧ от величины магнитной индукции ПМП, в условиях которого проводят облучение объекта, что открывает новые возможности для построения теории взаимодействия ЭМИ КВЧ с живыми системами.

Полученные результаты проведенной экспериментальной работы могут оказаться полезными в разработке научно-обоснованных методов КВЧ-терапии.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на Городской научной конференции молодых ученых (г. Пущино, 15-17 мая 1996 г.), на II Открытой городской конференции молодых ученых (г. Пущино, 23-25 апреля 1997 г.), на Всероссийской научной конференции "Физические проблемы экологии

(физическая экология)" (г. Москва, 23-27 июня 1997 г.), на I Международном симпозиуме "Фундаментальные науки и альтернативная медицина" (г. Пущино, 22-25 сентября 1997 г.), на Международном конгрессе "Медицинские технологии на рубеже веков" (г. Тула, 1997 г.), на III Пущинской конференции молодых ученых (г. Пущино, 27-30 апреля, 1998 г.), на Международном совещании "Электромагнитные поля. Биологическое действие и гигиеническое нормирование" (г. Москва, 18-22 мая 1998 г.), на XX ежегодном собрании Биоэлектромагнитного Общества (ВЕМв) (Сент-Питерсберг, Флорида, США, 7-11 июня 1998 г.), на расширенном заседании кафедры морфологии и физиологии человека и животных ТГПУ им. Л.Н.Толстого (г.Тула, 1998). По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего ссылок. Работа изложена на страницах, содержит 10 рисунков и 2 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена с использованием перитонеальных вызванных нейтрофилов мышей БРР-категории аугбредной линии ¡^МЯ!. Мыши были получены из вивария барьерного типа лаборатории линейных животных Филиала Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и акад. Ю.А. Овчинникова.

Выделение нейтрофилов

Перитонеальные нейтрофилы выделяли по известной методике [Сая^апоуа е1 а1., 1987] с некоторыми модификациями [Гапеев и др., 1996]. Выделенные клетки ресуспендировали в среде 199 и хранили при +4°С с постоянным перемешиванием. Нейтрофилы в суспензии составляли более 80% всех клеток.

Установка для воздействия на нейтрофилы ПМП и ЭМИ КВЧ

Источником ЭМИ КВЧ служил высокочастотный генератор сигналов Г4-141. Частоту излучения меняли в пределах 41.75-42.15 ГГц с шагом 50 МГц. Во всех проведенных экспериментах плотность потока поглощенной энергии (ПППЭ) излучения составляла 50 мкВт/см2. Модуляцию излучения проводили меандром с частотами 0.1-50 Гц. Для создания ПМП применяли систему, содержащую две пары катушек Гельмгольца диаметром 40 см. Величину магнитной индукции измеряли ферромагнитным зондом с точностью не хуже ±0.1 мкТл. Система катушек Гельмгольца ориентировалась с севера на юг и не содержала материалов, искажающих магнитное поле. Величину магнитной индукции меняли в пределах 0-117 мкТл.

Облучение нейтрофилов

Ячейки с клетками помещали в специальный держатель таким образом, чтобы площадь пространства, занимаемого ячейками, не превышала области

однородного магнитного потока, созданного катушками Гельмгольца. Нейтрофилы облучали в пластиковых ячейках (диаметр 10 мм, толщина стенок и дна 0.2-0,3 мм) с общим рабочим объемом 200 мкл. Плотность нейтрофилов в экспериментальной ячейке составляла в среднем 10б клеток/мл. Облучение проводили при комнатной температуре 19-22°С в дальней зоне желобкового излучателя (на расстоянии 400 мм от его излучающего торца) [Гапеев и др., 1996]. Из используемых в одном эксперименте 12 ячеек шесть экранировали от ЭМИ КВЧ специальным многослойным экраном, не искажающим магнитное поле и исключающим увеличение неоднородности электромагнитного поля в ближней зоне облучаемых ячеек. Облучение нейтрофилов проводили в течении 20 минут в присутствии в клеточной суспензии кальциевого ионофора А23187 (7.5-10 мкМ). В качестве контрольных использовали другие 6 ячеек, находящихся в аналогичных условиях с внесенным в клеточную суспензию нейтрофилов А23187, за исключением действия излучения. "Ложное" облучение осуществляли в аналогичных описанным выше условиях при всех включенных приборах, только мощность на выходе высокочастотного генератора отсутствовала.

После воздействия магнитного поля и ЭМИ КВЧ или "ложного" облучения опытные и контрольные ячейки помещали в хемилюминометр ХЛ111-4 для измерения интенсивности люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ-Л).

