автореферат диссертации по химической технологии, 05.17.18, диссертация на тему:Фотоэлектрические и структурные свойства ориентированных пленок пурпурных мембран и роль связанной воды в функционировании бактериородопсина

Государствешшй Научный Центр Ордена Трудового Красного Знамени Научно-исследовательский физико-химический институт имени Л.Я. Карпова

На правах рукописи

ОРИЕНТИРОВАННЫХ ПЛЕНОК ПУРПУРНЫХ МЕМБРАН И РОЛЬ СВЯЗАННОЙ ВОДЫ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ БАКТЕРИОРОДОПСИНА 05.17.18 - мембраны и мембранная технология

• АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Научно-исследовательском физико-химическом институте им. Л.Я. Карпова

Научные руководители: доктор физико-математических наук профессор С.Ф. Тимашев кандидат физико-математических тук

A.B. Максимыч^в

Научный консультант доктор физико-математических наук

B.И. Волков

Официальные оппонента: доктор физико-математических наук профессор Д.С. ЧернаБский

'дспор хжчгсш над

Ведущая организация: Кафедра химической энзимологии

химического факультета МГУ км. Ломоносова

О / £VC // QO

Защита диссертации состоится ,.Л".7\гг... 1996 г. в {/.......

на заседании Специализированного совета Д.138.02.06 при Государстветаом Научном Центре Научно-исследовательский физико-химический институт им. Л.Я. Карпова по адресу 103064 Москва ул. Воронцово полг-, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ НМФХИ им. Л.Я. Карпова.

Автореферат разослан "/£".. 1Э96 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических паук __A.B. Ьоробьеь

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В настоящее время активно обсуждается возможность построения вычислительных устройств, в которых в качестве функциональных элементов использовались бы отдельные молекулы, в том числе, биологические. Одним из наиболее перспективных объектов для применения в биомолекулярной электронике является бактериородопсин (БР)- ретиналь-содержащий фоточувствительный мембранный белок. Особый интерес к БР объясняется следующими основными причинами:

I )БР является простейшим фотоэлектрическим молекулярным генератором, который транспортирует под действием света протоны из бактериальной клетки во внешнюю среду, создавая тем самым разность электрохимических потенциалов Ар.^ на клеточной мембране.

2)ЕР - один из наиболее изученных биологических объектов, структура и фотохимические превращения которого детально исследованы.

3)БР обладает уникальной среди биомолекул устойчивостью к различным воздействиям, что дает широкие возможности для создания на его основе комбинированных структур в сочетании с традиционными для микроэлектроники материалами, а также с синтетическими полимерами.

БР, выделяемый из клеточных стенок бактерий На1оЬас^егхшп Ьа1оЬ1шп в виде белково- липидного комплекса - пурпурных мембран (ПМ), является удобным объектом для экспериментальной работы. Разработан ряд методов, позволяющих создавать организованные молекулярные структуры с высокой степенью упорядоченности БР.

Однако, недостаточно исследованным является вопрос о сопоставлении функциональных и структурных свойств иммобилизованных препаратов БР, полученных различными методами. ■ Весьма слабо исследовано влияние условий формирования и инкубации упорядоченных препаратов БР на их фотоэлектрические характеристики. Очень узкий круг полимерных материалов исследован к настоящему времени в качестве

подложек или сред для иммобилизации ПМ, тогда кок с практической точки зрения эти системы могут иметь большие перспективы. Наконец, несмотря на детальное изучение механизма внутримвмбранного протонного переноса, остается невыясненным характер процессов на поверхности ПМ при протонном обмене БР с внешней средой.

Исходя из сказанного, ЦЕЛЬЮ настоящей работы является изучение влияния способа формирования упорядоченных молекулярных ансамблей БР на их структурно- функциональные свойства и выявление основных физико- химических факторов, определяющих механизм функционирования ЕР и характеристики его иммобилизованных препаратов. Были поставлены ЗАДАЧИ:

1)Отработать методику формирования упорядоченных моно- и мультислойных пленок ПМ на твердых подложках методом Ленгмюрч и сопоставить свойства этих препаратов со свойствами полученных ранее методом электрофоретического осавдекия.

2)Исследовать возможности .получения упорядоченных препаратов Ш на полимерных материалах, обладающих различными физико- химическими свойствами.

3)Выяснить .механизм фотоэлектрогенных процессов в системах, содержащих- иммобилизованные на полимерных мембранах упорядоченные препараты ПМ и находящихся в контакте с раствором электролита.

4)Изучить состояние вод«, связанной с функциональными группами БР, и его влияние на процесс фогииндуцированного переноса протонов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Отработана методика получения ленгмюровских монослоев ПМ на границе раздела води/воздух. Исслледован процесс переноса монослоев ПМ о межфазной границы на полупроводниковые подложки, найдены оптимальные условия переноса. Впервые исследована структура упорядоченных мультислойных пленок ГШ двух типов: получаемых м* юдом Лэшшра - Блодает и путем

