автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.10, диссертация на тему:ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОБНЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИХ ТРАНСФОРМАЦИЮ ЛИПИДОВ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КСМИТЕГ РОССИЙСКОЙ ФВДВДЩИИ по шшасг ОБРАЗОВАНИЮ

Московская Государственная Академия пнщввых производств — — ----— _ — — — — — — — — — — — — — — —

• . На правах рукоишои

I, ■ КИШШИ Авва Юрьевна

■1-

I!

УДК: 663.152.311/043.3/

ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОБНЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ, ' ОСУЩШЛВДЯКЩКХ ТРАНСФОРМАЦИЮ лишда

Спешмишюоть! 05.18.10.- Технология витаминных .ферментных:

н ваяковых препаратов,чая а табака

^Автореферат

дкссертацнж на сохокание учвноА отепенж доктора технически* наук

о. . ,

Москва, 1995

Р*<Зота выломана а Мдосомкст Гооударотмыои Тшо«ропт . ■и. М.В. JOMOIOOOM * Шоммоко! Гоогдкротмшо* Uwwi ИИ«—И*

Ерй*Я»ОДСТВ.

ВфчязЛ шиоужюм» - проф«ооор,доктор вшматтеж м/к

SEOIOB B.C. ; ,

Офщмпще ошюяспы: |

PAÎH+доктор тшпмш ждук.профёооор , '

ГОШГ Н*В. .

Доктор ташпмшх UJI КИСЛУШНА О.В. ■ !

Доктор хшштышх lajt ВАРШРВ В.Д.

, Валу «а« оргмиашццц ВоароооЛшш* мучао-вдопдоммаомС

MOTjnjT BpUtttWt ОаОМХЮЙПШ

L - ■■ I

Заапв соотоято* декабря 1996 г. а 14 чмоа м

. Кении Спвцшиднромяшого Сомта I 0Ô3.. 51.03 Мооловоков ; ГооударотэваяоШ Ащми» шцмш црояжяодств до адеог* 125080,Повод , Володоммоков аооо» * П. .

G дяомрмцмв 1кш>6 омакоштыЧ! ш 0K3JUOTOK« NTAQQ. - А*гораф«рю рваоояа» ■оядрв 1996 Г.

г'".1;: '«мн» овхр*т«р» V .''i^V "V- ■

CnwuMJUsJtppsaaioro Совете, -'-¿r^ V-'ï- » • у; , «.т.е.,доцвя* :: - ßj^-^ Д.^.Кшом .

РГАУ-МСХА имени К.А. Тимиря«гз ЦНБ имени Н.И. Жданова I. ездя хшкштюрЙШ ^аучн^ли^е^ат^ы

Актуальность проблемы. Болыпой интерес, проявляемы?" к ферментам, осуществлявдим трансформацию лвдидннх прСщуктов» игракщм важную роль в процессах жизнедеятельности' всех организмов, связан как с фундаментальными аспектами, так в с высокой потребностью многих областей промышленности ^и медицины в ферментах атого опектра действия, а также-в продуктах энзиматяческиа превращений последних»

Быстрое развитие новых биотехнодогнйс использованием ферлёнтов, трансформирующих липиды, связано о юс широким применением в пищевой, кожевенной, пар^^мерной^текстильной, 'Хлебопекарной промышленности!,в производстве цопцих средств, медицине,, очистке сточных вод и др.

Открытие проотагландинов (ПГ) является одним из наиболее значительных событий 20 века, имеющих серьезное общебиологическов и прикладное значение. Получаемые отечественной химической промышленностью медкотнскяе препаратыПГ-водобннг веществ не обладают теми свойствами, которые присущи естественным биорегуляторам втого типа* Это определило необходимость ¡разработки технологии ПГ о использованием ферментов микробного происхождения. Однако, несмотря неочевидную перспективность а больше потребности медицинских препаратов о простагландинпо-добным действием, 'В настоящее время не существует производства последних посредством методов биотехнологии. ;

В этой связи большое значение в актуальность приобретают направленный поисквкаокоактивныс продуцентов,' ПГ-синтетаз, изучение закономерностей в регуляция их синтеза, выделения ферментов л изучение их свойств с цель» создания технологии,пригодной для промышленной реализации . ■ (|,, " " '.V-. .'» Наряду о этой проблемой некоторые отрасли промышленности,в чаот-нооти, гидролизное производство, кожевенная, чековая, яиршерерабатн-вадцая щкшышленнооть ис1тываюг недоетаток ассортимента диполитичео-ких феуиэнтов, хат&диэирущих гидродитмч&сковрйощвплбниб масел в жиров. Однако, несмотря ва крупные успехи -в втойобитоти ¿производство липаз ^ .наотояцее вреия в нашей стране?не налажено; *

В рвязи о етим болшое значенная актуальность приобретает выбор продуцентов липаз, разработка условий их культивирования, изучение закономерностей их биосинтеза,оекрецви о целые. создания техполопш.при-годной ^шя промшяенной роализапии.

; Длй изучения Механизма катализа с участием липаз,, а также при организации различных биотехнолоппеских-производств, чрезвычайно важно иметь выоокобчип&нные препараты липаз о определенной. спещфгсност ш. Для решения данных проблем актуаяышка яашшгоя исследования по пови-

\

шению выхода изучаемых ферментов путем воздействия нацеханиэм естественной секреции* разработке методов л схем очистки ферментов до ; гомогенного состояния, изучение структуры фермента и его свойств* Успехи в получения выоокоочищенных ферментных препаратов в Значительно!! степени связаны о разработкой в внедренной в Он отехнолргич'ескую практику высокоэффективных методов а4Фанвой хроматографии на биоспецифических сорбентах» Это позволяет устралить многостадийвость, и трудоемкость, увеличить выход с^ешюго ферввнта« . . .

Вахнооть биохимических и физшю-хнмических исследований диполи- : тичбских ферментов связана также о особым тало« катализируемых ими ' реакций. Липазы, являясь водораотвортшын белками, катализируют гад-. . ролиэ или этерифакацио нераотворишд в.воде субстратов, фунхцион?1руя на границе раздела 'липид-вода. Вследствие сложности физических уело- . вий протекания липолиэа наша звания особенностей рефляции1 атих реакций существенно отстают от тех, которые извеотны длй гомогенного катали за. Именно эти особенности лиложитических ферментов, таете-расти- . рение аспектов применения последних вызывает большой 'интерео в плане их иммобилизации на аерастворшшх носителях. ; V; ^ ' : г..

Решение всех вышеперечисленных зедачпутем разработки новых прогрессивных или кнтенсифиваади уже сущестнухщнх технологий для ферыэп-тов • осущеотадящих трансформацию лищдных проду ктов позволяет внеоти вклад в новые направления применения дд^тут ферментов, а также улучшить экологическое соотояние рада производств. О'ваиности и актуаль- ! ности проблемы свидетельствует также "я то, что данная работа является частью исследований координируемой Государственным коиитетои по высшему образованию международной программы "Пршиадвая биотехнология" (при-каа А 613 от 22,06.94), и то, что чаот* во'вшолкял'аоь а рамках со- , трудничества с Университето« Хоенхайм вШтутгарте (Германия),

Цель ^'вазюта нослёяовадин. Цель жоследованая заклшалаоь'в создании промышленной технологии получения препаратов ферментов.обладающих способность» трвнЦюрмировать лшшда, на' основе обобщения*теоретических и практических исследований по особенностям механизма регуляция их бвскдан1юза и севре^ч8тих фериен^,11йэ^о^'внсокоеффек- . • тивных способов их" ввделенйя и очистки, способов ^^мобилизации изучения фаэико-химаческих'и каталитических свойств/ а4 такжаих применения 'в различных отраслях прсмыолекностж. ; ■

Поставленная* цель достигалась' решеннш следуицих"задач: : ■ * офюшнг и селекция хфодуцёнтовферментов,'осуществляющих трансфорюшю лихщдов и их характеристика,

- опродалешю локализации исспкуеша ферментов в клетках' иаифо-оргапазмой, ■-...'-.'

- разработка технология ^льтивированяя продуцентов и ее оптимизация,

; - изучение особепвостей регуляции биосинтеза ферментов,тронсфор-Мирупцлх лищди» -

;, - разработка технологии выделения ферментных препаратов разной дтеяени очистки, ' .

/ - изучение физико-химических и каталитических свойств внсокоочи-Ьенных и гомогенных препаратов ферментов,

у - получение иммобилиэовшпшх препаратов исследуемых ферментов, изучение особенностей их ферментативного катализа и использование для Ьромшленных целей, г •;■'. . *

- разработка и внедрение эффективных режимов и технологий применения ферментов,' трансформирующих липидаые продукты в пищевой,кожевенной, меховой прсыншленноотях,для производства ШЗ, звероводстве и медицине,";

Надгчнад новизна

- Впервые а; стране найден продуцент феррита, осуществлявдегЬ трансформацию Гфахлдоновой кислоты в простагландины и ПГ-подобяые ве-деотва микробного происхождения с высокой биосиктетической активностью, ве уотупапцей известным источникам животного происхождения данного фермента.

- - Впервые имлунодатохиническим методом показана локализация липо-ксигеназы (ПР-синтетазы) в зоне цктоплазматической мембраны,установлена прочная свяэьформента со структурами мембран и клеточной стенки.

- Изучены особенности регуляции биосинтеза ферментов, осуществляющих трансформацию арахидоновой кислоты в простагландины. Впервые установлено,.что :обраэоваыые внутриклеточной липоксигеназы (ПГ-синтв-тазы) актиномицетом Stieptcmj/cti jphtwides Ш-2 контролируется основными источниками питания, которие составляют единый механизм регуляции биосинтеза этих ферментов - ыетаболитцую репрессию* Регуляторное воздействие рассматриваемого механизма проявляется науровне транскрипции. ;'.-*' ' / - , ■■ * ; ■ " '

На основании полученных результатов и данных литературы составлена модель механизма, контролирующего биосинтез ферментов, на примере протеаз и лшпо1есигвназы;(11Г-синтетаэы) , для мюфооргамизмов, в частности .для,?,^ , и&-2 , „ - , :. ,

. - IIa основании эксперииенталышх данных комштексиих исследошшяЗ разработаны условия культивирования культуры ästete Ш4 в

прошлая ешшх условиях с целью получения лгаолкхичоских форисктов.

- Разработана технология выделения" и очнсткп липазы, основа1 и гая

на простых и эффективных методах, которые позволяет получить'препараты различной степени очистки в промышленных условиях. ■!

- Впервые выделен а охарактеризован препарат гомогенной дишэы. Показана субъедашгшая структура фермента. Всесторонне изучены фави-ко-химические и каталитические свойства выделенной липазы.

- Впервые проведены' широкие комплексные исследования о прпвлечв-нгои химических и физических методов иммобилизации липаз. Подогревы в качестве сорбентов алдаосшшкаты в цесмштной форме о порами 60-вЭ А для эффективной ишойшгазащш данного фермента, повншашей их стабильность в отношении температуры, рН, улучшащей химические показатели.

- Впервые разработаны в теоретически обоснованы научные основы применения указанных ферментных препаратов в различных областях народного хозяйства: в медицине для получения лекарственных препаратов,со- -держащих ПГ-подобные в-ва и ПГ, в звероводстве, при производстве синтетических мошшх средств (СМС), пятновыводных средств, в меховой и кожевенной, пищевой отраслях промышленности. ' ;

Практическая значимость. Проведенные исследования яэшшсь фунда- . ментом для решокия народнохозяйственных задач по эффективному использованию ферментов, осуществлявдих трансформацию липидных продуктов, в отраслях промышленности. '

Разработана технология культивирования М8-2 - про-

дуцента ПГ-сштетази (А.с. Й 1472501 от 1989 г.).

* На основе предложенной модели механизма регуляции ■ биосинтеза вне-и внутриклеточных ферментов микроорганизмов разработана концепция формирования и прогнозирования метаболизма продуцента в сторону напрев- . ленного синтеза целевых ферментов. . .■ ■'

По результатам оптимизация биосинтеза протеаз и дипоксигеназы(ПГ-синтетаэы) в процессе роста стрептомгаата решены задачи комплексного , использования культуральной жидкости 3. йрЬегосаеь Ы8-2 о целью внде-, ления первых в опытно-промышленных условиях (А.с. * 579365 от 1977 г., А.о, й 97Э609 от 1982 г.). - •

Получен препарат ПГ-сиатетазы в нативном и иммобилизованном на мембранах ввде. .: . ' • ■. .

Показала возможность замены ПГ-сивтётагы животного происхождения на фермент данного .спектра действия микробной природы при синтезе ПГ.

Экспериментально доказана перспективность я реальность разработки * педучшияИГ с использованием микробных ферментон, а ¡также применение ЙГ группы ПГЕ^'и в звероводства. '

В результате лабораторных, стендовых и опытно-промышленных исследований разработана'технология получения липазы культурой 1414. Составлен и утвервден лабораторный технологический регламент,по

которому наработаны опытные партии фермента в ферментной цехе Голицин-ского института фитопатологии (положительное решение ва авторскую заявку от 2.09.93).

• Подученные данные положены в основу разработанного опытно-промышленного регламента производства Липоризина ГЗХ, внедрение технологии которого осуществлено на Бевдском химическом и Приволжском биохимическом заводах. Разработаны и утверждены технические условия на опытные партия Липориэина ГЗХ,.