Измерение и анализ ХЛ-Л контрольных и облученных нейтрофшов

Продукцию активных форм кислорода (АФК) нейтрофилов при активации респираторного взрыва форболовым эфиром ФМА (1 мкМ) оценивали по ХЛ-Л, регистрируемой последовательно от 12 экспериментальных ячеек в условиях термостатирования при 37°С. Время опроса всех ячеек составляло 10 с. В течение первых 3 мин регистрировали интенсивность ХЛ-Л неактивированных клеток (спонтанная ХЛ-Л), затем в ячейки вносили ФМА и продолжали запись уровня ХЛ-Л активированных нейтрофилов в течении необходимого времени.

Суммарную продукцию АФК нейтрофилов оценивали пропорционально площади под кривой зависимости интенсивности ХЛ-Л от времени. За нулевой уровень принимали среднюю интенсивность спонтанной ХЛ-Л, за начало отсчета -момент подачи ФМА, и считали площадь под кривой за 5 мин. Для дальнейшего анализа усредняли полученные значения суммарной продукции АФК для контрольных и облученных нейтрофилов, а отличие контроля от опыта оценивали как разность продукции АФК в контроле и в опыте, нормированную к контролю и выраженную в процентах. Статистический анализ данных проводили по Ь критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Эффекты непрерывного ЭМИКВЧнизкой интенсивности на функциональную активность нейтрофилов

Известно, что воздействие ЭМИ КВЧ приводит к модификации иммунных реакций у человека и животных [Арзумов и др., 1997; Григорьев и др., 1997; Rojavin & Ziskin, 1998]. Выраженное иммуномодулирующее действие КВЧ-излучения проявляется в его способности изменять функциональную активность клеток иммунной системы.

С методической точки зрения нейтрофилы являются удобным объектом для исследования действия ЭМИ КВЧ. Изменения показателей присущих нейтрофилам физиологических реакций доступны для оценки влияния различных факторов. В нашей экспериментальной работе оценку влияния низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ вели по изменению продукции АФК клетками в процессе респираторного взрыва при совместном действии на нейтрофилы А23187 и ФМА. Известно, что А23187 повышает внутриклеточную концентрацию ионов кальция [Campbell & Hallet, 1983]. ФМА - аналог диацилглицерола - оказывает активирующее действие на протеинкиназу С, минуя рецепторный путь [Badwey & Karnovsky, 1986; Nishizuka, 1992]. При действии каждого из названных агентов на нейтрофилы развивается респираторный взрыв, сопровождающийся синтезом АФК. Однако, инициация респираторного взрыва при совместном действии А23187

и ФМА приводит к усилению клеточного ответа в несколько раз по сравнению с ответами при активации -нейтрофилов каждым из агентов отдельно. Показано, что такое увеличение продукции АФК происходит не аддитивным образом, а наблюдается синергический эффект. Нейтрофилы в модели совместного действия А23187 и ФМА оказываются чувствительными к действию низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ [Сафронова и др., 1997]. Мы выбрали концентрации А23187 7.5 - 10 мкМ, при которых в наших экспериментах наблюдалось стабильное ингибирование продукции АФК нейтрофилов при действии ЭМИ КВЧ.

На рис.1 представлены оригинальные записи интенсивности ХЛ-Л перитонеальных нейтрофилов мыши. Кривые 2 и 1 отражают интенсивность ХЛ-Л клеток, активированных ФМА на фоне кальциевого ионофора А23187 и

О I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Время, мин

Рис.1. Оригинальные записи интенсивности ХЛ-Л нейтрофилов, активированных ФМА (1 мкМ): 1 - интактные клетки, 2 и 3 - нейтрофилы, обработанные кальциевым ионофором А23187 (10 мкМ). 1 и 2 - необлученные клетки; 3 -облученные клетки (несущая частота 41.95 ГГц, ПППЭ 50 мкВт/см2).

при его отсутствии в клеточной суспензии, соответственно. Видно, что в присутствии кальциевого ионофора амплитуда ХЛ-Л ответа значительно выше, чем при действии форболового эфира на клетки, необработанные А23187. На рисунке также показана интенсивность ХЛ-Л облученных в присутствии А23187 нейтрофилов (41.95 ГГц, ПППЭ 50 мкВт/см2). Видно, что амплитуда ХЛ-Л ответа облученных клеток ниже, чем необлученных (сравнить 3 и 2), что соответствует ингибирующему действию КВЧ-излучения на продукцию АФК нейтрофилов.