электрофоретического осаждения суспензии ПМ. Впервые сопоставлена фотоэлектрическая активность БР в препаратах двух указанных типов. Отработана методика формирования высокоориентированных многослойных пленок ПМ на поверхности синтетических полимерных мембран. Использование различных полимерных подложек позволило выявить ключевые физшсо- химические факторы, влияющие на фотоэлектрические свойства таких систем. Впервые исследовано состояние воды, связанной с ПМ, что дало возможность существенно дополнить механизм Функционирования протонной помш БР.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Результаты исследования свойств БР в составе иммобилизованных на различных подложках упорядоченных структур могут быть использованы при создании новых материалов в' микроэлектронике. На основе модифицированных пленками БР полимерных мембран возможна разработка новых типов химических сенсоров. Разработанный метод радиоспектроскопических исследований может быть использован для исследования эффектов гидратации в различных биологических объектах. Полученные экспериментальные данные позволяют углубить модельные представления о роли связанной воды в механизме активного транспорта.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, выносимые на защиту:

1) Электрофоретический метод получения ориентированных препаратов БР позволяет достигнуть оольшей структурной упорядоченности и более высокой удельной фотоэлектрической активности образцов по сравнению с технологией Ленгмюра- Блоджет.

2) Наибольшие для препаратов БР фототоки достигаются в пленках ориентированных ПМ, иммобилизованных на поверхности фторсодержащих ионообменных мембран, как следствие относительно высокой адгезии ПМ к полимерной подложке.

3) Присутствие в гидратной оболочке ПМ двух типов молекул

связанной воды, которые различаются по своей подвижности. Наличие корреляции между подвижностью "сильносвязанной" воды и фотоциклом БР.

4) Модель, объясняющую роль связанных с 'ИМ катионов металлов в функционировании БР и механизм низкотемпературного блокирования трансмембранного переноса протоков в БР.

АПГОБАЩЯ РАБОТЫ. Основные результаты работы доложены на Всесоюзном семинаре "Биологические фоточувствительные комплексы и возможности их применения в. фоторегистрирующих системах технических устройств" (Пущино, 1984), на конкурсе научных работ НЙФХЙ им. Л.Я. Карпова (Москва, 1985), на 2-й Всесоюзной конференции "Возобновляемые источники энергии" (Ереван, 1985), на 37-й конференции Международного электрохимического общества (Вильнюс, 1986), на 3-й Всесоюзной конференции молодых ученых по физической химии (Москва, 1986), на 15-й научной конференции молодых ученых ИХФ АН СССР (Москва, 1988), на 4-м меадународном 5румютнском симпозиуме "Биоэлектрохимия сегодня и завтра" (Суздаль, 1988), на Международном симпозиуме 'Виомолекулярная инженерия и биаэлектроника" (Москва, 1991).

ПУБЛИКАЦИИ. Результаты проведенных исследований опубликованы в восьми печатных работах.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка литературы, включающего 343 наименования. Работа изложена на 196 страницах машинописного текста, включает 40 рисунков и Я таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во ВВЕДЕНИИ кратко характеризуется основной объект изучения, в общем виде формулируются проблемы в датой области, обосновывается актуальность выбора темы исследования.

ГЛАВА 1. "СТРУКТУРНЫЕ И ФУНЩ-ЮНАЛЬШЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИОРОДОПСИНА И МШ0Б1Ш30ВАМЫХ ПРЕПАРАТОВ ПУРПУРНЫХ МЕМБРАН" представляет собой

обзор литературы. Описаны различные метода получения иммобилизованных препаратов БР и их свойства. Рассмотрено влияние физических и химических факторов на состояние ПМ и функционирование БР.

ГЛАВА 2. "МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ".

2.1. Приготовление образцов для исследования.

Пурпурные мембраны, выделенные из клеток Halobaoteгiшl 11а1оЫит (штаммы 353-П и й1м1), были любезно предоставлены в наше распоряжение Л.Н. Чекулаевой (Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Иущино)

Деионизованную суспензию ПМ получали путем трехкратной отмывки в бидистилляте и седиментацией на ультрацентрифуге при 80 ООО Суспензию ПМ в гексане получали, добавляя к водной суспензии ПМ с концентрацией БР 2,5-5 мг/мл равное по объему количество гексана. После добаления 2 М раствора СаС12, интенсивного перемешивания и центрифугирования смесь разделялась на три фазы, одна из которых,

с

представляющая собой суспензию ПМ в гексане (концентрация БР "3-10 М), использовалась в дальнейших экспериментах.

Монослои ПМ формировали на границе раздела фаз воздух/вода, используя установку "«Гоуое ЬоеЫе" (Великобритания). Субфазой служила вода.с удельной электрической проводимостью 18 МОм-см, полученная по технологии "МИНроге-сг. Моносли ПМ переносили на подлокки из кварца, графита или стекла с проводящим слоем Вп02 стекла методами Блоджет или Шефера.

При электрофоретическом (ЭФ) осаждении ПМ использовали деионизованную суспензию ПМ с концентрацией БР ~Ю мг/мл. Прилагаемое к суспензии электрическое поле варьировали от 30 до 60 В/см, время осаждения изменялось в диапазоне от 30 до 240 секунд.

2.2. Методы экспериментального исследования препаратов.

Оптическое поглощение образцов измеряли с помощьь

спектрофотомотров "Specord м-40" (Германия) и С-Ф-46. Спектры кругового дихроизма регистрировали на приборе J-40-AS "Jísoo" (Япония).