На основании имения свойств промышленных препаратов Лдаорнзин ГЗЗС выявлены высокая липолитпческая активность, рН-стабильность и тер-моотабилъность препаратов, хорошая совместимость и стабильность юс в сочетании с основными компонентами СМС, Это позволяло выработать рекомендации при разработке энзимсодержащих рецептур ШС, обладаниях высокой вффектианосты) приудалешш загрязнения (на 25-30^).

Разработаны и рекомендованы условия использования Липориэина ГЗХ в составе чистящих препаратов. Получен высокий эффект мойки и обезжиривания загрязненной шерстяной ткани.

Показана эффективность использования мощих средств с Липориэднсм ГЗХ в своем составе в рыбоперерабатывающей промышленности для мойки коптильных подносов, позволившая сократить энергозатраты и улучшить окологнческую обстановку предприятия.

Разработаны условия использования ЛипоризинаГЗХ в технологии обезжиривания овчин.и ножевой основы.

• Полученные результаты создали предпосылки для разработки новых направлений по применению л аполитических ферментов в пищевой промышленности, ' а именно колбасной производстве при обработке кишечного сырья: Предложена конкурентоспособная новая технология обработки кишечного сырья. Гистологическими исследованиями тканей кишечного сырья, обработанного традиционным в ферментативным способами, показана' эффективность последнего. На разработанную технологию шмучен патент,приобретенный Воронежским мясокомбинатом (патент Зи X 1833145 АЗ). .;

-Теоретические положения данной работы используются в учебных кур-са1"Шсш1ш^ческие ооновы биосинтеза биологически активных вощеотв" и "Биохимия мамщтаагохнрья^г.чит^емык автором. Методические __ приемы .отработанные в процессе научных исследований, систематизированы,и зданы ■ отдельными сборниками и используются в учебном процессе. -

Апробация теботы. Основные результаты раооты докладывались и об-'суздались на следухидах съездах, симпозиумах, конгрессах,конфвронпляк я коллоквиумах::'Республиканская научно-теоретическая конференция моло-Д)к ученых мякробиошгов (Тадкент,I37о,1978), 6-я, 7тя конференции ыог лодых ученых Латвийской республики отд.ШОЯ (Рига,1977,1980) ,7-Й съезд

Всесоюзного шкробиологического общества (Алма-Ата,1905), совещание "Ферменты микроорганизмов" (Москва,1905), Международный симпозиум по хроматографии (Будапешт,1086), Всесоюзная конференция'"Методы получе-шя и анализа биохимреактиаов" (Рига,t962,1967), УТ, УН Дунайский симпозиум по хроматографии (София,1987; Лейпциг,1989), Всесоюзная конференция "Микроорганизмы продуценты стимуляторов н ингибиторов роста растений в животных" (Ташкент,1989), совещание "Применение хроматографии в пищевой я микробиологической промшиленноотях и медицине"(Москва, 1990), Всесоюзная научно-техническая конференция "Совершенствование технологических процессов новые видов пищевой продукции и добавок,использование вторичного сирьяпищввых ресурсов" (Киев,1991) .даучно-практическая конференция ученых в решении социально-экономических проблем страны (Ташкент, 1991), совещание "Прикладная биотехнология на порога 21 века" (УоскваДЭЭб), Международная конференция "Научно-тех-кический прогресс а перерабатыващих отраслях АПК" (Москва,1995),

Публикации 1 По материалам диссертация опубликовано 59 работ в отечественных и зарубежных журналах, в материалах Международных и Всесоюзных съездов,1 конференций, симпозиумов и конгрессов.,Подучено 4 авторских свидетельств я патентов и I заявка на выдачу патента имеет по~ лоЕитольное решение Гсюкомизобретений. " *

Основные положения. виносгаме на защиту:

- скрининг и повышение синтетической способности путем естественной изменчивости л регуляции биосинтеза микроорганизмов -продуцентов ферментов, осуцествлявдих трансформацию дипидов, а именно лвпоксигена-эы (ПГ-синтетазы), липазну

- технология культивирования продуцентов ферментов единого спектра действия» внедрение предлагаемых технологий в'промышленность; .

- технология выделения я очистка {получение фе^ентных препаратов с различное степенью очистки -ГЗХ, ПШ-Г25Х) препаратов ферлентов. Характеристика юс. свойств, субстратной и позигокшвой специфичности. Получение гшогенной лшщзы ^/^^ас Ш4,иэучение.структуры фермента;

- реализация новых биотехвологических процессов к разработка новых технологий « использованием выделенных фер<ентов (синтез ПГ и их применение в звероводстве, гидролиз липвдов в моховой й кожевенной промышленности, при изготовлении колбасных изделий, при производстве CMC И ПЯТНОВЫВОДНЫХ средств). V - о: V-;''* .**.■.

Объем и етттукттоа работы. Диссертацая состоит из введения,обзора литературы, экспериментальной части, вклгяащей описание материалов и методов, а также изложения результатов и их обсуждения. заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложения нормативно-технической документация и актов испытания.'Ниже представлена структурная cxoi.n направлений научных исследований.. .

■ | Скрининг и селекция продуцентов ферментов [

Изучсиис Ьиосинтем н мпаниш регуляции синтеза ' ■7 * ферментов, мх лошимцип» и секреция.

Т

Разработка пгтогои культивирования и ее оптимизация I

режя и питательная темлератур-ный длительность

аэрации ' посевного среда режим культивирования

материала

внутриклеточные ферменты

Разработка тнолоши выделения и получения препаратов с индексом ГЗХ. Г10Х. Г20Х

Г Кон центрирование

I !

Ослядонне

I

Деградация биомассы

Высушивание препарата

' Разработка технологии вытлмчищашых ферментных препарат

Кокнообмен-на* хроматогра-фн д

Металло-хелатно-вффнк-на« хромагогра- фнд.

Гель • фильтра* пня

Пхжпектрофок уенров»

нне_

Электре форез

ОКСИГу»Д7лЯ .

мработка технологии нммоФклнзашш

Характеристики свойс!» ферментных препаратов и гомотнгых ферментов

нетнческие

Фнэиолого-бнохиын четкие

Каталитически«

Чй

шичеекке

| Ферментативная трансформация лнпндов ^

* *

I 'пароли} Перс-этермфи каине

С'НН№ Коже-. Мело Мясо- Мищсеця скикз

1НЧ0С- ренная вал перера- промыш- носков и

кие иро- нро- батыва- ленность другнк

мокяцие МЫШ- ' мыш- ющая соедине-

ва лен-ность яен-ность ПрОМЫШ] ЛСН MiH.lt ний

V Псрскнсное

ОКМСЛСНМС

Зверо- Меди-

водство цина

Структурна« схема наираплешш научных псследошииш.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1

В настоящем исследовании разработаны теоретические.и практические основы применения ферментов, осуцествляшцих конверсию лшщдного субстрата. Исследования послужили основой для создания отечественной технологии липоксигеназы с помощью селетсционированного штампа Spit -•tcicfes К0-2, начиная от поиска продуцента, разработки условий культивирования и выделения фермента вплоть до изучения ого свойств и ас- . пектов практического применения. ! .

Полученные результаты также явились фундаментом для решения научных и народнохозяйственных вадач по эффективному использованию липоли-тичсского комплекса ферментов в мясо- и рыбоперерайатыващей промышленности, при производстве биоактивных СУС, в маховом и кожевенном производстве. "

Разработки завершены внедрением научно обоснованных, режимов применения Ферментов, осуществляющих конверсию лшодного сырья в; промышленность. Экономическая эффективность от юс внедрения составила свыше 45000 долл. в год.

2.1. Материалы и методы ,

В настоящем разделе приводятся методические подробности проведения экспериментовскрининг продуцентов и условия культивирования активных штаммов, условия хранения последних, сезонная и естественная изменчивость исследуемых микроорганизмов, выделение и очистка 'ферментов, исследование их методами белковой химии, биохимическими и иммуно-логичзокъми методами. Описаны"методические приемы изучения механизма, действия ферментов с использованием метода жвдкостнб-сцинтилллшонно-го счета. В работе применены общепринятые и спвциальш.з физические. Физико-химические, химические, биохимическио, микробиологические.органе« оптические методы, в том числе хроматографические, электрофоре-, тические, спектрофотометрические, колориметрические, полярографичес-' кие, ультрацентрифутировакие, электронная микроскопия. Подробно описаны разработанные наш синтез и выделение простагландннов. Приведены методы, оценивающие возможности использования ферментов в различных отраслях промышленности, а также эффективность их применения. '

Статистическую обработку полученных экспериментальных данных про- • водили с целью определения однородности собранного материала, его достоверности и точности о позиции принятого уровня значимости*. Непо-, средственный обсчет числовых массивов осуществляли на^ЭВМ IBM PC/AT 3L6 о использованием TxpQV$ai.tmnCimca.cf ".СCfiemstatio/тЗ 'Хьюстон,США).

2,2.' Результаты исследований по лвдоксигеназе и их обсуждение

2.2.1. Скрининг и селекция культур - продуцентов липокспгенаэы.

Интерес к микроорганизмам, синтезирующим липоксигенаэу, велик и вызван большой практической значимости) »того фермента. Сведения о синтезе липоксигенавд микроорганизмами очень ограничены, что вызвало определенную трудность в первичном отборе продуцентов. Объектами исследования служили 269 штаммов различных систематических групп микроорганизмов, полученных из Всероссийской коллекции мякроорганизмов(К-СМ РФ), коллекщш микроорганизмов отдела почвенных микроорганизмов Института микробиологии АН К>, коллекшш, микроорганизмов кафедры микробиологии биологического факультета Московского Государствшшого Университета им, М ,В. Ломоносова, коллекции микроорганизмов кафедры Морской микробиологии Одесского Государственного Университета. В результате нескольких этапов' скрининга продуцента лшхокснгенаэн из дальнейшей проверки'исключали около 84? штаммов. Отобрашще активные штаммы микроорганизмов проверялись на способность образовывать липоксигенаэу в условиях глубинного культивирования (рис.1). Следует отметить,что не всегда найшодадась корреляция между величиной зон гидролиза на плотной среде и активностью липоксигенаэы, синтезируемой культурой при роста, на жидкой питательной среде. Возможно, положительный результат при качественном анализе в некоторых йлучаях объясняется действием носдеци-. фических липоксидаз, . V' * -

* Способность образовывать липоксигенаэу характ ери э овали по накоплению липоксигеназной активности пггомлаш, проверяемыми на втором этапе скрининга, в'динамике, т.е. через 24,48 и 72 часа с начала культивирования микроорганизмов на средах различного состава, В результате проверки отобрана культура $. $рЬв\мс1е$ как продуцент лапоксигеназн.

Изучение естественной изменчивости культуры подтвердило шоние (Кузнецов,1975) о значительной вариабельности актиномнцетов. Показано, что поцуляция включает три типа колоний. Кроме культу-

: рально-морфологичееккх отличий, существует значительная разница в уров-■ не синтеза этими вариантами культуры липоксигеиаэн. Установлено, что наибольшей активность» обладает вариант "палевый*' (Крмвоаа и др., 1989) (рис.2). Особое внимание нами било удалено экспериментальному обоснована» способов хранения культуры-продуцента. В результате рекомендовано хранеше до года на агаризовонной среде Чапека с Глюкозой под слоем масла при 4°С или без масла при отой ко темпе' ратуре. Установлено, что для более длительного хранения целесообразно проводить лиофнлизашю культуры.'

..до

1 м I ti

Г

Cl

f"

I to

9

I « I so

Д n

I HASH

arms " íwkwM tfùt.mi *

: cpygftíti ' T.P.emfl/nostM (редаГИП ' B.Gumiqg.eeÁim/' ¿НаШ'Я&г. <ШМ!/<//$

: q>W*u£z МЛатмшн

uetéfindt ifíi-

шж

J»

...... « ЬМктш-

ftútttiAtt '. Щ цщ ¿tJ

ивтцмниг WVnr Qw^pa

A«. < Jjfw/t/e Sin синтеза

Ave. г. Bvy колонии „палебого" iapv лнта S. spbewicfes Ш-2

s i

A«. 3. Локализация- мтаксигеналы

(v«My ноцито X имо v е са: и v werotf) ____________- ■лгтохсиг» naja

Естественная изменчивость адтиномидота была использована в солон -щи продуцентов липоксигеназы. Последовательный отбор вариантов на питательной среде Ваксмава кукурузной Л 2, в наибольшей стосшш вшш-ляпдей изменчивость культуры со морфологии колоний, позволял выделить вариант £ $р&СХ*{с/е£ 118-2, продуктивность которого на 302 выше, чем у исходной культуры. Охарактеризованы культурально-морфологаческие в фиадолого-бнохнмические признаки вгга&ма (А.с. А.1472501 от 1968 г.). Предложена схема отбора активных продуцентов липоксигеназы для данного актиномицеха. Стабилиэирулций отбор основных вариантов из поцуля-цаи продуцента по разработанной схеме можно рекомендовать душ исполь-' эования в постоянной роботе с промышленными штатами акпшемицетов -продуцентами ферментов. , в

2.2.2. Исследование процосса биосинтеза липоксигеназы

" Из литературы известно, что дипокенгепаза црокариотных мшфоор-ганизмов в основном является внутриклеточным ферыентом и извлекается из. мембранной фракции мицелия актиномицетов ( Надав (£ л/. 1988; Нехмап аХ. 1987). Было установлено, что основная часть активности била сосредоточена в мицелии и совсем мало (2-3?) в фильтрате культуралыюй жидкости. Эти цифры ^бьия многократно проворены не только на ¿ркг-Ъо*с/еь ДО-2, но в ва других, монее активных продуцентах. .