Из неспецифических эффектов низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ наиболее существенными являются острорезонансные эффекты. Острорезонансный характер заключается в том, что биологический эффект ЭМИ КВЧ наблюдается в узких интервалах частот излучения. При определенных частотах наблюдается ответ биологической системы на облучение, при других - она остается индифферентной. В связи с этим обстоятельством одной из проблем при исследовании действия ЭМИ КВЧ являете« выбор конкретных несущих частот излучения. Принимая во внимание результаты ряда работ [Гапеев и др., 1994; Гапеев и др., 1996; Сафронова и др., 1997], мы проводили эксперименты, остановив свой выбор на диапазоне

Нами было проведено исследование зависимости эффекта ЭМИ КВЧ низкой интенсивности на продукцию АФК нейтрофилов от частоты излучения. Облучение нейтрофилов проводили в условиях непрерывной генерации при ПППЭ 50 мкВт/см2. Во всем исследуемом частотном диапазоне (41.75-42.15 ГГц) было обнаружено иншбирование продукции АФК клетками (рис.2). Средняя величина эффекта составила около 10%. При несущей частоте 41.95 ГГц наблюдали максимальное ингибирование продукции АФК - 24%. Анализируя представленные на рис.2 результаты, можно говорить об обнаруженном резонансноподобном

характере зависимости биологического эффекта от несущей частоты излучения.

Обнаруженный резонансный

характер зависимости эффекта от частоты ЭМИ КВЧ может свидетельствовать о том, что в нейтрофиле существуют мишени для действия низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ на уровне систем внутриклеточной сигнализации, вовлеченных в процесс генерации АФК нейтрофилами. По-видимому, эти системы является кальций-зависимыми, поскольку эффект КВЧ-излучения проявлялся только в присутствии

несущих частот от 41.75 до 42.15 ГГц.

Несущая частота, ГГц

Рис.2. Изменение продукции АФК нейтрофилов в зависимости от несущей частоты ЭМИ КВЧ (ПППЭ 50 мкВт/см2) при действии излучения на клетки в присутствии А23187 (-•-) и на интакт-ные клетки (-О-). Для каждой точки указано число независимых экспериментов, доверительный интервал рассчитан по критерию Стьюдента (р < 0.05).

кальциевого ионофора в высокой концентрации, а при действии на шгтакгные клетки (в нашем случае это нейтрофюш, в клеточную суспензию которых перед началом облучения не вносили А23187) КВЧ-излучение не было эффективным (рис.2). Эффективность КВЧ-излучения при действии на нейтрофилы в присутствии в клеточной суспензии А23187, обеспечивающего в концентрации 7.510 мкМ высокий и поддерживаемый уровень внутриклеточного свободного кальция [Сафронова и др., 1997], и отсутствие изменений в продукции ЛФК при облучении интактиых клеток могут свидетельствовать о том, что проявление эффекта ЭМИ КВЧ коррелирует с функциональным состоянием нейтрофилов. Полученные нами эффекты, по-видимому, обусловлены изменениями процессов клеточного метаболизма, вызванными действием А23187.

Зависимость эффектов низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ на функциональную активность

нейтрофилов от Ш1ПЭ

Неспецифический характер действия ЭМИ КВЧ заключается в его эффективности при низких значениях плотности потока энергии (ППЭ). Хорошо регистрируемые эффекты возникают, как правило, при ППЭ с величинами значительно ниже 10 мВт/см2. Зависимость эффектов от ППЭ носит пороговый характер: биологический объект откликается на действие ЭМИ КВЧ, начиная с некоторой величины ППЭ, и затем эффект слабо меняется с увеличением ППЭ на несколько порядков.

Для оценки роли энергетических параметров излучения в обнаруженном нами частотнозависимом эффекте была исследована зависимость величины эффекта от плотности потока поглощенной энергии (ПППЭ). Было показано, что изменение продукции АФК нейтрофилами при действии КВЧ-излучеиия с частотой 41.95 ГГц имеет S-образную зависимость от ПППЭ (табл. 1). Как видно из представленных данных, в диапазоне ПППЭ от 20 до 150 мкВт/см2 величина эффекта меняется слабо и в среднем составляет около 24%. Половина величины эффекта достигается при ПППЭ менее 1 мкВт/см2.

Таким образом, проявление эффекта ЭМИ КВЧ при низких значениях ПППЭ, пороговый характер зависимости величины эффекта от ПППЭ излучения и наличие узкой полосы эффективных несущих частот ЭМИ КВЧ, обнаруженные в нашей экспериментальной работе, могут рассматриваться как свидетельства неспецифического действия ЭМИ . КВЧ низкой интенсивности на функциональную активность нейтрофилов.

Таблица 1

Зависимость величины ингибирования ХЛ-Л нейтрофилов в синергической реакции А23187 и ФМА от плотности потока поглощенной энергии ЭМИ КВЧ.

ПППЭ, мкВт/см2 Ингибирование ХЛ-Л ± доверительный интервал*, % п**

0.007 1.8±6.0 12

0.08 4.8+6.1 6

0.64 14.8+8.1 14

3.9 17.8+8.9 10

19.0 23.7±8.3 18

53.0 24.3+7.6 15

104.0 20.3+4.5 13

146.0 27.8±9.1 12

* Доверительный интервал рассчитан по критерию Стьюдекта (р < 0.05).