Кинетические спектральные и электрические измерения проводили на специально сконструированной автоматизированной установке (Биологический факультет МГУ), источником активирующего света в которой служил импульсный лазер на неодиме (Л.=530 нм, длительность импульса 15 не). Отклики на импульсное возбуждение регистрировали с помощью анализатора DL-912 "Data Lab", (Великобритания), сопряженного с микро-ЭВМ Toroh-czi "Herald Computers" (Великобритания).

Релаксационные измериния проводили на импульсном HMF-' спектрометре ¿XP-4-100 "Bruker" (Германия) на частоте 90 МГц. Спектры *Н-ЯМР высокого разрешения регистрировали на приборе Тев1а BS-49? но частоте 100 МГц. Температура образцов в диапазоне от 210 до 300 К поддерживалась с помощью приставки b-st-100/700 с точностью +IK.

ГЛАВА 3. "ОРИЕНТИРОВАННЫЕ МУЛЬТИСЛОИ ПУРПУРНЫХ MEVuSPAH, ПОЛУЧЕННЫЕ МЕТОДАМИ ЛЕНГМЮРА- БЛОДЖЕТ И ЭЛЕКТРООСАВДЕНИЯ".

3.1.Суспензия пурпурных мембран в гексане.

Методами оптической абсорбционной спектроскопии и спектроскопии кругового дихроизма исследовано влияние гексана как среды оуспенда.рования - ПМ на структуру хромофорного ■ центра БР и на организацию молекул БР в двумерной кристаллической структуре ПМ. Обнаружено, что спектр поглощения БР при суспендировании ПМ в с6н14 совпадает со спектром поглощнэия темноадантированной формы БР, имеющей a-полосу при 560 нм (рис. I), что указывает на отсутствие заметных изменений в локальном окружении ретиналя при переводе BF из воды в CgH14- В спектрах кругового дихроизма БР в Cgfí14 наблюдается экситонное расщепление, что свидетельствует о сохранении кристаллической решетки Ш (рии. I). Однако,, гуспендирование в

приводит к некоторому разупорядочению молекул БР в решетке1 ПМ по сравнению с водной суспензией.

Методом кинетической, абсорбционной лазерной спектроскопии исследована кинетика релаксации Н412 (ключевого функционального интермедиата фотсцикла БР) для водной и гексановой суспензий ПМ. Обнаружено уменьшение скорости релаксации М412 (скорости фотоцикла БР) примерно на порядок величины при суспендировашш ПМ в С6Н14. Замедление цикла фотохимических превращений БР, предположительно, связано с дегидратацией Ш в гидрофобном органическом растворителе.

3.2.Монослои на границе раздела фаз воздух/вода.

Для монослоя ИМ, сформированного на границе раздела фаз воздух/ вода из суспензии ПМ в 06н14> исследованы изотермы поверхностное давление (и) - молекулярная площадь (А) в расчете на одну молекулу БР (рис. 2). Изучены тс-А изотермы для смешанных монослоев, содержащих БР и фосфатидилэтаноламин; обнаружена аддитивность молекулярных площадей компонентов смеси.

В области давлений 15-35 мН/м, сравнимых с давлением коллапса

\мм

нм

Рис Л. Спектр поглощения суспензии ГО,! в гексане (а) и спектр кругового дихроизма водной (б) и гексановой суспензий П)Л (ы

20 30 40 50

Рис.2. Изотерма повергшсклноа давление- молекулярная г,Л' ^дь ДЛЯ МОНОСЛОЯ ПМ 1!" гриимн

раздела еоздух/в^ач.

(1с0) монослоев ИМ и фосфатидалэтаноламина, модуль сжимаемости А(<17с/<1А) монослоя смешанного состава не отличается от модуля сжимаемости монослоя ПМ и составляет 50-55 мН/м.

Изучение гистерезиса тс-А изотерм и необратимых изменений при последовательных циклах сжатие- расширение позволили определить давление коллапса монослоя ПМ, ^=49 мН/м. Молекулярная площадь при коллапсе составляет для БГ 650 А0^, что существенно меньше величины ИБО А°2, характеризующей молекулярную площадь в нативной ПМ. Это дает основание предпологать, что ПМ на границе раздела фаз не яляются плоскими, а представляют собой расположенные наклонно чашевидные образования.

3.3.Формирование мультислоев пурпурных мембран методом Ленгмюра-Блоджет.

Поверхностное давление 39 мН/м выбрано в качестве рабочего для перенесения монослоев с межфазной границы на твердые подложки методом Ленгмюра- Блоджет (ЛБ), поскольку: а)этому давлению отвечает молекулярная площадь БР, равная таковой в нативных ИМ; Одавление обеспечивает эффективный перенос монослоя с коэффициентом переноса кгг0,8. В этих условиях формировали препараты ПМ г-типа с числом слоев от 15 до '75. Показано, что величина к зависит от скорости вертикального движения образца, скорость 5 мм/мин выбрана как оптимальная. Обнаружено влияние времени высушивания образца между последующими циклам переноса на устойчивость формируемой мультислойной структуры. Присутствие молекул фосфатидилэтаноламина в монослой ПМ не повышает коэффициента переноса .монослоя.

3.4.Структурные свойства ориентированных мультислойных препаратов пурпурных мембран.

Сшктрн оптического поглощения ЛБ -пленок ПМ соответствуют спектрам поглоцодя БР. ССнир;/«ен эффект т^оздетлвния Тфи нанесение

монослоев ПМ на стекло, покрытое ВпО^.