Лмцуноцйтохимические исследования по определению локализации да-поксигеназа в мдйвлрпи •!>■ зрбеш'Ж* М8-2 проводились совместно с . ВНИИ технологии кровозаменителей и гормональных препаратов. Одним из контродой"Сиецв$ичности цитохимической реакции сдухида культура, не обладащая липоксигеназной активное»». Еа рис.3 представлено распределение окраски, выявлящой локализацию лшююсигенаэи. Окрашенный слой в^ зоне цктопдазмзтжческой мембраны обусловчоц присутствием липо-: кеигеназы. Цровеяенпое нммуноцитохимяческое исследование также выявило наличие прочной связи фермента со структурами момбран а клеточной -стенки, т.к. жесткая обработка клеток' высокими концентрациями детергентов ва высвобоадает липокекгеназу из этих'структур, а - ; : < Ва синтетической питательной среде, содержащей в качестве основных компонентов глгкозу, натрий лимоннокислый- 3-х-замацошшй, аммоний сернокислый, установлены общие закотоьюрности роста культуры и биосик-.теза фермента.' Определены параметры цре .еосг биосинтеза липоксигеназы: ; возраст - 24 ч, доза - 6,0-7,вегетативного посевного материала,начальное значение рН питательной ореды' - 7,СК7.2, температура- 2в-2Э°С, : интенсивность аэрации - К^ » 432 ч и длительность культивирования -72 часа. • • • . '

Нами показано, что регуляция синтеза лнповсигеназы связана опосредованно с качественный я колнчоствешшм составом ширину кислот в мембранах клетйй аютгаомвцета. иаксималъвое образование целевого фермента приходится на 72 чао роста продуцента, т.о. ва "стационарнуо фе- • зу развития кшкроорггщизиа. В откг условиях в жирнокислотаой фрокшш значительно возрастает содержание аалпнвнасвденшсс кислот, параллельно с этим состав ОбщеЗ лзпшдноИ франция по содержании я ненасыщенных кислот становится. Оояеа сбалансированный (К*1.48)(табл.1). Культура зрЬехо1({и ШЗ-2 наряду о лидоксягеиазой образует зкачи-теишгав иоигеества протеолитлчоскях ферментов о фябршгадитичвстши -действием. Учитывая этот факт в то, что липоксягеваза является эвдофер-ментом, в отлнчяе от протеаз, которые являются вкэофорлентаыя, вкопош-чесна целесообразно было разработать технологию совместного пояучеянл этих препаратов: из биомассы получать лиооясигвназг» 'а аз фильтрата культурольпоВ жидкости - протоазн.

Таблица I

Зирнокислотный состав обвей лшшдно м/ле$И8-2 в процессе роста

"от о<5деИ сушш XX)

Еирные кислоты

Оазн роста культуры

-е-«««! вкспонен-!

сташо-I важная

С|д;0н1-трддв1!ановая с14": 0 ~ «нриспиовая с15:0 ~пеатвдекановая

"16:0

- пальмитиновая

с14:1 ~ Д-^втрадецен-9-свая С18;0-стеариновая - ' 1 ■

-' шльнптолеиновая С10;1-олеиновая

^10:2 — линолеоая С^о-З - эйкозадиеновая Сзд.з -эйкозатриеновая - арахщоповая ' .5 - доко задеитаеиовая ' СаО:Б - Двкозагексаенооая % нонасадсшшх тарних кислот % насыщенных жирмос каслкг % п алии в] гасшцеге ияс отрних кислот К - тсящетше/ненасщеншо

10,9 8,6 6,2.

16,1 15,0 14,2 .

6,4 5Д ; 3,5

24,4 18,7 13,0

0,5 1.4 2,1

12,0 16,0' . 19,8

9,5 14,2 18,7

-4,4 . 5,3 : 6,0

2,2 2,3 2,6

2,4 3,7 4,8

0,5 0,4 ' 0,4

0,5 0,8 ^ 1.2

0,2 0,8 : 1.5

од 0,4 , - 0.9

20,3 29,3 38,2

69,8 63,4 56,7

5,9 8,4 ;.19.5

3,43 2,16 1,4В

90,1 яг,7 . 94,9

—" ■ -.....——.....Та&шщ 2

ЛинаЯвце уроавензая репрессии виосиятеза ферментов г статистическая оценка результатов 8КСИерИМ9ВТОБ

Ваименоваше ферюнх&'пшнык активностей* яадяшщся объекте« ошим^^ СЕЯ £00- произво- ДШОСТИ среднего , значения выгода . 4 Ягою ' СТВП&- ней свсн5ода : {>' Довери-твльнш интервал коэффициентов и Две---порой адекватности Адекватность

ФибринолитичбСкйя активность, ккг тирозина вд к.х.*час * 1092 -ЗаГ^+2СЙ2 -ЭТ,21з -' -19Ш4 +122,«5 25511,0 "31 - 78,0 52923,0 +

Лжоваггеваззая активность, нШг « 2Д4- 0,0032X2 +0,1057*2 --0,033213 - 0,075214 + 0,31715 0,0398 30 ' 0,1011 0,0699 + .

да ш&тгтаго 8кстрвкта«кин

КазбЖыТОическая активность. . »ост Ъятюзина - кд к.х.'час « 2735- 43,61! -1ЭМ2 - ■ : -149,5X3-75514-142X5 235856 ■ ■ * 30 247,5 995444

Соотношеш активностей фершнтов, ■ ■■ ■■ * ^ипоксигеназная казеинодитячаская - 0,442 - 0,009%+0,0342X2 --0,015X3+0,044714 + 0,008515 0,003 29 0,029 _ 0,0053 +

* Факторы, ажящие на процэсс: 11-(ЛН4)2 $04; \ -соевый экстракт, Хз'-К&ЭД; Х4-М|5р4; ■ ' - ' 1д-глюкоза ■ , '

Рис.4

аст$нш тт- .

латыш

винной

£ процессе раста лшШ>о-. 'шонима. : (Мшочмих: 1- Гммасеа, 1-актпц{нкть липекеиинв--лм,

3 - КвимЧёстЬ.

4 -рЙ

"г? л* "XV

Вмтеммоеяй. • •

Поэтому оотшизйЕВя состава питательной среда для Ш-2 проводилась не только о целью увеличить биосинтоэ лкпокситеназы, по и с учетом образования ахтшюмицетом протеаз (табл.2)(А,о.№ 579305 от 1577 г.). Оптимизация состава питательной среда позволила знача- ч. только повысить бпосиитоз липоксигеназы на фона,увеличения слсжвого комплекса протеаз с коэффпцаентом корреляции 0,80. В результата опта-;. мизащш в 1*5 раза повысилась способность ахтиномицета синтезировать ' балок, а также были установлены оптимальные соотношения основных ком- ■ 1Ю1ШНТОВ питательной среды, ©беспочлаащи« уведичеима синтеза дшохса-г&»аэц в 3 раза, чаи на исходной среде. Изучеиц закономерности измене-кил основных, показателей развития $, зрйеЫ&з Ы8-2 на оптимизировав-' ной средо (рис.4). . ■ ;.''■'■' -Ч*:: ■"*

й.й.З, Некоторые биохимические особенности липоксигеназы ';

Иерегатсиов'окисление лшщдов в биологических мембранах вяля«. на 4 «:и1аг.оГ1Г1сску» активность клетки; оно такие необходимо длянордадыю-14/ :.: ото„'11ит биосиптеткчсских и биоэнергетических процессов. Накоплена. : пщройорекмашх радикалов н лишщноЛ ¿азо мембран вызива-

ет увеличение их прошдаемосги для ионов. Показано, что иош меди,железа, цинка в олова значительно ингибирутот синтез и активность протсаз в лшоксиганазы. Ионы бария, кобальта, магния, марганца и кальщя оказывали стимулирущев действие ка накопление ферментов. Такое воздействие ионов металлов связано с частичной дезинтеграцией, игращей существенную [роль при самосборке в обновлении мембранных структур клетки. Изменения количества перекисей лшвддов, накапливаемых актшошце-тш в процессе культивирования, тесно связаны с процессами прироста биомассы продуцент. Уыеншение скорости образования шцеляя в культуре. актнномтоета коррелирует о усилением сво боднораднкального окисления лшшдов и накоплением в общей липидаой фракции микроорганизма перекис-ных соединений, способных быть физиологически активными. Такими фнзио-логоактнвныш веществам? лишщной природы могут быть простагландины, лейкотриены в тромбоксаны, а в основе образования всех этих веществ лежат фермент липоксигеназа. Нами идентифицированы продукты трансформации полиненасыщенных лирных кислот продуцента собственной лгагоксиге-назой. По результатам ТСХ, ИК-спектров, биологических тестов, а такле по результатам идентификации продуктов транофорьшш лшоксигеиазой

М8-2 арахндоновой кислоты с использованием радиоактивного метчика Рн п ВЗШС можно утверждать, что в наших опытах ми имеем дело с ПГ-синтетдэоЙ - вероятнее всого с комплексом ферментов, отвеча»-вим за образование циклических перокисных продуктов лишвдюй природы -проотагландинов и простаглащшноподобних веществ (рис.8).

. 2,2.4;'Некртоше закономерности биосинтеза лдаоксигеназы I; и гфотеаз культурой Л Ш-2

У М8-3 значительное увеличение уровня синтеза лило-

ксигоназы. наблюдается в переходный период от экспоненциальной к стационарнойфазе развития, т.е. ближе к 70-72 часам роста стрептомицзта.

: Такого рода наблвдения дакт основание высказать предположение, что существ еннымифакторами, определяющими уровень биосинтеза липоксигеказы, является ¿рбо тесная взаимосвязь этого фермента с возрастным состоянием микробной клетки (с конститутивными процессами в клотке), либо это связано о дэыенеш1ем состава питательной среда, т.е. с наличием определенных соединений в среде в т.д. В результате проведенных исследованийустановлено, .что 72-часовой мицелий актикомшета, для которого характерно интенсивное накопление внутриклеточной лгагаксигеназы, а такие 24-часовойыицелий, где уровень данного, фермента низок, посла перенесения на свежую среду почти не синтезирует указадвшй фврмоит в первые 10 часов Срмс^ба). С другой стороны, «ицолий шеткномжета (условия ростааналогичны'вышеприведенному''эксперименту).переносили в питатель-

те*

I

1 J

ntJit), e/ttuvpuwtb* fíreb*

iUjL

ПГР,

x*t

система*,^

Hi

/7Г£

Распределение pagua mt/OHOcmu продуктам деградации ли-арахи-доыаьой кисеты ute-

аналша

«Г«

spherd iete$ MS

i I

<5

■V "У* МММJT* 9 . . . . , ' M 4)

/ * -Ï + J ■4* Í' KÛHTFOAI / i ¿~i í " f k л 4 s ) i S ¿ i f £ 3 * S X Ц -i л i. -

¡3j itf €* e с

B3XÁ

» г „ й * Ii "

/

Sel j

wpmt$onv*, мш

Щ*нтификацил *родгк* • tmS трамсформации apa-, ги$вна(ву каелвти ферме' HTrioHu S.&ßftezouies

гемьгяты апРошцчи лр*яа/н щ*нз ovojoiu4ec.f<oto гтг*спто, аУюнчггмот мидели ¿«uta ¿.stfrmVtt $ Ллыа/гт TCH (ЛГ-nagtfMHt ttvjttm?* )

Рис,5 Идя+гтифика-цил. трансформации

OüSMoitirvt tog tux: '.

< ' Vtjulvl ЯТНГТС ODOJOlwwtJ

■■. trpvfeù/¿t« t-rtrvetrtomo* JnutmiffieM'

Обозначены xtruUm ;

i. Нонтродь(среда 1л-тп очника yijyoQa)____

w n U « fit D дип) ejHtctnb. Me Рис. б Зобисиловть Гиосиитеэа льпохсхненазы от boipacma ^ииувлиа

-а i

С » « и 1* Dj-uTnejibMocrtiw,?!!*! „

Рис. 7. Ви-мЛяив на ç'uocuHTej jumoxcureuMW S. iphtioldûipi-Z UHfitSutnopoo и субстрат о 6.

пуп среду, & которой в течение 1,2,3,4 суток проводилось предварительное выращивание того же продуцента. В этой случав актиномицэт продолжал накапливать липоксигеказу о большой скоростыо (рио.бб). Полученные данные показывают, что способность актиношщета сшгтозировать дшокси-геназу не зависит от возраста мицелия, а определяется иэыенящимся в процессе культивирования составом питательной среди, который является функцией роста микроорганизма. Внесение в 2-х,3-х,4-:г-суточную куль-туралъную жидкость источников углерода,азота,сери (глюкозы,(КН^)^ SO^j MjS04>, которые истощаются в процессе предварительного выращивания ах-тиномицета, приводит и прекращению синтеза липоксигеназы отмытым шце-» лием.