** п - число независимых экспериментов.

II. Эффекты модулированного ЭМИ КВЧ на функциональную активность

нейтрофыюв

Экспериментальные и теоретические исследования, выполненные в последние годы в области электромагнитобиологии показывают, что модулированное ЭМИ КВЧ действует на биологические объекты более эффективно, чем непрерывное [Гапеев и др., 1994; Аёеу, 1986]. Необходимо учитывать и то обстоятельство, что живые организмы в естественных условиях находятся в окружении действующих на них сложных электромагнитных полей: чаще это импульсные и модулированные ЭМП. В связи с этим обстоятельством важным направлением является исследование действия на биологические системы именно таких полей. Экспериментально показано, что биологические объекты обладают высокой чувствительностью и избирательностью к действию как крайне высоких частот, так и низких (0-100 ГГц) [1аскмп, 1985]. Именно в этом низкочастотном диапазоне лежат характеристические частоты биохимических реакций, обеспечивающих жизнедеятельность биологических систем.

Возможно, если частота модуляции излучения будет близка к одной из характеристических частот какого-либо биохимического процесса в клетке, можно ожидать ответа клетки на действие модулированного излучения, отличающегося от ответа на действие непрерывного. Для проверки этого предположения провели следующие эксперименты. Нейгрофилы облучали при несущей частоте излучения 41.95 ГГц и с частотами модуляции 0.1-50 Гц. При действии излучения с частотами модуляции 0.5, 2, 4 и 8 Гц достоверно значимых изменений в продукции АФК нейтрофилов обнаружено не было. Однако, при частоте модуляции 1 Гц

наблюдали усиление физиологической активности клеток, проявляющееся в увелтении продукции АФК облученными нейтрофилами в сравнении с контрольными. Ингибирование продукции АФК происходило при облучении нейтрофилов с частотами модуляции 0.1, 16 и 50 Гц (рис.3).

0.1 1 10 Частота модуляции, Гц

Рис.3. Изменение продукции АФК нейтрофилов в зависимости от частоты модуляции амллитудно-модулированного ЭМИ КВЧ с фиксированной несущей частотой 41.95 ГГц.

к э

15 10 5 0 -5 -10 -15 -20 -25 41.7

41.8 41.9 42.0 42.1 Несущая частота, ГГц

42.2

Рис.4. Изменение продукции АФК нейтрофилов в зависимости от несущей частоты амллитудно-модулированного ЭМИ КВЧ с фиксированной частотой модуляции 1 Гц.

Точка НГ - эффект непрерывного излучения с несущей частотой 41.95 ГГц. Для каждой точки указано число независимых экспериментов, доверительный интервал рассчитан по критерию Стьюдента (р < 0.05).

Данные экспериментов показывают, что характер изменений продукции АФК нейтрофилами при действии на них модулированного излучения отличается от того, который наблюдали при облучении клеток в условиях непрерывной генерации (рис.2 и рис.3). Если при действии непрерывного излучения с частотой 41.95 ГГц было обнаружено ингибирование продукции АФК на 24%, то при действии модулированного излучения с частотой модуляции 1 Гц и несущей частотой излучения 41.95 ГГц, наблюдали активацию продукции АФК на 10%. То есть воздействие модулированным ЭМИ КВЧ приводит к смене направления и величины эффекта по сравнению с эффектом при непрерывном излучении.

Таким образом, определенные значения частоты модуляции в комбинации с несущей частотой могут по-разному изменять функциональную активность нейтрофилов: приводить к усилению или уменьшению продукции АФК или быть неэффективными, не изменять регистрируемый параметр физиологической реакции нейтрофилов.

Мы предположили, что эффективность КВЧ-излучения может зависеть как от частоты модуляции, так и от несущей частоты. Возможно, что существуют системы внутриклеточной сигнализации, включенные в процесс генерации АФК нейтрофилами, избирательно чувствительные к действию модулированного излучения не только с несущей частотой 41.95 ГГц. Нами была исследована

зависимость эффекта ЭМИ КВЧ на продукцию АФК от несущей частоты при фиксированной частоте модуляции 1 Гц. Обнаружена нелинейная зависимость величины эффекта от несущей частоты (рис,4). Установлены области частот 41.9 -42.05 ГГц, где наблюдалось усиление продукции АФК, и 41.8 - 41.9 ГГц, где происходило иншбирование. Далее было проверено, каким образом эффективность КВЧ-излученкя зависит от частоты модуляции, но при другой несущей частоте 41.85 ГГц. Частота 41.85 ГГц была выбрана из области частот, при которых отмечено снижение интенсивности ХЛ-Л. Оказалось, что величина эффекта нелинейно зависит от частоты модуляции (рис.5), как это было показано в экспериментах по исследованию действия модулированного излучения с несущей частотой 41.95 ГГц. Представленные на рис.4 и рис.5 зависимости биологического эффекта от частоты модуляции при фиксированных несущих частотах 41.95 и 41.85 ГГц, соответственно, принципиально различаются. В случае действия модулированного излучения с несущей частотой 41.95 ГГц в диапазоне частот модуляции выше 1 Гц происходит постепенная смена направления эффекта от усиления продукции АФК на 10% до ее ингибирования на 21% по сравнению с контролем. В случае же действия модулированного ЭМИ КВЧ с несущей частотой 41.85 ГГц наблюдается обратная тенденция: иншбирование продукции АФК на 16% при частоте модуляции 1 Гц сменяется ее усилением на 10% с ростом значения частоты модуляции.