Сопоставлена кинетика фотоэлектрических процессов в ответ на лазерную вспышку в препаратах БР, полученных методами ЛБ и ЭФ-осаждения (рис. 3). Путем сравнения амиплитуд быстрой "отрицательной" и медленной "положительной" фаз фотопотенциала получена оценка степени ориентации ГШ в препаратах двух указанных типов. В ЛБ-пленках степень ориентации молекул БР составляет 70-90%, тогда как в образцах ЭФ- осаждешых ГШ практически ЮОЖ мембранных фрагментов направлены цитоплазматической стороной к подложке. Удельная фотоэлектрическая активность, измеренная по положительной фазе фотопотенциала при импульсном возбуждении составляет 0,4 мВ/монослой и 5 мВ/монослой для ЛБ-иленок и ЭФ- осажденных препаратов Ш соответственно.

Функциональную активность БР в плешах, полученных из водной и гексановой суспензий ПМ, сравнивали по кинетике релаксации

О ЮМ КО 40

Рис.3. Киньтика фотопотенциала в ответ на лазерную вспышку: Г-ЭФ-осажденные пленки, ¿-получен-ченные методом ЛБ._

19 5,829; » * '

Рис.4. Рентгенограмм пленок Ш, полученных метолем ЛБ (I) и ЭФ-осаждения ___

интермедиата в ответ на лазерную вспышку. Обнаружено, что

плешей, приготовленные из суспензии в с&н14, менее фотоактивны и скорость фотоцикла в них примерно на порядок меньше, чем в препаратах, полученных из водной суспензии.

Структура мультислойных ЛБ и ЭФ- осажденных препаратов Ш исследована методом малоуглового рентгеновского анализа. На рентгенограммах ЛБ-пленок ПМ (рис. 4) наблюдается широкий максимум, отвечающий периоду повторяемости 36-38 А0 и длине корреляции "3-4 периодов повторяемости. ЭФ- препараты ПМ характеризуются периодом 46,4+0,2 А0 и наличием дальнего порядка с длиной корреляции "В-1С) периодов повторяемости.

3.5.Электрофизические свойства ориентированных мультислойных препаратов пурпурных мембран.

ТТ ТГ1 ?

Электрическое сопротивление образцов составляет 10-10 Ом-см" и 10^-10® .Ом-см2 для ЭФ- осажденных и ЛБ- пленок соответственно.

с С

Удельные характеристики в расчете на монослой раьны 2-ТО -2-10

о 7 тп р

Ом-ом /слой для ЛБ-пленок и 5-10-10 Ом-см /слой для ЭФ- осажденных препаратов. Более низкое удельное сопротивление ЛБ- пленок, независимость их сопротивления от числа монослоев, а также проницаемость для ртути, используемой в качестве измерительного электрода,, свидетельствуют о высокой дефектности ЛБ- препаратов. Причинами большого количества дефектов могут быть наличие значительного количества связанной воды, а также искажение плоской формы ПМ при суспендировании в с6н14-

ГЛАВА 4. "ФОТОТОКИ В ОРИЕНТИРОВАННЫХ ПЛЕНКАХ ПУРПУРНЫХ МЕМБРАН, НАНЕСЕННЫХ НА СИНТЕТИЧЕСКИЕ ПОЛИМЕРНЫЕ ПОДЛОЖКИ".

4.1. Темповые электрофизические свойства момбрачннх систем.

Для установления физико- химических Факторов, влияющих на

регистрируемый фототок и стабильность системы, ориентированные пленки Ш приготовлены на следующих полимерных подложках: целлофан, полиэтилентерефталат (ПЭТФ) - ("трековые мембраны" с порами диаметром 0,25 мкм), полиакриламидный гель (ПААГ), перфторированная катионообменная мембрана МФ4-СК с обменной емкостью S03~- групп 0,9 мг-экв/г, перфторированная анионообменная мембрана MAC-IO с обменной емкостью четвертичных аммониевых оснований 2 мг-экв/г.

Зависимость электрического сопротивления осажденных планок ПМ от концентрации ИаС1 (диапазон Ю-2 - I М) в среде инкубации в точности соответствует изменению сопротивления раствора Nací для пленок, осажденных на целлофан, ПЭТФ и ПААГ. Сопротивление осажденной пленки ПМ определяется электропроводностью электролита в набухшей пленка ПМ.' Некоторые отличия концентрационной зависимости сопротивления для препаратов ГШ, осажденных на ионообменные мембраны, отражает, по-видимому, влияние плешей ПМ на характер поляризации в приповерхностной области мембран при протекании измерительного тока.

Обнаружен пороговый характер формирования пленки ПМ на подлогаэ при ЭФ- осаждении мембранной суспензии: адгезия ПМ наблюдается лишь в том случае, когда при заданной напряжености поля (20 В/см в наших экспериментах) время пропускания тока превышает некоторое минимальное: 20 с для целлофана и ПЭТФ, ~40 с для МФ4-СК, примерно 50-60 d для МАС-Ю.

4.2. Природа фототока.

При стационарном освещении ориентированных препаратов БР, осажденных на полимерные подложки, разделяющие два отсека электрохимической ячейки, между отсеками регистрируется постоянная разность потенциалов величиной от 20 мкВ до 5 мВ в зависимости от типа полимерной мембраны (рис. 5). Величины фотоответс;и

пропорциональны интенсивности активирующего света, спектр действия фотоответов соответствует спектру поглощения БР.