Полученные результаты не исключают возможность иидуцирущого воздействия на биосинтез липоксигеназн веществ, которое накапливается в • культуральной жидкости в процессе роста актиношщэта, я указывают на решаадую роль в регуляции образования липоксигеназн основных источников питания. Установлено, что регуляция биосинтеза лтюксягеназы куль-, турой 5. spheroidei ш-2 осуществляется наличием в среде легко иетабо-лизируемшс источников углерода, азота и серы. Очевидно, здесь шеет место едиша механизм воздействия, которые можно отвести к метабояит-ной репрессии* Работами, проводимыми па кафедре микробиологии МГУ им. М.В.Ломоносова о культурой £, spktioides Ы&-2,показало,что контроль биосинтеза протеолитичесних ферментов также осуществляется мотабодит-ной репрессией (Кривова.ЮТа; Кривова.ЮТб). Характер регулирования биосинтеза протеаз и лилоксигеназ, возможно, и отличается по своей сути, но прослеживается очевидная зависимость накопления ферментов, обусловленная не модуляцией ферментов, а Функционированием механизма ре-* гулянии. Синтез ферментов у микроорганизмов может контролироваться кац на рибосомальном уровне, так и на уровне транскрипции* Чтоб« выяснить уровень, на котором метаболвтная репрессия воздействует на синтез липокснгеназы (для протеаз доказано, что это действие осуществляется, на уровне транскрипции (Иваница,197В; Егоров,1978) ), бшщ предпринята по* пытка подобрать минимальную бактеряостатическую концентрацию антибио» тика акгакомивдна Л, при которой автиномицет прекращает синтез ввфорч мационной РНК* Оказалось, что актиномигот Д spa концентрации ISO мкг)^ полностью подавляет включение 14С-урацила в молекулу гак. '

Используя'способность автикетаболита В-азагуагагаа варутзать травр . кришшю, установлено, что.и-РНК липоксигеназы $. spfteiotdts Ы&~2 агпц оительно стабильна, lis рис .7 видно, что пул н-РНК способен поддержи-« вать синтса липоксигеназы в течение 8 часов. Характер кривых торможу» ния бяооинтеза липоксигеназы отдельно антиметаболитом ж лимитирухщиц субстратом и одновременно В-азахуанином о субстратом идентичен. Следд.

вателыю, место приложения изучаемого регуляторного воздействия субстрата на биосинтез липоксигеназы лежит на уровне транскрипции. С использованием 14С-валина в бантериостатической концентрация циклогексамида-10 мкг/мл ("включение" белкового синтеза) показано» что лапоксигоназа синтезируется и накапливается в клетках. Если принять за 100? общее количество липоксигеназы в культуральной жидкости, то на доле внутриклеточного фермента приходится 60-95? от общего его уровня, что сот отавляет ¡1,5-^1,7 ед/мг белка.

В результате анализа полученных данных встает вопроо, каким образом информация о наличии в среде источников углерода» азота, серы, а также об,их дефиците ^передается из среды на генетический аппарат клетки я что служит физиологическим сигналом "включения* и "выключения* сиотемы синтеза внутриклеточной липоксигеназы.

Для ферыентов по некоторым косвенным данный для изучаемое культуры микроорганизма и согласно данным литературы, (Беэбородов, 1994)выдвинуто предположение,! что одним из звеньев в цепи передачи информации /служат свободные внутриклеточные аминокислоты.

Как показали результаты анализа, уровень пула свободных аминокислот £ ¿рНпоС</е$ Мв-2.достаточно лабилен. Дефицит источника азота в^ ореде приводит к значительному уменьшению аминокислотного дула, а вид: оение (Ш4)гНР04 через чао инкубации полностью восстанавливает пул амшюкиолот до исходного значения. Такая закономерность наблюдается ■ доя большинства аминошсл^т. Пул глицина, валяна, жзодейцина, лейцина, тирозин^ и фениладанина восстанавливается только через 4 часа. Интересно отметить, что содержание в пуле пролива независимо от наличия или отсутствия яоточнкка0азота-постоянно возрастает. Аналогичный характер волнения уровня дула свободных аминокислот у изучаемого орга-: няэма наблвдаетоя при лимитации источником углерода* Внесение в среду,

лшенную.иоточшште-углереда гллкозы и соевого экстракта а течение ' ' : 2 часов восстанавливает уровень большинства аминокислот. В условиях дефицита 'серы уровень большинства аминокислот в пуле остается постоял' ным 1иш несущественно уменьшатся. Значительно уменьшается лишь уровень метионша .иистекши Внесение источника оеры (М^104) приводят к восстановлению пула последних. '.'■"■'

^ V Следует отаетить.что циклический аденозин монофосфат (цМ®> не снимает полностью действия метаболиткой репрессш. Яо-видимому, меха' низм контроля* в . этом случае отличается от мекагшзма катаболитной реп. . . реосии. Другими словами, явления, доказанные для бактериальных культур, ■ : а именно, что: 71) пАШ, добавленный к бактериально! культуро, растущей на глюкозе, заметно.повыоаот.скорость образования чувствительных к ка/ таболитной репрессии ферментов и влияет на синтез других Ферглонтов и

общего бедка;

2) скорость синтеза катаболитных ферментов прямо коррелирует в внутриклеточной концентрацией цШФ; !

3) дерепреосируодее действие цАШ строго специфично, что не является характерным дои культуры 5. $рНе 14Л18-2.

Если допуотнть предположение, что пул фосфорных соединений (АТФ, ц-АШ) все же участвует в регуляции образования липоксигеназы, то этот факт должен бить связан с уровнем свободных аминокислот. Следует подчеркнуть, что динамика истощения и накопления пула аминокислот находится в зависимости о динамикой биосинтеза вкзопротеаз (КривоваДЭТб)

я дипоксигенаэ.

Для выяснения роли соединений, содержащее фосфор, нами проведены следующие испытания, аозволящие говорить о связи биосинтеза липоксн-геназы и протеазы о уровнем АТФ и ц-АШ. При переходе в пост-логарифмическую фазу роста продуцента в среду .вносили ц-АЬВ в количестве 0,0016-0 ,ООЩС от объема средн.'В течение первых 2 часов после введения цикло-нуклеотида у культур» практически не изменяется общий уровень накопления лмлоксигеназн, причем количество внеклеточной липокси-геназы увеличивается на 15$ за счет соответствущего 'уменьшения последней внутри клетки. Возможным объяснением етого явления может бить связь его о изменением проницаемости и структуры клеточной стенки под действием Сахаров, которые контролируются уровнем ц-АШ. При увеличении акспозицки культуры с ц-АШ биосинтез протеаз и лшоксигеноа интенсифицируется , что также указывает на возможную регуляторную Функцию ц-АШ при биосинтеае етгх ферментов. Добавление к растущей культуре нухдеотидов, таких как АТФ, ГИ, приводит к аналогичным изменениям в метаболизме актиномицета, что, по-видимому, связано о тем, что уровень ц-А№ в микробных клетках обусловлен регуляцией синтеза в актпэ-ностыо ферментов аденалатэтхдазн, катализирувдей реакцию АТФ ц-АШ ——ФЬ, и аденилатфосфодиэсторазн, участвущей в деградации ц-АШ со реакции ц-АШ —— А№>. Реакции взаимного превращения адениловых производных постоянно протекают в клетках микроорганизмов,. что указывает на большое значение условий роста микроорганизмов и, вероятно, это связано о депрессией синтеза многих ферментов с помощью ц-АШ (Аота-пович,1979). ■ ■ .'

На основании полученных нами результатов данных литературы (Боаошски,1987) составлена гипотетическая модель механизма регуляции биосинтеза внеклеточных протеаз и липоксигевазы (рис.8). .

АШ

прат, —кома

I ■пурх&а m i

X'ацетил'- Ко А )-—

—аминокислоты |

if/epuve кагдвтЫ

tà

«• РНК tupf а -

зс

Г РНК

рРИК

Ж.

Ж

ТРНК рРИК

ж

tí* РНК - tmßV

M-riiH.

ф Kmo/oklt инициации I '

f T-

peo mtas и

J-

] [

uttn«*cvttn<no\

■■ n

« w

I»' i '' 47

■ J £>

* Í-^ z-

:Puc,S Модель механизма pe-гуляции биосинтеза протеази ^ипоксигеназы у мхроорелнш-

; Aû $

i

I

Рас. 10 Влияние прост• • ?ландино6 на отыюдо-гборъние но ран,

а) прост a. tu он Qu мы, now ям**мь>* традиционным ело-

СО&ОМ, > -

8}г*реегля***омри£?ы ftotitf-чёмные с

nr~evHm*ma*ht ut S.tpbc-roid*s мм-я. - -

XOMTPOJb Буш wwn

2,2.5» Модель механизма регуляции биосинтеза . ' ' ■! протеаз и липоксигеназы Л ¡рпешаей М8-2 _

Установлено, что Н-фактор в первую очередь активирует фермент,ответственный за синтез ц-АШ, который, в овою очередь, контролирует активность других ферментов. Контроль через образование ц-А№ часто осуществляется благодаря аллостерической активации* Повышение концентрации ц-АШ свособотвует активации биосинтеза такого фермента,, как протеин-киназа. Суммарный эффект РО^/ц-АШ сводится к повышению скорости накопления в конечном счете такого соединения как пируват. Пируват способен превращаться в ацетил-КоА. Ацетил-КоА связывает несколько метаболических пут^й, определенное его количество используется в метаболизме липидов, доказана его тесная связь с циклом лимонной кислоты. Показана связь хатаболических и анаболических процессов цикла лимонной кислоты о метаболизмом аминокислот. Эту связь можно проследить по двум сяедущим процессам: I) включение в цикл лимонной кислоты части (иди полного) углеродного скелета почти всех аминокислот в ходе иг* катабо-лических- превращений а 2) вывод из цикла лимонной кислоты углерода .в виде интермедиаторов цикла, которые являются предшественниками при образовании углеродного скелета многих аминокислот в соответотвущих анаболических процессах.

Таким образом, аминокислоты могут быть и источником метаболической энергии (АТФ), и источником углерода, необходимого для синтеза углеводов и липидов. „

Все перечисленные выше моменты: деятельность протеаз продуцента, присутствие.в среде легкометаболизируемых источников углерода, азота, ■ серы позволяют клетке.поддерживать высокий пул аминокислот.

При эткх условиях клетка осуществляет интенсивный синтез нетрано-лируемых РНК и и-РНК для внутриклеточных белков. В результате содержание "свободных" факторов инициации и и-РНК-подимеразн, которые могут -принимать участие в синтезе и-РНК протеаз и липоксигеназы, незначительно, Этим объясняется низкая частота транскрипции и-РНК ферментов и, как следствие, низкий уровень образования ферментов в начале экспоненциальной фазы роста микроорганизма. Как показано нами, истощение в процессе роста актиномицега во одному из субстратов приводит к снижению уровня пула аминокислот в клетке, что, в.овою очередь,значительно снижает синтез РНК. В результате освобождаются факторы инициации . транскрипции РНК и' РНК-полимеразы. Увеличивается частота инициации и-1Ш ферментов,*а соответственно и синтез протеаз и лшокснгеиааы. .

Другими, словами, контролирующим синтез фактором -служит пул аминокислот. Состояние пула аминокислот в клетке может видоизменяться.

контролироваться и обеспечиваться как в количественном, так и качественном отношении по меньшей мере по трем направлениям:

1) - Наличие в питательной среде достаточного количества свободных

аминокислот, непосредственно присутствующих в ней или возникающее в результате гидролиза балков под действием протеаз, т.е. аминокислот, способных проникать в клетку. Поступление в клетку этих аминокислот может полностью удовлетворить физиологические потребности клетки в аминокислотах и восстановить необходимый уровень аминокислот в их пуло.

2) - Пополнение пула аминокислот клетки за счет процессов анаболизма

при усвоении легко метаболизиру емых субстратов я регулирование этого процесса концентрацией конечного продукта синтеза по принципу "обратной связи" (например, цикл лимонной кислоты),

3) - Содержание аминокислот контролируется опосредованно лгащдош об-

меном клетки, ЛРименно, "включением" метаболизма аминокислот посредством накопления в клетке ц-АГ.№, которое, в свою очередь, определено активность» липоксигеназы, которая в процесса перекиского окисления образует из полиненаскдешшзс жирных кислот биологически активные вещества типа гормонов - простагландшш. Простагланданы и являются тем Р-фактором, который "включает связывание" со спешфгаеским рецептором на мембране, осуществляадим контроль активности аденилатциклазы (циклазы).

Концентрация аминокислот в клетке является тем "поплавком", который включает шш выключает .синтез ферментов, в нашем случае - протеаз в липоксигеназ. Блокирупцлй механизм такого типа позволяет клетке поддерживать уровень ферментов, необходимый для полного обеспечения клетки лимитирупцдм субстратны (для I и 2 типа контроля). А в отсутствие таких субстратов, как показано нами для ахтиномицета зрЬега^а М8-2, биосинтез липоксигеназы и протеазы контролируется уровнем содержания их в среде и мицелии, °

2.2.6. Применение липоксигеназы

Аля того, чтобы найти наиболее рациональный способ применения препарата липоксигеназы, необходимо било извлечь фермент из биомассы продуцента, изучить стабильность фермента, наработать препарат для испытаний и апробировать его на практике. г

2.2.6.Х. Выделение липоксигеназы из клетки продуцента

Показано, что механические способы деэинтеграюга не обеспечивают перевод липокелгоназы в жидкую фазу, дезинтеграта. Извлечение фермолта химической к энзиглаткчоскоД дезннтегродюй биомассы было тло^>!«ктпа~

кш. Однако, иизываемая этими методами деструкция клеточной стенки повышала уровень определяемой активности в обработанной биомассе в 1,5 раза за счет обложения диффузии субстрата я продукта реакции.