Полученные данные указывают на высокую чувствительность и избирательность систем связанных биохимических реакций, участвующих в

процессе генерации АФК нейтрофилами при развитии респираторного взрыва, как к несущим, так и модулирующим частотам излучения. Различные величина и направление эффекта в зависимости от определенной комбинации несущей и модулирующей частот указывают на возможность управления функциями клеток путем действия низкоинтенсивным модулированным ЭМИ КВЧ. Мы полагаем, что модулированное ЭМИ КВЧ влияет на связанные системы кальций-зависимых ферментативных реакций, участвующих в активации респираторного взрыва.

Частота модуляции, Гц

Рис.5. Модификация продукции АФК нейтрофилов при действии амплитудно-модулированного ЭМИ КВЧ с несущей частотой 41.85 ГГц а зависимости от частоты модуляции.

III. Модифицирующее влияние постоянного магнитного поля на частотнозависимые эффекты низкоинтенсивного ЭА1И КВЧ

Биотропное действие таких физических параметров ЭМИ КВЧ как интенсивность и режим действующего излучения на функциональную активность клеток иммунной системы - нейтрофилов мыши - описано выше. Представленные экспериментальные данные по исследованию частотнозависимых эффектов непрерывного КВЧ-излучения получены, когда облучение клеток проводили в условиях постоянного магнитного поля с величиной магнитной индукции равной фоновой - около 50 мкТл. Мы предположили, что эффективность действия ЭМИ КВЧ может зависеть от величины магнитной индукции приложенного к объекту ПМП. Основанием для такого предположения послужили работы [Yost & Liburdy, 1992; Леднев, 1996] в которых показано, что эффект переменного магнитного поля зависит от величины постоянного магнитного поля. Кроме этого в пользу такого предположения свидетельствует то обстоятельство, что как и ЭМИ КВЧ, так и переменное магнитное поле влияют, как показано в ряде работ [Walleczek, 1992; Yost & Liburdy, 1992; Karabakhtsian et al., 1994; Markov & РШа, 1997; Сафронова и др., 1997] на кальций-зависимые процессы. Это может означать, что молекулярно-клеточные мишени для ЭМИ КВЧ и переменного магнитного поля могут быть сходными.

Для выяснения принципиальной возможности модификации частотнозависимых эффектов ЭМИ КВЧ при разных величинах магнитной индукции ПМП были проведены следующие эксперименты. Нейтрофилы облучали в условиях ПМП с увеличенным приблизительно в два раза по сравнению с фоновым значением магнитной индукции - 95 мкТл. Несущую частоту излучения изменяли в пределах 41.85 - 42.1 ГГц с шагом 50 МГц. Было обнаружено, что изменение величины магнитной индукции ПМП оказывает влияние на эффекты ЭМИ КВЧ, модифицируя их. На рис.6 представлены оригинальные записи интенсивности Xl-Л нейтрофилов. Кривые 2 и 3 отражают изменение интенсивности ХЛ-Л клеток в результате действия непрерывного КВЧ-излучения с частотами 41.95 ГГц и 42.0 ГГц, и величинами магнитной индукции ПМП 50 и 95 мкТл, в условиях которого проводили облучение. Кривая 1 на рисунке соответствует интенсивности ХЛ-Л контрольных клеток. Оригинальные записи приведены для частот ЭМИ КВЧ, при которых наблюдался максимальный эффект - ингибирование продукции АФК на 24% при частоте 41.95 ГГц и величине магнитной индукции 50 мкТл (кривая 2) и активация на 24% при частоте излучения 42.0 ГГц и величине магнитной индукции 95 мкТл (кривая 3).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Время, мин

Рис.6. Оригинальные записи интенсивности Х/1-Л нейтрофилов, предвари-телоно обработанных А23187, активированных ФМА (1 мкМ): 1 - необлученные клетки; 2 - клетки, облученные ЭМИ КВЧ с частотой 41.95 ГГц на фоне ПМП с магнитной индукцией 50 мкТл; 3 - клетки, облученные ЭМИ КВЧ с частотой 42.0 ГГц на фоне ПМП с магнитной индукцией 95 мкТл.