При ЭФ- осаждении из нейтральной суспензии (рН ь) Ш ориентированы цитоплазматической поверхностью в сторону подложки, на что указывает полярность фотоответа. Ориентированные образцы, полученные из суспензии с рН 4,2, генерируют фотоэлектрические сигналы противоположной полярности, что согласуется с данными об инверсии постоянного дипольного момента Ш при рН '

Исследовано влияние разности рН и разности электрических потенциалов между отсеками ■ ячейки на величину фотоэлектрических сигналов БР. Обнаружено, что понижение электрохимического потенциала {Г1 в направлении протекания фототока (за счет электрического смещения или создания ДрН) сопровождается возрастанием последнего. По-видимому, сторонняя разность электрохимических потенциалов складывается с генерируемой БР в результате фотоактивного

Рис.Б. Кинетика {ютотокз в Рис.6. Эквивалентная электри-пленках Ш, нанесенных на различ- ческая схема и распределение то ные подлоига: I-целлофан, 2-ПЭТФ, ков в осажденной на полимерные 3-ПААГ, 4-МФ4СК, 5-КАСЮ. На мембраны пленке ПМ. вставке: спектр действия фототок _

переноса ¡фотонов. Это приводит к возрастанию движущей силы, вызывающей пассивный дрейф ионов среды, в результате чего стационарное состояние достигается при большей разности электрических потенциалов между отсеками.

4.3; Влияние условий инкубации на фотоэлектрическую активность

образцов.

Основными исследуемыми характеристиками мембранных систем с осажденными на них препаратами ГШ являлись: стационарное значение фототока, кинетика установления стационарной величины и релаксации фототока, стабильность образцов, коэффициент фотоэлектрического преобразования энергии. Изучались зависимости этих характеристик от свойств мембран- подложек таких как электрическое сопротивление, число переноса, угол смачивания водой и суспензией ПМ. Исследовано влияние концентрации и pH электролита, а также процесса набухания полимерной подложки на фотоэлектрические процессы в иммобилизованных препаратах Ш. Основные характеристики изученных образцов приведены в табл.1.

Наибольшие фототоки зарегистрированы при использовании в качество

подложек для ГОД фторсодержащих ионообменных мембран. Полученные в

р>

этих образцах плотности фототоков -. "10 mkA/cmj. совпадают с максимальными величинами, достигнутыми для иммобилизованных препаратов БР. Эти же подложки позволяют получать наиболее стабильные системы, время функционирования которых составляет до 10 суток при непрерывной инкубации в растворе NaOl.

Эксперименты с предварительно высушенными на воздухе иммобилизованными препаратами ПМ показали, что установление равновесие. , гидратации в растворе сопровождается увеличением фототока. Фототек и кинетика переходных процессов зависят от ионной

Таблица1 I. Свойства полимерных мембран, используемых в качестве подложек для ориентированных пленок ПМ.

Полимер Р t Jph "Л Т

Целллофан 3+5 +0,53 <0,5 <10"10 0

ПЭТФ 17+40 +0,56 0,5 ю-10 0,2

ПААГ 15+40 +0,54 3+5 Ю-8 1-3

МФ4-СК 25+50 ■ +0,98 20 3-I0-7 10

МАС-1,0 30+40 -0,88 6 2-Ю-7 2

Обозначения и единицы измерения: р- сопротивление в 0,1 M растворе NaCl, ОМ'СМ2; t- число переноса ("+" и "-" соответствуют катышо-и анионо- обменной функции соответственно); i стационарный

о рп

фототок в 0,1 M растворе NaCl, мкА/см ; т)- коэффициент фотоэлектрического преобразования; т- время стабильного функционирования системы,' сутки.

силы электролита: при возрастании концентрации NaCl от 50 мМ до I M

генерируемый БР фототок увеличивается примерно в два раза, при этом

время 1установления стационарного фототока уменьшается примерно в

пять раз. Генерируемый БР фототок слабо зависит от величины рН в

интервале 5-9. При рН > II препараты БР-теряют фотоэлектрическую

активность, при этом исчезает максимум поглощения при 570 нм в

спектре БР. Щелочное ингибирование фотоэлектрической активности

препаратов БР обратимо: в растворе Nací с рН 7 функция БР и пурпурная

окраска восстанавливаются за время порядка нескольких часов.

Наличие корреляции между величиной фотооткликов и стабильностью исследованных систем .позволяет сделать вывод о том, что основным фактором, влияющим на величину фотоответа иммобилизованных препаратов SP, як№тея прочность адгезионного контакта между поверхностью

полимерной подложки и прилежащим к ней слоем ПМ. Можно предположить, что адгезионные свойства системы полимерная подложка/ПМ зависят от состояния связанной воды, находящейся в зоне межфазного контакта. В терминах эквивалентной электрической схемы, приведенной на рис. 6, прочность адгезионного контакта определяет степень электрического сопряжения протонной помпы БР с подложкой и величину токов утечки в исследуемой системе.