Предварительная ляофильная сушка биомассы оказалась единственным споообом для эффективной экстракции дипокснгедазы буферным раствором. Введение дополнительно в этот вариант эксперимента ПЛВ не давало сут щеотвенных изменений. Хотя уровень дяпокскгекаэкой актявнооти в бесклеточном экстракте бил менее 30$, однако, он позволял выделить очищенную липокоиген&эу для поставленных нами целей,

- На основании изучения процесса дезинтеграция биомаосы ¡рбеии^е* М8-2 подтверждено предположение, ранее показанное имцуноцитохимичасющ анализом, о локализации фермента в першлазматическом пространстве,либо в контакте с внутренней стороной клеточной стешси, либо нахождение на внешней стороне мембраны, Экспериментально показана возможность использования лшоксигеназы в "иммобилизованном* 'состоянии на клеточной отенке к мембранах ддл решения практических задач.

2,2,6,2, Технология комплексного ксаолиованяя

культуральной жддкости М&-2

Актиномицет 5, ¡рбемМеь М8-2 в процесое своего роста образует богатейший комплекс биологически активных веществ: протесиатяческие ферменты, липоксигеназу, ПГ-сантвтазу, новобвошш и др. Поэтому разработка комплексной принципиальной технологической схемы переработки культуральной жидкости $. $рЬе\рЫм М8-2 предотаадяет практический интерес с позиции получения различит биологически активных веществ и является экономически выгодной. Все полученные нами результаты были использованы при создании технологической схемы для получения препаратов протеолитйчеоких ферментов о фибринолитическим д Зствяем и проста-глашшноа групп 11 • новизна которой подтверждена' авторским свидетельством » 579305 от 1977 г. и * 1472501 от 1988 г., а также материалами наработки соответствующих препаратов не только в лабораторных, но и в опытн^промшоленных условиях. По результатам лабораторных и опытно-промышленных пстгг&ний препарат дростаглаидинов, подученный с использованием ПГ-оинтетазы из культуры 3. зрЛе га ¿с/ел М8-2, Всероссийским НИИ технологии кровозамешт елей и гормональных препаратов (ВНИИТТЯ) рекомендован к внедрению как обладапдий конкурирупцей способностью о препаратами ПГ, полученными на основе животного сырья й химическим синтезом.

2,2,6.3, Использование биомассы 5.ърпшг Нв-2 в кормовом рационе норок

Эксперименты, проведены на норках в опытно-промышленном хозяйстве НИИ пушного звероводства и кролиководства в рамках АО "Биоинком" совместно с сотрудниками 1-й Московской медицинской Академии им.И.М.Сеченова Казанской Л.В, и Максимовой Т.Н. Критерием опенки действия биомао-сы на организм последних была лесса тела и количество гемоглобина в крови (табл.3). Диспепсия не наблюдалась ни у одного животного при скармливании рациона, содержащего биомассу актинамицвта, Показана возможность применения биомассы Я, М8-2 в путем звероводстве. Сбалансированный состав аминокислот в мицелии (табл.4), а также содержание незаменимых жирйых кислот в общей лкпидной Фракции биоьвссы (табл.1) при внедрении наших разработок приводило к экономии мясо-рыб-ннх продуктов в рационе пушных зверей на 4-б£.

Таблица 3

Использование биомассы $, М8-2 в кордовом рационе норок

Вариант сшта Дата Кивая масса,кг Гемоглобин крови зверей,ед.

Контроль I) ■ 18.04.82 28,0 4 0,84 14,5 ± 1,14

2) 21.05.82 - 28а4_±0а90 ___15,1 ± 2,20

Опыт X) 26.04.82 28,2 ± 0,96 15,1 ± 0,92

2) 23.05.82 29,7 ± 1,02 15,4 ± 1,04

Таблица 4

Аминокислотный сое тав белка из биомассы 2, Зск^Мг М8-2 (содержание в % от воздушно-сухой биомассы}'

К» ПЛ Аминокислота ■ ; ' Содержание, % Ю1 пп Аминокислота II

I. Аспарагиновая к-та 5,09 9. Иэолейшш 1,40

2. Глутаминовая к-та 4,79 10. Лейцин 2,89

3. Пролин 2,60 II. Тирозин * 4,60

4. Глицин 2,32 12. Фшшлалашга 3,07

5. Алании 4,40- 13. Гистидин 0,93

6. Цистнн 0,40 14, Лизяч 4,40

7. Валян 2,40 15. Аргинин 2,71

8. Мотионин 0,69 16. Триптофан 0,32

Рис.9 Технологическая схе/ча получениягяиеинноймльп/ры S.spfieroùdes M8-2 а ее комплексное ve польза ал иие

veчi мал. i 4**»»***»«

TW

¿«ДА, MA.

—и - —— „ ¿¿J ÍWZt&Z AIMMM. 1

ПриЧХтоЮми AVAXOMtM/

KOHÀtHCATLr

хллилгеит

Cm rpiMwJ « -циЛсрглл/

t tsobjs'e

нал

Ы4 níírw»

ÛJL-

A«vx__

***AtArttmt

TTßAtOTAMMV*

flijtrx—

компои*н~ ты спш.

пая Р*дЗМПл fiOHAtHÇgf * л lit ire*/г

¿01ЛТЛ -■>

леногАгм-

кддлГ-^Н

т*ллелг{1гт frfAtOT*

и/о- ' trt*pvo jw ; tt\ Г Jïv, />«jt в,/ -

âï DMtf, 0 И«

ma m«* ъ N oii г fipüvi&ag Mr 4м*-. Ail) CptQbt

Cmepujittiatiuu /¡pmÁlíQtmlen-tioû, nvmamtM нвисмеы

Питатель-мая npOi/î-Шстьеи-

Cmtputmei

Мифа/nMé-на ясрела

o.ûs-aajM/hx, -

(QSttoMoçfO.

шш

(ê'sz'u

AV3VOAOIV*

ytotuùрас

суперно-TOUT" на утилиза-«¿two.

apvytugmo -tb i к*?лопа

MUKßtfMOre

Iffy'

fâaggïïgSb

tiOmuM, к -£04 ff tí/ми*

tuefJtHve вн. гпу&УбГихо

Лрет/амд unten Фшибл*-

%XJ4t£S?&f"KT-

Itïc/rMvjr \туоноеш

SuoMeeei/ г/е* CT tpuóyti/juíam г-4**^-e* t'fonuMj п-бОСО'К'нуя

Рмргшекиг хм го* штш&т t4*lQttt\ v?<-

TVTW

OaocuMmti нвшюшвмл

П*£1

321

»^мзвнт _ \V**OtSn*MM,

--^ элоат

-- I яМсгаишШГЛ

тщЩШ

pBtrftfuntf*

олыЫ^аа

ИТ«*

бгадог л

1 Осоде* I

i Препарат фиТршъrvrevÀ

.■ " . - • ' 2.2,6.4. Использование простагландинов и простагланшпшодобшсс веществ,

полученных с участием ферментов !рпе ш-2, в звероводстве

Работы по получение простагландинов о использованием ПГ-синтетазы на $, $рЬе%пс1е& МЗ-2 и выделение их проводили совместно с ведущим сотрудником ВШИЛИ Фарунгуляном Г.А. и коллективом лаборатории технологии природных гормонов. Еыло отмечено, что реакционная смесь в предлагаемом варианте < арахидоновая кислота плюс ПГ-синтетаза актиномицета) содержала меньше примесей; затрудшшиих дальнейшее выделение конечного продукта, чем при получений простагландинов стандартным способом (арахвдоновая кислота плис ВГ-синтетаза из везикулярных пузырьков барана) . Показано, что полученный продукт соответствует требованиям стандарта (фармакопейной статье), Обосновано введение препарата простагландинов. в таблетированном виде при кормлении животных. Критериями оценки действия простагландинов, получешшх ДОмй на экспериментальной базе ВНИИТГП, на организм корок были масса их тела' и количество яловых самок.. Контрольная^ группа состояла из 100 животных. Диспепсии не наблюдалось ни у одного животного при скармливании рациона, содержащего простаглавдины (рис.ДО)^ Полученные результаты позволяют сделать заключение о возможности Использования простагландинов не только как стимуляторов репродуктивной системы животных, но и как препарата, подводящего получить большее поголовье зверей. Показано повышение рентабельности клеточного/разведения пушных зверей на примере норок на 5-7*. • >■ ■ > /ч',..". / • .■'^■."■у •

2.3. Результаты исследования" по липолитичесгаш -ферментам и их обсуждение

...... у., ' ■ .. ■■ У. ■ *" ■'

К ферментам,,. ос!тцествлящим гидролиз ляпадов, относятся липоли-тмческие.ферленты1лиаазы'и &отеразы.'Объектом наших исследований являются липазы/ сянтези^емые культурой /С. оу^гог 1414.

2.3,1. Докализавдя липаз Я. охугае 1414 / . - ■< ■ '.;

Методом дифференциального центрифугирования и сравнением липаз-ной активности протопластов и гомогената клеток нами было показано, что лишь незначительная часть фермента локализована в переплазмати-' чеоком пространстве клетки, основная часть ацдогенной липазы находится в протоплазме,1 вероятней всего в лизосомах клетки (табл.5).

Уровень липааной активности мицелия составляет 7*0-7,от общей активности культуральной жидкости. Таким образом, для культуры Я. еи?-2Д€1414 характерно образование преичущественн внеклеточной липазы. Пбэтоыу в дальнейших исследованиях мы ориентировались на екзогеннув 'липазу. ' ■ '

Локализация липазы Я, огужае, 1414

Таблищ 5

Метод обработки

Фракции

Диполитичеокая активность

Общая ( - ¡С от максим. ■

Дифференциальное центрифугирование

Исходный гомогенат.' > 2430 . 100

Осадок при 1000 об/мин * 0,0 0,0 .'

Осадок при;5000 об/кии ,; 129 <5,3°

Осадок при 130000 об/мйн ' 59 * '2,4

Бесклетс суспензия

Контродьнаяжндаость . 1550 Надосадочная жидкость : • •;, 418 . Протопласты после ливиса "968

к

мицелий

100 • 27,0 62,5

I И BaCI в осубтияин riQXt

2,3.2. Влияние условий культивирования ш синтез липазы £, оц/хае < 1414

Для культивирования Л.оц'1ав1414 как в лабораторных; так и в'-." промышленных условиях вами использовалась питательная ореда.разребо-танная ранее для »того продуцента о целы) накопления липазы Мухамеджа-новой и др. (А.о. Л 608834 от 1970 г.). Наш подобраны .оптимальные параметры культивирования иооледуемого гриба для промышденного культивирования. По результатам исояедовавлй

2о& 1414 особенно чувствительна к изменению температуры культивирования. Так, при повышении температуры ^льтивирования на 1°0 уровень : биосинтеза липазы щщ ЭО°С снижаяся на 235(, а повашение температуры среды на 59С (до 34°С) подавлялоферыентообразование в - 3 раза,' при ^ . этом величина чактавносяя лвпазв в фша>трйте культурадьной жидкости оо-■ ставила'370-550 ед/мг белка.. Такая резкая реакция гриба на температуру послужила основанием для проведения специального исследования л оптимизаций процесса по &тому параметру на всей прйтяженности культивирования микроорганизма,1 т.е. определения опытным путем наиболее благо-пряягвого ' для микроорганизма температурного профиля в процессе ферментации. Для определения оптимального температурного профиля культивирования, обеспечивающего максимально возможный в наших'условиях синтез и секрецию липазы, использовали метод маазидинамического моделирования по тешарат^в.' Псяученниё.параметр« культивирования (табл.6) были положены в основу разработанногои утвержденного опытно-промыилен-.,1 ного регламента производства Липордазина ГЗХ, внедрение осуществлено

■-■■.'"..■ - Таблица 6

Параметры яультивирорашя Я.оухае 1414 ,1 - .

Посевной., материал Начальный Температуря. режим • Интенсив- Длительность

pH пнгат. среди ■ С период роста, ,от...до,ч ность аэрат ЦИИ.Л/д культивирования, час

■ и-..- - .: .-i ■.'■■ ■. ■ ■ ■:■.,./' Активность липазы, ед/мг Коэффициент вариации, % • 29 " 26 .белка -25 0-и • -11-33 ■ '33-44 - 2500±320 340,0 44,0

на Приволжском бисошмич^скок завода. В результате подучено увеличение выхода целевого фермента на 60-65JÍ по сравнеюш о технологией, апробированной вами ранее на рердоксм химическом заводе,наряду с этим повышена стабильноотьз^улмтры С/~ 24$, сокредеаа дгэтельнооть выращивания Л. с^угае I4I4 о 48 до 44 часов, что в условиях многотоннанного производства дает вначительнуг вконошш по электроэнергии и труяовым затрата. ' '-T-.V-}^" ■х:'--;-'-'.- :.]> -

; ; 2.3.3. Получение препаратов липаз : ; V

Предложена тахводогичеокая схема получения ферментных препаратов разной^степениочиоет^ка культуралъпой жидкости Я- cry s at I4I4. Все/ сторонне и зучены процессы концентрирования фильтрата яультуральной

аддаооти^аодроои^сЁвдекия липазы оргашгческими раотворателяыи и мв-; Тедом высаливания сульфатом аммония из концентрата,'a iajwe процессы . получения сухих ферментных препаратов . . Исследованы свойства аоследнгас . о целыо разработки Ьгахшшчвокой основы технологии применения указан- - * -щц'препаратов в различных отраслях промышленности. ■ .. .