41.8 41.9 42.0 42.1 Частота, ГГц

Рис.7. Модификация продукции АФК нейтрофилов при действии ЭМИ КВЧ в условиях ПМП с величинами магнитной индукции 50 мкТл (-¥-) и 95 мкТл (-А -). Для каждой точки указано число независимых экспериментов, доверительный интервал рассчитан по критерию Стьюдента (р < 0.05). Заштрихованная область соответствует величине доверительного интервала (р < 0.05) для эффекта при ложном облучении.

На рис.7 представлены данные экспериментов по исследованию частотнозависимых эффектов КВЧ-излучения в условиях облучения нейтрофилов при ПМП с величиной магнитной индукции 95 мкТл. Было обнаружено:

- во всем исследуемом частотном диапазоне 41.85-42.10 ГГц активация продукции АФК нейтрофилов, в отличие от ингибирования, наблюдаемого при облучении клеток в условиях фонового постоянного магнитного поля;

- увеличение продукции АФК нейтрофилов имеет резонансноподобный характер, максимальное увеличение продукции АФК составило 24% при частоте ЭМИ КВЧ 42.0 ГГц.

Особенностями эффекта ЭМИ КВЧ в условиях повышенной величины магнитной индукции стали смена направления эффекта, а также сдвиг резонансной частоты.

Анализ результатов, представленных на рис.7, обращает внимание на тот факт, что в эффектах непрерывного ЭМИ КВЧ присутствуют две составляющие изменения ХЛ-Л исследуемых клеток: первая, независящая от частоты КВЧ-излучения, и вторая, частотнозависимая. Изменение первой компоненты при использованных значениях магнитной индукции ПМП (50 и 95 мкТл) составляет не более 10% от контроля. Изменение второй компоненты наблюдается в узких полосах несущих частот излучения и составляет в среднем 15% (превышение над величиной первой компоненты) или 24% от контроля.

Таким образом, полученные данные показывают, что двукратное увеличение величины магнитной индукции ПМП по сравнению с фоновой способно изменять метаболический статус нейтрофилов таким образом, что меняется направление эффекта ЭМИ КВЧ на противоположное и происходит сдвиг эффективной резонансной частоты.

Исследование действия ЭМИ КВЧ на функциональную активность нейтрофилов при фиксированных частотах излучения 41.95 ГГц и 42.0 ГГц показало, что эффект нелинейным образом зависит от величины магнитной индукции ПМП (рис.8). Нейтрофилы облучали при фиксированной частоте КВЧ-излучения 41.95 ГГц или 42.0 ГГц в комбинации с определенным значением величины магнитной индукции: 28.3 мкТл; 75.5 мкТл; 117.3 мкТл. Ни при одной из использованных комбинаций названных величины магнитной индукции и частоты ЭМИ КВЧ мы не обнаружили эффект, который бы достоверно отличался от эффекта, полученного при "ложном" облучении (рис.8).

В случае "нулевого" магнитного поля эффект ЭМИ КВЧ также достоверно не отличался от эффекта при "ложном" облучении (табл.2). То есть при компенсации магнитного поля ЭМИ КВЧ становится неэффективным.

Таким образом, достоверный эффект КВЧ-излучения был обнаружен только при облучении нейтрофилов в условиях ПМП с величинами магнитной индукции 50 мкТл и 95 мкТл (табл.2).

В качестве тестового воздействия для определения вызванных другими факторами изменений метаболического статуса нейтрофилов мы использовали форболовый эфир ФМА, активирующий протеинкиназу С (ПКС), минуя рецепторный путь. Активность ПКС взаимосвязана с метаболизмом некоторых вторичных посредников и ферментов внутриклеточных сигнальных систем. Так, ионы кальция значительно повышают сродство ПКС к диацилглицеролу. Интенсивность гидролиза фосфолипидов также изменяет степень активации ПКС. Существует отрицательная обратная связь от ПКС к фосфолипазе С, обеспечивающая снижение активности первого фермента, и положительная обратная связь от ПКС к фосфолипазе А2 и фосфолипазе Д, обеспечивающая повышение активности ПКС [Т^йкика, 1992]. При некотором уровне активации

Величина магнитной индукции ПМП, мкТл

Рис.8. Модификация продукции АФК нейтрофилов при действии ЭМИ КВЧ с фиксированными частотами 41.95 ГГц (-в-) и 42.0 ГГц (-0-) в условиях ПМП с задаваемыми величинами магнитной индукции. Для каждой точки указан доверительный интервал, рассчитанный по критерию Стьюдента (р < 0.05). Заштрихованная область соответствует величине доверительного интервала (р < 0.05) для эффекта при ложном облучении.

нейтрофила достигается определенное равновесие во вкладе рассмотренных сигнальных систем в активность ПКС. Магнитное поле может смещать равновесие внутриклеточных сигнальных систем в ту или иную сторону, модифицируя активность ПКС, что на уровне функциональной активности может отразиться в изменении продукции АФК нейтрофилами при респираторном взрыве.