ГЛАВА 5. "СОСТОЯНИЕ ВОДЫ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ПОДВИЖНОСТЬ В ГВДРАТИРОВАБШХ ПУРПУРНЫХ МЕМБРАНАХ ПО ДАННЫМ ЯДЕРНОГО МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА".

5.1.Исследования методом протонного магнитного резонанса высокого

разрешения.

Уравновешенный с насыщенным'' параш воды порошок ПМ связывает "2600 молекул Н20 в расчете ьа молекулу БР. Спектр ПМР гидратированной таким образом пасты ПМ представляет собой широкую линию, непригодную для детального анализа . Разработанная методика перевода ПМ из водной фазы в органический гидрофобный растворитель позволяет избавиться от сигналов ГМР объемной фазы вода и получить спектры высокого разрешения для молекул из гидратной оболочки ПМ (рис 7). ПМ, перведенные в О^Н.,^ в нейтральной и кислотной формах, связывают (6,5+0,7) ■ Ю4 и (2,6+0,5)-104 молекул воды соответственно в расчете на одну молекулу БР. Химические сдвиги сигналов Н2о, связанной с ПМ в гидратированной пасте ПМ и в с^н^ совпадают, указывая на неизменность состояния связанной воды при суспендированил ПМ в гексане.

Исследования в темпоратурном интервале 210-300 К показали, что в кислотной ,л>рмв Г'Р вся связанная вода теряет додвияность при 273 К. тогда как в н€й1рчльной форме нг примерно 20* оьязпшк.й воды

сохраняют высокую подвижность вплоть До 220 К. Зависимость от

температуры химического сдвига 0 сигналов ШР приведена на рис. 8.

Величина 5 при комнатной температуре совпадает со значением Б м.д.

относительно ТЫС, характеризующим свободную воду. Температурная

зависимость б имеет излом вблизи 273 К, коэффициент ао/ат равен

- ч

7,7-10 м.д./К в области т>273- к и I-10 В кислотной формы мембран при Т>273 К температурная зависимость 8 характеризуется коэффициентом I,МО"2 м.д./К.

При комнатной температуре ширина линии Л1'1/г сигнала Н£о для нейтральной формы БР составляет 170 Гц, для кислотной формы Да'1/,2=27 Гц, что значительно превышает ширину сигнала свободной Н£0 (<1 Гц). Кнк для нейтральной, так и для кислотной форм БР слабо зависит

от температуры в диапазоне 298-273 К. Вблизи 273 К наблюдается сильное уширение сигналов и.,о для обеих форм БР.

Значительное количество воды, связанной с Ш ъ гидрофобном окручк'нин, а также большая ширина линий сигналов ШР свидетельствуют

о высоком сродстве ПМ к воде. Характер температурных зависимостей параметров IMF- спектров для нейтральной и кислотной форм БР свидетельствует о наличии двух типов связанной с ПМ воды. "Слабосвязанная" вода по своим структурно- динамическим свойствам практически не отличается от воды в объемной фазе. Слабосвязанная Форма является единственной в случае кислотных ПМ, а в нейтральных ПМ ее доля составляет "'80%. Ко второму типу ("силыгосвязанная" вода) относится Z0%. молекул Н2о, связанных с нейтральной формой ПМ. Для этого тина характерно слабая зависимость б. от температуры, большая величина и наличие молекулярной подвижности вплоть до "220 К.

Предполагается, что центрами сильного связывания воды являются поверхностные заряженные группы белково- липидного комплекса ПМ, а г:!кжэ двухзарядные катионы на поверхности ПМ в нейтральной форме.

5.2.Исследования методом протонной магнитной релаксации.

Молекулярная подвижность в уравновешенных с насыщенными парами воды ПМ исследована методом ЯМБ-релаксации на ядрах н в интервале температур 210 - 300 К. Анализ кинетики восстановления продольной намагниченности протонов в образцах ПМ, уравновешенных с Н£о показывает, что продольная релаксация в общем случае описывается суммой трех кинетических компонентов, характерные времена которых при 265 К составляют T1 (1'= 5 мс, Т^2^ 44 мс, 630 мс, ' 8

относительные вклады в суммарную амплитуду сигнала 0,13, 0,42 и 0,45 соответственно. Изменение поперечной намагниченности, в отличив от продольной, описывается одноэксноненциальным кинетическим уравнением с характерным временем равным 0,25 мс при 250 К. Исключением якляется температурная область 230 - 240 К, в которой кинетика спада поперечной нямагнич^нности я-члотся двухксмпсчмнтний.

Зависимого и времени ггпч-спиновой релякс-хлш Т„ и ьремени

отдельных кинетических компонентов спин-решеточной релаксации от температуры для гидратировашшх препаратов ПМ приведена на рис. 5. Отличительной особенностью исследуемых релаксационных процессов является их кеаррениусовская зависимость от температуры. Наблюдается резкое изменение скоростей релаксации вблизи 273 К и "223 К. При 273 К наблюдается скачкообразное уменьшение величины Т2, дальнейшее понижение температуры ведет к возрастанию скорости спин-спиновой релаксации. В области ниже 240 К кинотика релаксации поперечной намагниченности обнаруживает второй компонент, который становится единственным при температурах ниже ГЗО К (прямые 1в и 1с на рис.9). Амплитуда сигнала спин-эха резко уменьшается примерно на 80Х щи 273 К, дальнейшее понижение температуры приводит к плавному уменьшению амплитуды сигнала.