• < : s Для ввделения мшавдю на ■жудьтуральяой жидейотн. использовали ; фкльт^асто^е' оЙррудоваете типа «ЕАЙМ'а. вутч-фильтра; ленточного '/ '.у фильтре;-.Потери'¿а*зтой отадаш колббались от1- доЗ£, когорта>бшга í-^'' : связана о механическими потерями па смачивание отдедявмыхосадков ж v

^льтуралшой зэдсостж соотаанло 1,5-2, Концентрирование фильтрата, • осуществляет ц^дом ваяуум-вшдриваякя или ультрафкльтрашей (УФ). При вакууМ^-вйаривании в зависимости er ■ температуры концентрирования и отепеш1С17шешя раствора до СВ выход по ¡активности липазы

■ - в концентрат"''составил 92-9QÍ. ■■ -Ч'; ■.= '■■ ; ■ ■ v - , i " При отработке 'стадии УФ в опытнб-промвдлвнных условиях Скли ттрс -

л..-.у?. -, .'..,,>"■'.; .■■■.:■... г■ . ■' ■

варены импортные п отечественные мембраны различных' марок. УФ-мвмбра-ыы установки Вор - О^ггег типа У-Ю и ЛР-18 обладали 10(# оелектив-. . .костью во исследуемо^липазе, однако, скорость фильтрами была крайне низкая; 1,25-1,86*10 мг/ы^ •с,\что.ней збелно сопров ождалось увеличением длительности процесса и приводило к потерта до &ОЦ активности. Испытания отечественной УФ-установки- ЖРИ» оснащенной.блоками мембран (УАМ-20 ,УШ-2(3,УтЦ-50,ПАН-15 .ПАН-17); показали, . что селективность этих мембран, за исключением УАМ-20; составляет 98т100£, при скорости 4¿6- ■'..'. -5,0'Ю"6 м3/"2*?. При концентрировании в 4-6 раз выход по активности липазы составлял 84-92?, Более глубокое концентрирование в 9-12 раз приводило к значительному снижению скорости фильтрации и снижению выхода по липазе до 40-60Я ¿рис.11); ' -; . .• "Д'ЛА1

2,3.3,2. Осаждение липазы органическими растворителями ' • • и методом ввоалииишя сульфатом аммония у V:. ,,

Исследование по осаяденню липазы спомодью различны!,осадителей ; из ультраконцевтрата, полученного на основе фильтрата культуральаой ' жидкости, провощили с учетом имешщхся сведений в литературе: (Пружаи-ская,Ш7; Штейн, 1991; Калунянц я др.Д979,и др.); Ультраконцентрат . имел активность 62-63*Ю3 ед Лк/ил и содержание сухих веществ в кон- ■' центрате 6,9$. Осаждение проводили яри различных' концентрациях ресязО"

■ ригелей, их смесей я сульфата адооняя. ,."С-.Ч-:-';* ••

Органические раотворителяво-развоку: воздействовав ;

аюсть ферментоввызывая осаждение липазы' сразлично! полнотой я степенью инактивации (рис, 12). Так^вт№вв$;сшф1 ад^ перево-. дия фермент в осадок в активнее* состояния в интервале концентраций ' ч.у етанола от 70,4 до.72,5£ в реакционной среде, Выход фермента в осадок в■этих вариантах,опыта составляет^/,¿-89,&, Нами показано, что оптя- ' мальноё соотношение ультршошщтрата к »1Шовоцу спирту Оцва- ' ; ко, даже - небольшое повшение концевтрациг втанола в' реакцвонной'смеси : ; или при:возрастания длгесдыюсл:^

. вости- из-за быотхюй таактивапда фврмеата^ неосуществления:^

;■' ОСОбв1ИО В РШГО1О-Пр0ИКД11<>ЯННХ

> Применение для осаждения взопропидового спирта^ позволяло поду чить осадок омешвдм; седе^яие^

■ тимальиых условиях осааденяя в препарате липазы в активной форме со- '

ставил лишь 5656, нареду пс^вннШ вд >

Показано, чтонаиболее целесообразноекономкческя: выгодно испольао-4 вание » качестве осадиталя липазы на ультракокцентрата ацетона. Осавде- ^ ' н-.'.о пгозолилось ¿ диапазоне концентрации ацетона.в реакционной среде .'.и?44.4. Дс 71,4;:. Наилучиио результаты. - 66,Ъ%;активности в препарате ■

1 ' rnnpfmAatStnl спирт ¿-этим&п} шрт i- йцмай

Л. z * * (17 f »w « Crcnttib млнцечт/^оами/г^р»

PttC. ft ßjwmvt cmtmw *№гфс*г-риробан в я м4 ceipoMutHocmb -л*-natu t тпмгСмвигемляРммю t xoMVLtitiTipmtn*..

tnmvMWgQt %-t* .L

■ с ' eeetaiaatfie fuff/eiepritítríl .» w

ирвцемтш tcgtfitamje pocmtopvmtjeà Í ptctrqiHMMoé t^ueev

i Pvc.fë влияние приводи jtacmSopumeJA и его noutitympa-ции na cctíweenue Кщестб концентрата, и ítvnaiu.

<jí

- бшш получены при концентрации ацетона 64 ,при соотношении концентрата и ацетона 1:1,8.Препарат был светлим,рыхлым,прекрасно;сушился.* Использование для осалдекия смеси изопропилового спирта и втанола ^ожидаемого результата не дало. По воем показателям результаты были ху-. же,, чем при других вариантах осаждения. ^; Я!'. ^

;Показана' принципиальная возможность получения препарата липазы • методом высаливания, но не представляется возмохным рекомендовать атот ,< у' метод для последущего внедрения в производство из-за его, нетахноло-. гичнооти и. сложности регенерации . • | -•':>- \

2.3.3.3. Получение'сухих препаратов Лиаорвзин ГЗХ,Г10Х-Г25Л

■ -' > Учитывая степень очистки препаратов ферментов и области их приме- ■ нения нами рекомендованы два варианта последних'стадий технологии* по- -'. лучения сухих препаратов фермента: : " ' "1 ¡' ; ; - ;" ■;

, , - внесение защитных наполнит елей и распылительное выдутпиваяие , " : ■ УН г внесение криопротекторов и лиофильное высушивание. ; •«•' ; : : При разработке тахнолотаи получения препарата■Липориэия ГЗХ из ' концентрата культуральной жидкости нами подобраны в качестве валютных наполнителей мбласса -1,0^ н хлорвд ватрия - 5^0£. Использование для '..;/■ распылительного, высушивания'сушки, разработанной ШО-^Еиомаш", "отличаю-. ■ V пейся более низкими температурами теплоносителя (Т^« БЗ-ЭО^С; Т^д * н 45-бО°С), приводило к увеличению аотивнооти в сухом препарате ГЗХ и ! снижении потерь последней до 5-6$ ва этой стадии агиологии (Кривова, ■ ' 1991). При получении ферментша^преоаратов о индексом Г10Х.Г25Х а про-цеоое ооакдония фермента из1 концентрата культурал ьной. ¿щвзаютя.варуша-лась сольватная!оболочка белковой молекулы фермента, что сп'особотвова-. ,••''•' ло возникновению ситуации повышенной л^клшоотн знмма к рНдемпе^- -> туре, длительности .контакта белка о тепло- шш 'хладонооителем я т.д. *а Показано, что-потери активности исследуемых обравпах при'различных' *:! -.^...режимах эаморадивания одинаковы и.составляет 20-г5$." Йссдедовано влиа-; ^¿Х ние криопроте^горрв; ( 9тиленгликеш,}'' поллзтменгдикЬль^ОО,'жюхетилсуль-

фоксид,1 сахароза)¿на сохраняемость:липазы в активном оостбяяяи'Vпро-• цеосе эаморшсившЫя;(рис.13) ^

'; Установлено,;что добавление О.^Цсахаровы является лю8Итганым технси1огнческю1гпраи*ом в способствует нб /только сохраябнив^актавноо-препарата'при лдофилизавди, но и да*'ддетелсшом хранении,; 1 . ч1-':1*

ь 2.3,4 ^ Разработка условий выделения гомогекноЯ лштаэи , : . V ■ « V2,3.4.1. Ионообменная хроматография липазы.: .:*?.'.■■ *'.'.*"

1 Ддя освобождешя лшаэы Ьт_ сопутотвужщих бежов был применен ме- : ¡ тод ионообмекной хроматографии с иcг5льзoвalшeм.,,и!oнo-Д,, колонки с

" V: ->'.*•%•. V"1 ■ ■ V .. ■ У;.\ >: - - > ^- '''V'/ ■; '■'

ft*' |ч

. пэг ■ , эг тзмсо

в-са^ароза

Рис, /3 Влияние хтопротектороа на ■ axmv&Hoem* липазы при ¿auto: рашиеании

AvnapiiSuH Г$х [

pacmícpe- •

WÍTpOmQftt, фияimpaцих ■

- Растём суммарной фракции * беимоб

»

P'Hif'f

I'M- укиддщ

\ 0ысокоа<лгщем ~ ньш препарат jui-

\ ftazbt" *

СУ* TT!р ou я

Электрофорез препарата

определение ygÇjb-НОй QKTtii' HQÇ7V

- Pt/c. npvHHurrvQjsbnaSL схема очистки препарата ■ ЛиповивинаГЗх с исггомзаба-нием СЬ ф -Û2JK - azapatv

- 34 -* . ,

+ " < - I

ноногекной группой -СЕ>Н(СНд)д в колонкой "Моно-5" с ионогенцой группой, основой которой является группа Был получен белковый комплекс, состоящий иа 5 белков. В литературе встречаются данные о существовании различных форм липазы, синтезируемых одним и тем же микроорганизмом, отличащихсд соотношением различных полипептидкык цепей, . что,в свою очередь;определяет различие их кинетических характеристик (Диеров,1Э94). Однако, у исследователей нет единого мнения относительно причин существования множественных форм:липаз. Вместе о тем,;-есть основание полагать, что большинство липаз'являются олигомерными'белками (//г га у а та -1979). Одной из причин, объясняющих существование множественных форм липаз, по-видимому, может бы?ь явление дкссоциации-ао-социации. Не исключается также возможность взаимодействия белковой молекулы липаз о различными углеводными остатками, 'так как показано, что липазы являются гликопротеинами (Брокер*оф,1978). Для уточнения возможности наличия множественности форм липаз у Я, огг/^ае 1414 необходимо выделение гомогенной липазы. I

2.3.4.2. Выделение гомогенной липазы методом гидрофобной хроматографии и ИЗ&

Одшм из эффективно применяемых методов фракционирования белков ; является биоспецифическая и гидрофобная хроматография. Для очистки екстрацаллюлярной липазы гриба м. оу/*сге 14X4 быя использован гидрофобный сорбент - дшштрофенкл-гексаметилендиамин сефароза-4В. Выделенная активная фракция, подвергалась гвль-фидьтрбИйИ.^Удедьная активному препарата липазы била повышена почти в 30 раз с выходом по активности; около 37£. На хроматограммах был получен один пик белка, облддапций ■' липолитичеокой активность». Однако, асимметричность пика требовала до* волнительных операций по увеличению его гомогенности. Для выделения гомогенной липазы использадали метод изозлехтрофонусирования, Липаза элюировалась в;ввде строго симметричного пика. Потери активности на данном этапе'очистки составили всего 7,0$. Удельная активность возрос ла в 1,6 раза. После освобожденияМетодом двалйза'от аьфоликов и По-следутойй ллофилизапия нами получена липаза с удельной активностью . 142>103 ед/мг белка, что превосходит исходную удельную активность парата в 44,0-раза, выход активности-составил 9,0% (табл.6). '

2.3.4.3. Разработка принципиально'новой схёмы ' поучения аысокоочвденной липазы огу2ое 1414

■К'" " о использованием метадло-хедатной аффинной хроматограф

Технология получения гомогенной липазы сложна и требует дорогоо^у ; V шего оборудования,однако,в ряде случаев для ферментативного гидролизу &на производстве достаточным'является использование высокоочмцегашх

.Г ЛШИЗ. ''• ' •"• . ■■.-■'."■■■ ■ V—. > ..г; '■;■■'.

Таблица 6

Характеристика этапов получения гомогенной липазы

Очищаешя фракция

Удельная липазная активность, ед/мг белка Степень очистки Быход.л

25,0 - 100

139 I 95

' 146 I 95

125 * 0,84 85

197 1,3 84

3300 22 I 65

3400 23 I . 64

23000 155 7,0 29,0

88000 620 28,0 16,0

142000 965 44 9,0

Фильтрат культуральыой жидкооти

. Исходные растворы

Концентрат культуральной жидкосп

Растворенный Липоризиы ГЗХ в тритоне : ; .

Основные-этапы очистки

Надосадочная жидкость -центрифугирование

Диализ — диалязированвая надосадочная жидкость/

Осаждение - осажденный ацетоном препарат ;

Ионообменная хроматография

Гидрофобная хроматография

Гель-хроматография /

Иэоэлектрофокусированяе

Использование металло-хелат-аффинной хроматографии .позволило разработать простух) схему выделения высокоочищенной липазы. Этот способ для очистки липаз был использован впервые* Сорбцию фермента осуществляли на Си(П)-ида-агарозе, а десорбции - с добавлением конкурентного . веще(^ва"-"йшда8йра. Электрофорезом в ДААГ в денатурируицих условиях показано, что в результате МХАХ на С</{П)-ЩЦС-агарозе при рН 7,5 получен препарат липазы Я. охугол 1414, содержащий две фракции сходной молекулярной массы ¿от 20*до 30 кД), а также достигнута высокая степень ' очистки рабочего юбразца. -Таким обрезом, получен высокоочищенный. препарат липазы Я. рхугае 1414 с удельно^ активностью 87-Ю3 ед/мг белка, степень очистки ^которого по оравненво о Липоризином ГЗХ увеличена в 27 раз,выход процесса - 13$ от исходной активнооти препарата (рис.14).