При величине магнитной индукции ПМП, сравнимой с фоновой величиной магнитной индукции геомагнитного поля (50 мкТл), резонансное ингибирование продукции АФК нейтрофилов при действии ЭМИ КВЧ может быть обусловлено влиянием излучения на Са2+-зависимые системы внутриклеточной сигнализации. Как было показано, эффект проявлялся только при внесении в клеточную суспензию кальциевого ионофора А23187 в концентрациях 7.5 - 10 мкМ, обеспечивающего высокий поддерживаемый уровень внутриклеточного свободного кальция [Сафронова и др., 1997]. Возможно, что ЭМИ КВЧ изменяет концентрацию внутриклеточного свободного кальция или сродство ключевых ферментов к ионам кальция, тем самым изменяя активность Са2+-зависимых ферментов. Результатом этого является ингибирующий эффект ЭМИ КВЧ на фоне измененного исходного функционального состояния нейтрофила.

Таблица 2

Зависимость модификации продукции АФК нейтрофилов от частоты ЭМИ КВЧ при различных величинах магнитной индукции постоянного магнитного поля.

Величина магнитной индукции ПМП 0 мкТл 50 мкТл 95 мкТл

Частота, ГГц Модификация продукции АФК*** ± доверительный интервал*, % п** Ингибирование продукции АФК± доверительный интервал*, % п** Активация продукции АФК + доверительный интервал*, % п**

41.85 -2.3±7.8 17 -10.5+6.8 12 10.1+8.0 16

41.90 3.8±7.7 14 -12.1±5.7 И 9.6+8.0 26

41.95 3.4+7.7 18 -24.3+7.6 15 10.1±6.9 26

42.00 -4.9±7.1 19 -8.8+5.2 11 23.8+7.7 42

42.05 0.8±7.8 33 -9-7±7.5 13 11.0+7.5 24

42.10 -2.7±7.7 17 -12.0+6.5 16 7.8+7.7 23

* Доверительный интервал рассчитан по критерию Стыодента (р < 0.05). ** п •• число независимых экспериментов.

*** Положительной величине эффекта соответствует увеличение продукции АФК нейтрофилов при действии ЭМИ КВЧ, отрицательной - уменьшение.

При двукратном увеличении магнитной индукции ПМП по сравнению с фоновой меняется направление эффекта ЭМИ КВЧ и смещается резонансная частота. Опираясь на литературные данные можно предположить, что магнитное поле изменяет сродство Са2+ к Са2+-зависимым ферментам. Повышенное ПМП специфическим образом модифицирует активность ряда ключевых ферментов. На фоне измененного функционального статуса клетки за счет действия ПМП может1 стать более эффективной другая частота ЭМИ КВЧ, чем и объясняется незначительный сдвиг резонансной частоты эффекта.

В случае "нулевого" магнитного поля можно предположить, что за счет одновременного влияния на все катионы (Са2+, Mg2+, К+, Н4) со стороны магнитного поля, происходит стабилизация равновесия внутриклеточных сигнальных систем таким образом, что эффект ЭМИ КВЧ на этом фоне не проявляется.

Очевидно, что для решения вопроса о конкретных биофизических механизмах и мишенях действия ПМП и ЭМИ КВЧ требуются дальнейшие исследования.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что ответ клеток иммунной системы - нейтрофилов мыши - на действие ЭМИ КВЧ имеет резонансноподобный характер зависимости как от несущей, так и от модулирующей частот излучения.

2. Обнаружено, что изменение активности нейтрофилов регистрируется при действии ЭМИ КВЧ с низкими интенсивностями (1-150 мхВт/см2), что может свидетельствовать о нетегоговом механизме эффектов ЭМИ КВЧ в условиях нашего эксперимента.

3. Различные величина и направление эффекта ЭМИ КВЧ в зависимости от биотропных параметров (комбинации несущей и модулирующей частот, интенсивности) излучения указывают на возможность дистантного управления функциям клеток иммунной системы модулированным ЭМИ КВЧ.

4. Впервые показана сильная зависимость эффектов ЭМИ КВЧ от постоянного магнитного поля с величиной магнитной индукции, сравнимой с величиной магнитной индукции геомагнитного поля, что открывает новые возможности для построения теории взаимодействия КВЧ-излучения с биологическими системами.

5. Полученные результаты дают основание считать, что комбинированное действие ЭМИ КВЧ и постоянного магнитного поля способно модифицировать активность Са2+-зависимых внутриклеточных сигнальных систем, приводя к изменению функциональной активности на уровне клетки в целом.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Якушина B.C., Гапеев А.Б. Воздействие модулированных миллиметровых волн

низкой интенсивности на активность перитонеалышх нейгрофилов мыши. I Городская научная конференция молодых ученых, тезисы докладов, стр.104, Пущино, 15-17 мая 1996.