Наличие трех кинетических компонентов в релаксации продольной намагниченности в области 273 - 223 К указывает на присутствие трех типов протонов (рис. 9), отличающихся по своей подвижности. Отнесение кинетических компонентов проведено путем сопоставления релаксациошшх кривых для ПМ, уравновешенных с п.^с и юо0. Кинетика восстановления продольной намагниченности в системе ПМ/Б2о является двухкомпонентной во : всем исследованном интервале температур. Сопоставление релаксациошшх кривых для систем ПМЛ>20* и Ш/Н2о показало, что наиболее "медленный" компонент релаксации отвечает движению протонов ПМ и Н2о, способных к обмену с гидратной оболочкой. Два болбе быстрых кинетических компонента (рис. 9, кривые 2 и 3) отвечают необменивающимся протонам Ш.

Скорость поперечной релаксации обнаруживает аномал™ волизи температур 27о К к 223 К (кривая I на рис. 9). Аномалия при 273 К, сопровоадкщаяся резким уменьшением амплитуды сигнала спин-эха,

Рис.9.Скорость спин-спиновой релаксации (I) и компонентов восстановления продольной намагниченности (2, 3 и 4) в гидратиро-ванкых ПМ.

4Г

Н+

I

•0-

/НУ г

'V :

РисЛО.Сетка водородных связей воды вблизи мест связывания катионов в БР: а)кислотная форма ПМ, б(нейтральная форма ПМ со связанными катионами.

обусловлена образованием фазы льда молекулами "слабосвязянной" воды. Остальные "'201 молекул но0 сохраняют высокую подвижность вплоть до температуры 223 К.

Следует отметить наличие сильной корреляции между молекулярными движениями протонов ПМ и ее гидратной оболочки. Скачок при 273 Н на температурной зависимости Т'г, характеризующей движения молекул 11,0 сопровождается аномалиями на температурных зависимостях величин

характеризующих протоны ПМ. Вблизи 223 К особенности

М )

тагосе наблюдаются для зависимостей всех указанных величин т2, Т1 ■ и Ф от температуры (рис. 9).

5.3. Влияние температуры на молекулярную подвижность в гидратировянных ПМ и на фотоцикл БР.

Температура 220 К, ни»,- которой связанные с ПМ молекулы вода теряют подвижность, совпадает с температурой блокирования трзномеморэячрго переноса Я1 в БР. Механизм блокирования может быть объяснен на оснований пол.уч -йс-х магнитно- спектроскопических даиннх.

Структурно- динамические свойства молекул н2о, проявляющийся в спектрах ПМР высокого разрешения, согласуются с предположением о том, что сильносвязанная вода входит в состав гидратных оболочек ионов 0а2+ и Ы5г+ (Ме2+), ассоциированных с БР. Влияние Ме2+ приводи! к поляризации и ослаблению валентных связей н2о и усиление межмолекудорных водородных связей, что, в пределе, , приводит к диссоциации молекул Н20 (рис.10). Связанные с БР катионы иег* являются центрами поляризации,' функциональная роль которых, •'<->-видимому, состоит в увеличении степени диссоциации молекул Н^о вблизи поверхноср Ш и, тем. самым, в увеличении концентрации н+ вблизи входа в н^-транспортный канал БР. Оценки, показывают, что ь отсутствие связанных с БР ионов Мег+ перенос протонов с наблюдаемой скоростью 100 Н+/с был бы невозможен при рН>5. То, что указанная скорость реализуется даже при рН 8, указывает на значительное повышение локальной концентрации н+ вблизи транспортного канала БР и может рассматриваться как свидетельство в пользу высказанной гипотезы о функциональной роли Мег+.

В температурной области <273 К механизм доставки н+ к транспортному каналу состоит в сближении полярных ' групп БР на расстояние, при котором между молекулами н2о, образующими гидратную оболочку, становится возможным образоавние водородной связи. Оценки, выполненные на основании собственных, а также литературных данных, показывают, что среднее расстояние между заряженными группами (потенциальными центрами гидратации) на поверхности ПМ составляет 710 А°, тогда как радиус гидрач^ий оболочки составляет ~5 А0. Предполагается, .что в интервале 273-220 К постепенно теряют подвижность молекулы н2о, образующие внешние слои гидратации. Это приводит к уменьшению гидратационного радиуса, что резко замедляет

скорость трансляционного протонного обмена. При ~220 К вследствие отсутствия контактов между гидратннми оболочками функциональных групп блокируется либо доставка н+ ко входу в транспортный канал БР, либо перенос но участку канала от цитоплазматической поверхности ПМ к основанию Шиффа. Энергия активации 29 кДж/моль восстановления продольной намагниченности (рис ¿9), типичная для поступательной диффузии молекул Н20, согласуется с предложенным механизмом.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ:

1) Разработана оригинальная методика получения суспензий- ПМ в гидрофобном органическом растворителе, пригодных для формирования организованных молекулярннх структур БР методом Ленгмюра- Блоджет. Использование суспензии ПМ в гексане впервые позволило применить лето д протонного магнитного резонанса высокого разрешения для исследования структурно- динамических свойств связанной с ПМ воды без фрагментации белково- липидного комплекса ГШ.