Технологическая охеш получение препаратов Липориэин различной

степени очистка представлена на рио.15. ~ г

<

2.3.5. Изучение некоторых свойств липазы Я. оЧугае 1414

Получение высокоочищенного в гомогенного препаратов липазы Я. ои/-Хое 1414 позволило нам изучить физико-химические и кинетические свой-, ства фермента.

ЯСМ ПГ)Н*НГЫ

06/, пар, хлада -

a rent, çmepufi-

"Hi} -êasaix

атцдВатам мыа

amnaoc

в a i дух

Пгиг&гоЬ it и ve mtfh, смд и стер илизоцих, oxsoniÇfHUç

в UPamuto uuf noct/мяго rft}-Приац¡r. í t?»^ T-irij *t*4i<t

<Jcx0Q4OB хильтцт првсиийыта липаШ К. •»■¡i*а*

ко/тохенгы ере-jtbf. (iah, плев о-агент, ÍTtpitJib-

**ОГи С и Г âyib -

QtnpotT ëùicvx

QpuroroSjtHve ррвшЬодст-ЬенРоО sptgv, стери-шючуи ' ox jowp** t/í, já « » fp*s<>'t ™ ■ Рощи ¿anuí S <Stp"*nrefl<i*, t •/Трофй/ч, VVv.

Готобчй no-4ï(nt>ù MQtepuOA

Готоёай глубинна*милым** S ■ лггуж of_

! ф шь г pa ция, ce/tapi/poSûMue

Qсадок(âuoMa-eco, JSepgve

чеиия _

ymujtm ацунз^---1

omvs

t/j>í /Праф иль-

T/»arh i—;-

•menjoHocuTtfl^ I Сушка распыленУем

_-6ó3a_

1 , OcaAOewwc

i

i*

ЪилъУрат культура

jftUCÛ XttlQXQCTlJ

Концентрат

MunopU3UHf$^

^ърпенгпныь! раствор

ацетонt соотношение- /:2 изопропцлоё&ш спирт, соатн. 1:1,5

JL О Л от полного на-4 ' сыщеиия

спесь: это нал* víonnononoj: (20%+мХ)

со от S ет с тленно, соогн.

реееиера - _;__

I луофилизацуя f /

отходы — на ут и лил а -и регенерацию

Переаса>ндение, гель-<ри*ьтр<3ция, диа -ли-i, ультраф t/лътп - , рация, фракционирование у т.д.

j .ДцОЗшль/зогцил

£7Д- /70

1 и о« m»

»ort

JlunoaujuH Г(Ox no T-ff Ьйруонта!

3'

im

ÖaoaAWWU оеа-yo*, йодные растворы концент-pgfh b'i_

JlvrtopusuH •

así-no*

Рис, /5, принципиальная технологическая схема выделения v очистки'липазы глубинной -культуры Я, oryzae /414.

2.3.3.1» Влияние рН я температура ва активность i стабильность липазы -

Лхпаза /¿. eijfiae 1414 достаточно отабильна в нейтральное и щелочной области вначеаад рН. Зона IOQÍ стабильности неочищенного препарата (ГЗХ) находятся в интервале от 6,0 до 10,0, а для частично очищенного я вяоеэюачкщенваго (Г101 я Г251) сужается до значения рН 6,0-9,0 и 6,О-в,0, соответственно. При рН 12,0 сохраняется 65-7GJC исходной актива ости, В кисло! лоне рЦ хсолаауеглая липаза менее устойчива, при рЦ 3,0 теряется синае 7CJC активности фермента. Лжпорлажн ГЗХ наиболее йхтяаез при {О 6,5-8.5. По хере увакячввхя степени очистки квтервах оцтеигцышх внлчея^й рН мя действия фермента сужался до pJI 7,0-6,0.

Проверка терымтвбильяоота препаратов ляпази Я. eiyiae Iü4 а интервала от X до ао°С показала, что иоолвдуемий фермент достаточно tei«ocTü684ffa, Та* цосле двухчасовой «хспоядах прж 50°С препараты Практически nareoctb» согрешим шаходнуо активность. Чувствжтвлхлооть фэу^адг* я действлв теда»рагуры во>рао«иа по мере увеличения отапаяв его очистку, ¿чдораажв ГЭ1 через 3 часа яшсубацяя црн 60°С явахтявяро-bMcjj ва 40$, а Лтаориэжд Г101 «a tro яре«« терм 78? первоначальной «вдшяоот», дредарат Г2ЯХ в аяалолгоаз условиях «мал лип 15? от яо~ ходаой'ахтявноотк. При Й0°С препараты ГЗХ,Г10Х,Г25Х полностью инактж-В5ровздооь в течение 90,60,30 минут соответственно. Температурный од-тхцум црадарагса дюйм, в вазиоимости от стеаеаж очистки, находился в явТ«реам от 35° до 45°0.

2.3,9,2, Катаеитвческае харвжтервотжхж липазы k.otjias uu

0р9 иссладовйша ■ гядролжеа триаояжглицериаов я алкялових »фхров карбонов« юцают «maso* Я.огузае 1414 сравнивала полученные результаты о аналогичны»« характеристиками шщкреатвчесхой дхпазы я харбох-CJUVCtepoea. При яойжедоааяхя взаимосвязи скорости гидролиза оубсграта я ховош^рацви форманта, которая фориадлвовалаоъ ддейики уравнением, бола выбрана удоокад для работя я анализа получаемого аффекта гиролж-з* тряааетина (ТАЦ) концентратов для изучаемого ферианта, равная 2,3.10*"* мг бедка/ил, для панкреатической лэшаэы - 0,037 кг бехка/мл, для аарбохсил»отерй5Ы - 0,272*10"^ иг белками. Анализ ддрша по научению закономерноетей влияния ТАЦ на Скорость его гидролиза при выбранной рабочей концентрация ферюнтов показал, что лялям А по характеру гидролиза ТАЦ бляхе к ляоааам, чем к еотеразам. Аналогичные опыты для липолхтхческхх ферментов о 'рибтирхном (ТБ) показали, что во характеру кривых зависимости гидролиза последнего от его хон-цанграют для всех трех ферментов свойственна одна и та же картжяа. Важным является тот факт, что научаемая липаза R- 0%yzae 14x4 кие&т

высокое сродство к ТБ. При изучении киветхческлх параметров гидролиза трикалридква (ТК) показано, что характер диполиэа для ¿"""^ч Я.оц/2,аг 1414, панкреатической лнпазы а карбсксжл»отвразы был аналогичен.

В ходе исследования по действию Я. оу/зае 1414 на хетта- -

ныЯ субстрат липазы - вмульсяю трнолоина (ТО) установлено, что вссха-дуемый фермент по своему действии аналогичен панкреатической липазе. Карбоксилэстераза вэ печени сродства к данному субстрату ве

проявляла. Необходимо отметать уникальную особенность изучаемой липазы, а именно, явление активации последней в присутствии О,IX неново-генного детергента - тритона Х-ХОО (0,12).

По результатам изучения гидролиза субстратов истинных »отераэ(ме-тялбутирата, втвлбупрата, метилолаата) липазой Я.огдгае 1414 можно заключить, что у данного фермента отсутствует специфичность к суботра-там карбоксидзетерав.

Таким образом, изучаемая липаза! во-первых, избирательна к три-ацпдглицеролам, во-вторых, скорость гидролиаа ТБ значительно провисает скорость гидролиза ТК в ТО. Скорость гидролиза ТАЦ при переходе через ККМ в присутствии липазы резко возрастает, другими словами физическое состояние субстрата влияет на процесс гидролиза последнего, что также подтверждает схожеоть с панкреатической дашаэой. По специфичности изучаемой липазы к жирпокаохотной частя трвацпдглнцеролов субстрат можно расположить в следущей последовательности: ТАЦ > ТБ > ТК - ТО.

'2,3.5,3. Поэищояная специфичность лшшз Я.огузое 1414

При изучении позационно! специфичности исследуемого форменка оценивали глубину в скорость гидролиза трдацилглдцеролов (ТГ) оливкового и соевого масел. Анализ продуктов, реакции осуществляла методами ТСХ и газовой хроматографии. Гидролиз проводили очищенным ферментом о активность» 142* Кг ед/иг белка. В табл.? представлены данные об из»»- : нения глицеридного состава жировой фазы гндролизатов в процессе лило-лиза. За 12 часов проходил глубокий гидролиз исследуемых субстратов, т.к. ншропщроллзованншш остались всего 20-25$ ТГ. Анализ динамики накопления глицерина в.водной фазе, происходящего очень медленно, а также глубина пиролиза ТГ, к этому моменту достнгагаая АА%% позволяют сделать предположение о наличии у 'запшш 1414 позицион-чоИ специфичности (табл.8).

Наряду с этим, величина, характеризуемая степень позиционной ппеак^ичности, рассчитанная по методу Меерова Г.И. с соавторами (Мее-р'-.п, поотавнла для изучаемой липазы 0,023. Согласно'предложен- -

чом бодшо эта^валичииа приближается к нулю, тем выше■;.,'

■ V - 39 -

/ Таблица 7 . ДНагененка состава жировой фазы ищролиаатов ТГ .

Время: Оливковое и аело,< Соевое масло,%

ферментативного гидролиза^ ч ХК ИГ 1 « 1 ТГ ж 1 иг 1 *! ТГ

0,5 8,9 ¡0,8 8.7 81,3 3,8 0.9 в,7 84,6

1.0 10,6 '2,4 16,7 72,2 8,2 1.3 12,4 73,6

2.0 Х9,2 ' 3,2 18,9 58,3 15,0 2,4 18,6 58,3

4.0 25,3 4,5 23,6 46,1 19.7 ■3,6 22,1 36,7

6,0 32,6 , 5,6 26,4 34,3 22,3 3,8 23,4 эе.о

1 8,0 36,7 6,7 27,3 27,6 31,4 5,1 25,0 30,2

| Ю.о 40,2 ; 8,6 27,1 22,3 37,6 6,9 24,8 25,6

1 12,0 44,4 ■-■9,1 26,8 20,1 43,1 6,3 24,0 22,3

; г. ■' » Таблица В

] Накоплений глжцерпна в водной фазе пщршшватов

времяг . Оливковое шсло Соевое масло *

ферментативного Накопи ешю Глтбива . I Накопление. Глтбина

гидролиза, ч глицерина, % гидролиза,> | глицерина гидролизаД

■ 0,5 ..... т — —

1.0 ' , а,оа 4,5 0,1 5.2

2,0 0,14 8.7 0,17 12,3

4.0 0,25 22,6 0.26 24,6

е;о £>, 42 33.1 0,42 33.2

..8,0. 0,51 36.3 0,62 40,2

. 1б,0 /0,79 ■ 42,7 0,82 44,6

12,0- ■ / 0,80 44,1 0,82 44,4

позшшоивая специфичность конкретной липазы. Ооновшдст продуктами,об— разуищмиая в процессе диполиза, являются даглицеривы (ДГ) и свобод. вые жщша каолотц. Цокогляйэрцяы (КГ) накапливаются очень медленно я в незначительных колжчоствах, Хроьптогрвфичеокий анализ фракций сво-; боднет кирша долог гцдрожизатов оливкового к соевого масел свидетельствует о том^ что' фериога не обладает избирательной способности) х гвдрсдлау офарвых связей в шшисдмооти от васвданноотн жирных кислот, адашровавных о 'глдцершовым остатком. При использовании метода рада-яютгтчп*т индикаторов (Х-^^О-^ряпальиитата в (1- С)-триолоата редкак-тианость била обнаружена в гцдролизате во фршщяж свободных жирных каодот при величине вкппоетпдя 15 минут я пр -подала накапливаться в течение 1,5-3,0 часов в зависимости от субстрата. Накопление ионоглж-цериновв гидродизате пере» 12 часов гидролиза составило ори

степени гидролиза 62-69*.Глащэржн яахашатался в оледовщ хслнчестеах.

Таким образом, на ооновашга полученных результатов мохво сделать эахлшенне о наличии у шпата Я. ои/где 1414 определенно! 1,3 позиционной специфичности.

2.3.5.4* Переэтержфикапжя жхров о применением яипазм

Наряду о субстратное я дозяиаонно* специфичностью жзучаемэ! лжпа-еи нами была показана возможность ее испдльэовавяя как фермента перо- ' »тврифнцирупцего действия. С юш преодоления сложностей применения липазы для процесса вереатеририкядд была проведена ^мобилизация последнего на минеральном носителе - алшосжляюте. Способность к перв-атервфиюцрш анияглндараюи »мобилизованной лш&эой была доказана наличием изменения жнрвокжолотного состава в ТГ до ж после реакции (ряс. 16). Анализ жжрпокислотного состава ТГ проводят после жх ввдвле-ния методом тонкослойной хроматографа о помощью газожвдкостной хроматографа!. В процессе ферментативной реакции происходит количественное и качественное изменение жирных кислот в ТГ как всторону увеличения, так и уменьшения кх в реахдаоплой смеси. Следует отметить, что процесс идет и в случае насыщенных жжрных полот о высокой температурой плав-' лвнвд. При vtou норотхоц&дочечные ваевдеввыв жжрпие хислоты включатся в реакцию предпочтительнее.