2. Гапеев А.Б., Яхушина B.C. Действие модулированного ЭМИ КВЧ низкой

интенсивности на внутриклеточную сигнализацию в перитонеальных нейтрофилах мыши. II Открытая городская научная конференция молодых ученых города Пущино, тезисы докладов, стр.97, Пущино, 23-25 апреля 1997.

3. Якушина B.C., Гапеев А.Б. Резонансное действие ЭМИ КВЧ низкой

интенсивности на перитонеальные нейтрофилы мыши в дальней зоне антенны. II Открытая городская научная конференция молодых ученых города Пущино, тезисы докладов, стр.126, Пущицо, 23-25 апреля 1997.

4. Гапеев А.Б., Якушина B.C. Изменение продукции активных форм кислорода

перитонеалышми нейгрофилами мыши при действии модулированного ЭМИ КВЧ низкой интенсивности. Сб. трудов II окрытой городской научной конференции молодых ученых г.Пущино, Пущино, 1997, стр.64-70.

5. Аловская A.A., Гапеев А.Б., Сафронова В.Г., Фесенко Е.Е., Чемерис Н.К.,

Якушина B.C. Резонансное ингибирование активности перитонеальных нейтрофилов мыши при действии низкошггенсивного ЭМИ КВЧ в ближней и дальней зонах антенны. Вестник новых медицинских технологий, 1997, t.TV, №3, стр.38-45.

6. Гапеев А.Б., Якушина B.C., Чемерис Н.К., Фесенко Е.Е. Модулированное ЭМИ

КВЧ низкой интенсивности активирует или ингибирует респираторный взрыв нейтрофилов в зависимости от частоты модуляции. Биофизика, 1997, т.42, вып.5, стр.1125-1134.

7. Гапеев А.Б., Якушина B.C., Чемерис Н.К., Фесенко Е.Е. Эффекты

ндакоинтенсивного модулированного ЭМИ КВЧ на клетки иммунной системы - нейтрофилы мыши. Всероссийская научная конференция "Физические проблемы экологии (физическая экология)", тез. докл., т.1, стр.19-20, Москва, 23-27 июня 1997.

8. Гапеев А.Б., Якушина B.C., Чемерис Н.К., Фесенко Е.Е. Низкошггенсивное

модулированное электромагнитное излучение крайне высоких частот модифицирует продукцию активных форм кислорода нейтрофилами. Сб. трудов Всероссийской научной конференции "Физические проблемы экологии (физическая экология)", Москва, 1997 (в печати).

9. Гапеев А.Б., Якушина B.C., Чемерис Н.К., Фесенко Е.Е. Модулированное ЭМИ

КВЧ низкой интенсивности модифицирует активность клеток иммунной системы - нейтрофилов. Тезисы докладов I Международного симпозиума

"Фундаментальные науки и альтернативная медицина", стр.54-55, г.Пущино Московской области, 22-25 сентября 1997.

10. Гапеев А.Б.. Якушина B.C., Чемерис Н.К., Фесенко Е.Е. Роль модуляции в эффектах низкошггенсшшого электромагнитного излучения КВЧ на активность клеток иммунной системы. Международный Конгресс "Медицинские технологии на рубеже веков". Тула, 1997. Вестник новых медицинских технологий, 199S, t.V, №1, приложение, стр.50.

i!. Якушина B.C., Гапеев А.Б. Зависимость эффектов ЭМИ КВЧ на

функциональную активность нейтрофилов мыши от величины постоянного магнитного поля. III Путинская конференция молодых ученых, тезисы докладов, стр.132-133, Пущино, 27-30 апреля 1998.

12. Гапеев А.Б., Якушина B.C., Чемерис Н.К., Фесенко Е.Е. Роль геомагнитных полей в частопюзависимых эффектах ЭМИ КВЧ на клетки иммунной системы. Международное совещание "Электромагнитные поля. Биологическое действие и гигиеническое нормирование", тезисы докладов, стр.39, Москва, 1998.

13. Гапеев А.Б., Якушина B.C., Чемерис Н.К., Фесенко Е.Е. Постоянное магнитное поле модифицирует частотнозависнмый эффект ЭМИ КВЧ на клетки иммунной системы. Международное совещание "Электромагнитные поля. Биологическое действие и гигиеническое нормирование", сборник трудов, Москва, 1998 (в печати).

14. Gapeyev А.В., Yakushina V.S., Chemeris N.K., Fesenko Е.Е. Inhibition and activation of neutrophil respiralory burst at the effect of modulated extremely high frequency electromagnetic radiation oflow-intensity. Abstract Book of 20th Annual Meeting of BEMS, p.123-124, St. Pete Beach, Florida, USA, June 7 - 11, 1998.

15. Gapeyev A.B., Yakushina V.S., Chemeris N.K., Fesenko E.E. Modification of production of reactive oxygen species in mouse peritoneal neutrophils on exposure to low-intensity modulated millimeter wave radiation. Bioelectrochemistry & Bioeneigetics, 1998 (in press).