2) Впервые сопоставлены структурные особенности ориентированных препаратов БР, полученных методом Ленгмюра- Блоджет и путем электроооаждения. С использованием мэлоуглового рентгеноструктурного анализа показано, что метод электрофоретического осаждения ПМ позволяет получать образцы, обладающие более высокой упорядоченностью. Длина корреляции в электрооеяжденных препаратах составляет 3-10 периодов, тогда как в мультислойзшх ленгмюровских пленках ПМ она не превышает четырех периодов повторяемости.

3) Впервые проведено сравнительное изучение фотоэлектрических свойств ориентированных препаратов БР, полученных методами Ленгмшра-Блоджет и электрооо.чкдения. Показано, что электрофоретический метод дает рода, шость получать образцы толщиной от нескольких сот до нескольких тысяч чемЗр'Л'пэт слоев с удельной . фотоэлектрической

активностью мВ/слой, тогда как ленхмюровская технология нозволябт формировать планки с числом слоев от единиц до десяткиь, удельная фотоэлектрическая активность которых равна "0,5 мВ/слой.

о

4}' Максимальные для препаратов БР фототоки - до 20 мкА/с-м" -достигаются в пленках из ориентированных IM, нанесенных на ионообмонше мембраны из фторсодерзкащих полимеров. Установлено, что стабильность и фотоэлектрическая активность иммобилизованных ГШ определяется адгезионной прочностью контакта ПМ/полимер, которая зависит от состояния связанной воды в зоне межфазного контакта.

5) Впервые методы протонного магнитного резонанса высокого разрешения и протонной магнитной релаксации использованы для исследования свойств связанной с ПМ воды. Обнаружена гетерогенность гидратной оболочки ПМ, состоящей из "сильно-" и "слабо-связанных" молекул вода. Впервые показано, что температурная граница "220 к, выше которой становится возможным полностадийный трансмомбрашшй перенос Н+, совпадает с порогом "размораживания" крупномасштабной подвижности сильносвязанной воды.

6) На основании полученных экспериментальных данных предложена модель, согласно которой функциональная роль ассоциированных с BF двухэарядчых катионов состоит в повышении локальной концентрации и подвижности н+ вблизи устья протон- транспортного канала. RnoiaipoBaime транспорта Н+ в БР при 220 К обусловлено нарушением контактов между теми областями гидратных оболочек различных функциональных групп БР, которые содержат подвижные молекулы "оилыгасвязаннсй" воде.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ, содержащих основные результаты диссертации:

1 .Ме>кгим;/>ов A.B., Чаморовский O.K., Холманский A.C., Ерохин Р.В., ."-'Ы'Н K.P., Чекулаевя Л.Н., Кононенко A.A., Рамбиди Н.Г.

Мультислои ориентированных пурпурных мембран галобактерий, полученные методами Ленгмюра- Блоджет и электроосаждения.// Биол. мембраны. 1991 Г.8. Я. С. 15-29.

2.Максимнчев A.B., Волков В.И., Левин Е.В., Гасюк О.В., Муромцев В.И., Тимэшев С.Ф., Чекуляева Л.Н. Молекулярная подвижность в гидратированных пурпурных мембранах галобактерий, исследованная методом протонной магнитной релаксации.// Биол. мембраны. 1991 Т.8. №12. С.1260-1268.

5.Maximyehev A.V., Kholmansky A.S., Levin E.V., Rambidi • N.G., Ghamoroveky S.K., Kononenko A.A., Erokhin V.7., Chekulaeva L.N. Oriented purple Membrane Multilayers of Halobaoteria Fabricated by Langmuir- Blodgett and Eleotrophoretio Sedimentation Teohniques.// Advanced- Materials for Op Нов and Electronics. 1993 V.l. N0.3. P. 105- 115.

4. Максимнчев A.B., Волков В.И., Левин Е.В., Хуцшпвили В.Г., Чекуляева Л.Н., Тимашев О.Ф. Особенности состояния воды в пурпурных мембранах галобактерий по данным протонного магнитного резонанса./'/' Ж. физ. химии. 1994 Т.68. )Ю. О.1701-1708.

Б.Левин Е.В., Максимнчев A.B. Генерация .фототока ориентированными пленками бактериородопсина, нанесенными на полимерные мембраны./ Материалы xv научной конф. молодых ученых ИХФ АН СССР.// Депонировано ВИНИТИ от 16. 02. 1988 г. ;№ 1226 - В-88.

6.Левин Е.В., Максимичев A.B., Тимашев О.Ф. Фототоки в ориентированных пленках бактериородопсина, нанесенных но синтетические мэмбранн.// Тез. докл. 2 Всес. конф. "Возобновляемые источники энергии". Ереван. T.I. С.169.

7.Мах<м>уе1ют A.V., Levin E.V. Oriented Halobactaria purple г.ешЪгнп» Xilniss the role cf i>hswe boundaries in. bantsriorl'v-d'-pnin

•generated phot.ocurrent formation.// Int. Soo. Electrochemistry 37- tli Meeting. Vilnius. USSR, August 24-31, 1986. Extended abstracts. V.4-P.461-463.

' 8.Максимычев A.B., Левин E.B. Фототоки, генерируемые пленками бактериородопсина, нанесенными на проницаемые длл ионов синтетические мембраны.// Тез. докл. 3 Всес. конф. молодых ученых по фин. химии. Москва. 1986. C.I40-I4I.