Протекание реакции зтерифжкацп между- глицерином к олеиновой кислотой было продемонстрировано о использованием метода радмтаояикх жн-дикаторов (рис.17). Следует отметить» что схвтез 1£Г вде* пропорционально убыванию одеиновой вислоты в реажшонвой смеси. Синтез ДГ идет медленно, с незначительным выходом, ТГ в продуктах реакции не оЛтружеш»

2.3.5.5. Кинетические свойства липазы R. сгу2ае 14X4

Для разработки ваучяо обосяованных режяиов испаиьэованяя липаза И.еуржае 1414 исследовали кинетику процесса гядролизаразджчнш субстратов , фкзячесэежв и апзн»и.тичесяне свойства фермента. Определены основные параметры фермента, методом иэоалекгрофокусяроэанжя найдена изоточка фермента (р1-4,7),опроделены коэффнцяентсхорости седиментация (3,0 ед.Сведбергв), молекулярная масоа (45 кД) (рио.18).

Методом sss--PAG£ электрофореза показана субъедшшчная структура липазы Я. ozyzae IHAi првдетавдеккаядзумя субьединипдми о молекулярной массой 17,4 и 28,2 кИ. акхЕшюсгь этих фракций составляла 30 и от суммарной активности соответственно*.

Изучение Г^п1ет1ш11т1др0л113а трибутиршш. я оливкового масла пока-л аадо. что пиш-vi №. mi'lQe. ТДТД тгигалял* о.тлиятвл к сИпим rvrtm-rvi— -

Рис. fS. iíi JfWWÍ

содержания жирных

кислот до ипосие .

ф ерментпатибной

• акции.

(Рырил/аязщая cflwf ~ ' могтъ Mfñbgs f-3% I SatueuuiOemv XUNV*tc*aro c/itpetttv* Жирно tí

OfotMOvenvA i

CJgtfitOKijuü БШ) nett» /накцш * XtopKtte кислоты :

4-Cita ¡ S'fMK* К*на-екщлннм*ifi.K, J- Cft,-t i

S c<t-a i 6- С tJ, ,

¿o iü ïï м if

JDjlvmtjii WfWi , M t/M, .

Рис./7. Содержание (а^егшсбал кислота.) -6 продуктах cwmiä« с участием липаьы огуз-ае

a) CegtiMÉHmorpajjJva гомогенной липош

Номера франции

■ 6) Определение ■ #уиярно0 utaccbt липазы(rowtta 6)

" f' t-*M>Kot90Kev$as<31

i - ttHOt*QStjH, ,

tf-TpU/TCUH, S-Hvoruo&bn

S) Электросрорйгр^-

Í> MMQ гомогенной ; липазы в ЛААГ

Ш-"

to is so гз \м. « *» « so » ш . ч-Номера Фракции - •• '.-¿"V

г) игоэлекщрическое ,фониси- b-.'j.:;-«,,-роЬачие гЬмагъннои /lunasbt

PuQj%,XapaKrnepucmvifitrÓMoreHHoé

л-ипазы /?, огугаъ 14-U . ; -

Константа Михавлхса для гидролиза трибутирхна била равна 1,91 ШoXí/Лt а шксяммпгтя скорость гадроляза У/пах ~ 1,51 »41ожь/мг. мхн, для панкреатической дниазы величина Км» 2,18 мЦоль/л. Спрадвле-ва внвргкя явакгквация липазы, которая составила 06 од/иоль.

Получашше данные свидетельствует о близости кинетических харах-терн стих исследуемого фермента я нстшпшх лнпаэ, что позволяет отнести липазу Я.огухое 1414 к липазам КФ 3.1.1.3.

I *

. 2.3,6» Иммобилизация липаза на различных типах носителе»

Наин показана перспективность использования иммобилизованной липазы как дхя гидролитических, тах в для процессов синтеза. В исследовании прамашиись методы ковалептиой я физиЗесхоВ яшюбялизацни*

Химическая иммобилизация осуществляюсь на 13 типах носи-

телей. Наиболее прдходиярши поситодлыиддд лдпавн агцюе 1414 являлись апоксисилохром, апоксиояяякагедь я аиивосждохром. Установлена перспективность' использования пористого аишосилтгаата в качестве матрица при иммобилизации липазы, размер пор 60-80 А я внутренняя поверхность 70 1^/г. Оптимизированы условия итобаизацня фердента, температура процесса 30-35°С, рЫ 7,0-7,2, диитадьнооть контакта 2 часа, перемешивание 200-220 об/мин.

Ооредвлешг юше-ргсеокие парвметри иммобилизованной липазы: константа Иихаздяоа К* «■■' 2,17 ь^охь/л, знергин активация я япактявапии равна 10,5 дДя/шхь ,я 224 яДд/мохь соответственно. Кинетические свойства нативлой ж яшобяляэованяоА липазн продставлгаш в табл.9.

..V' /• Таблица 9

Кинетические свойства вативной я ншобялизованной липазы

Свойства

Иативная

Ишобнлпэоваяная

литяяд липаза

37 45

25-50 30-65

\7,0 7.0

6,0-8,0 * 5,0-9,0

1,91 2.17

96 ез

12 10,2

86 224 "

•Оптимум темцоратури,°С ' • Диапазон термостабхльности, °С ( Г- 1-2 .ч) Оптицум рн - V !

Диапазон рН схафиьностяЧ**- I-2 ч) рл(Шоль/л) '^.;' : .

Период полужнахтхвалил у при. Г - 37°,ч 8нергяв активация,. «Дж/моль Внергия лнтггиваши, хДх/модь

Установка, в оансшу которой захожена имшхйошзоваяная ва порио-■ усы алтосилякате хипаза А.огдяае 1414 я работавдая а непрерывном >, апробировала на Московском шя сваренном заводе для гидролиза

I

4

растительных масел. Кратность использования иммобилизованной лкпазы достигала 53. Dpa часовой работе колонны кислотное число пропускаемой эмульсии соевого масла увеличивалось в 12 раз. Однако, в саду слеш— Личности действия изучаемой липазы, показанной ранее, полного"гядродя-за трвацилглЕцеролов достичь не удалось.

2.4. Применение дапаэы

Широкий оптимум pH-действия (6,5-6,5), высокая стабильность препарата Липорнаин ГЗХ, способность гжцролизовагь растительные масла а твердые жиры, отсутствие избирательности в отношении структуры жирно-кислотного остатка, устойчивость к повшеннш температурам позволят использовать липазу Я. агузае 1414 во многкх отраслях промышленности. В частности, уникальная способность х гидролизу ланолина дает возможности применения данного препарата в технологии обезжиривания маха ж кола, а также а технологиях мяса ж мясных продуктов. Способность препарата Липоризин ГЗХ гидрата эовать различные дшцдные субстраты, его совместимость с различными компонентами ж стабилизиругщкми соединениями мощкх средств позволяют подойти к разработке научно обоснованных рекомендаций использования дто»«* jl. otjfXoe 1414 в составе оинтетичео-ках мощих средств(СЫС) а.чнстяиих средств для выведения жировых пятда.

2.4.1, Применение Лвпоразнна ГЗХ в составе рецептур мощах я частящих средств

Синтетически иощае средства, как известно, представляют многокомпонентную систему различных химических соединений, вкличащую во-верхностко-активнне вещества (тУВ), конденслрованш(е фосфаты, карбонаты, биокарбонаты, натриевые если карбодедметялцадлюдозы (КЫЦ), садиха-ты, сульфаты, порбороты натрия, оптические отбеливатели,отдушка а др.

Народу о щалочостойкостью и термостойкостью препараты дяпазд . . ;• должны бить совместима а сохранять стабильность в сочетании о много--компонентной системой кощях средств. Выло исследовано влияние основных компонентов мощих средств а полных рецептур на липшштическую активность отечественных препаратов Лдаоризщ ГЗХ и Липоаэрузнн ГЗХ. С этой целью била приготовлены бинарные cueca,'в состав которых входил ферментный препарат в сочетании о определенными компонентами СЫС. Содержание ферментного препарата в бинарной смеси составляло 1000 ед/г. композиции, концентрации компонентов CMC - наиболее часто применяемые а рецептурах. Такие бинарные смеси имела влажность 3-5* в хранилась -три температуре 20-25°C » течение года (табл.Ю).

¡i процессе длительного хранения (до 12 месЛ выявлена высокая

Таблица 10

Совместимость я стабильность липаз в сочетании о компонентами мошхх средств

Компонента мощхх средств

Совместимость с комлонон-том, %

Стабильность га 12

Джпоризин

пороз ГЭХ

Дшоаэргзин

Сульфонал

Синтетические жирны кислота (Сту-Сщ)

Триполифосфот натрия Карбонат натрия-Бикарбонат натри^ Сетасилакат натрия Парфгмеряая отдушка Пердорат натрия ■ Сульфат натрия ^

2,0 7,5 15,0 5,0

4.0 40.0 12,0 ,10.0 Г 5.0 0.1 ; 1б.о

/до 100

90,8 88.5 67,5 25,3

91.3

87.3

91.7

94.8 00,3 98,7 62.0

98.4

8,5 ■ 5.2 3,1 25.3

21,3 17,3 21,7 24,в

10.3 23,7 следи

20.4

92.0

90.1

68.4 92,7

91.5 86,0 90,7

92.6 78.9 98.4 60,0 96,0

стабильность Лдаоаэрузина ГЭХ почти со всеми компонентами СИС. тогда как Липоризин ГЗХ бил нестабилен.

Поскольку препаратам липаз необходимо эффективно действовать при растворении мощнх средств в воде, нами изучена также стабильность их в сочетании о компонентами мощпх средств в растворах. Препараты Лило-ризхз Г31 и Липоаерувш ГЗХ вносили в раствора компонентов СМС, концентрация которых соответствовала, в среднее* тем, которые используются в рецептурах мовднх средств, и соответствовала 1000 («.активности на 1л раствора (табл.Ы),

Как видно вз^ представленных данных, ливазн в растворах неиоиогеа-шх ПАВ стабильны. Для внионогенных ПАВ стабильность фермента мала(64-5в£), Причина различного воздействия веионогешшх и авиояогеншх ПАВ на стабильность ферментов, по-видимому, заключается в природе «тих соединений. В растворе шдоногешне ПАВ ионизируются, х заряженные суль~ фогрушш, очевидно, взаямодайствурт о гидрофобными участками белковой моле^лы,, связи между гкдрофобныма участками многочисленны н наряду с водородными поддерживает молекулу в стабилшаи. соотоянки. Наличие ^сульфогрупд, вероятно, ослабляет эти свдзаЦ >аблвдается некоторая дестабилизация молекулу, выаыващвя чаотич^в потерю активности. Ноио-вогэнные ЛАВ в растворах во ионизируют и, ввднко, поэтому кх влияние на стабильность ферментов ые столь существенно. . - '

Наибольшее влияние на стабильность липаз в растворах окааивавт

Таблида II

Еяиясте компонентов 010 на стабкльность лиаав а растворах (40°С)

Компоненты СИС

Стабильность препаратов липаз, %

20 мин | 60 мш

Дкдориаян ГЗХ Дидоаэрузин ГЗХ

20 мац | 60 мия

Сульфонал Сннтамид-5 Синтетические жирные молоти (С17-С^д)

Триполифосфат натрия Метасвликат натрия йшарбонат натрия Су «фат натрия Яа-КМЦ

Перборат натрия

90 56 96 . 64

100 100 100 100

100 •100 100 . 100

ав 78 84 •82

97 60 98 82

эа 90 98 11 91

100 100 100 100

100 100 100 100

81 65 - 82 54

отбеллвахщае вещества* Для отбаджвания белья в отечественная практххе применяют оптические отбеливателя к перборат натрия, Перборат натрия представляет собой белый кристаллический порошок» часто используется а виде тетрагидрата НаВ0з*41у). Причина значительного снижения фермент-пой активности в присутствии иорбората натрия закдичаотся & том,что ори высоких температурах (40-~0°С) он начинает разлагаться, выделяя кислород, который молот в залмодей с тв овать о активными группами, ослабляя связи, определяете структуру белковой молекулы.

Таким образом, проведенные исследования по изучении влияния от-. двхышх компонентов СМС ва стабильность препаратов липазы дозволила . сформулировать основные требования к знаниеодерхацим рецептурам.

При выборе редоптур синтетических иоддих средств» включалдиж липазу, следует использовать неловогеяные ПАВ, ограничить применение / аяиоэогенных ПАВ, иетасЕХНкахов ватряя в тршолифоофатов ж исключить . перборат. ■ .-"г-' ' Ч ,

Испытание мощей способности растворов свежеприготовленных смесей липазы и неиологенных ПАВ дали положительные результаты. еффвктжвнооть удаления жировых загрязнений возрастала на 15-ЭОСС по оравнени» о бе»- , энзимными композициями мощит средств«

Результаты свидетельствуют о перспективности жс^ольэоваяжяЛипо-ризжна ГЗХ в составе чистядого средства. При составлении композиции чистящего средства содвряаяие ШВ ограничивала 20? от массы смеси. В качество наполнителя использовали сузпфат натрия» т.к. вами было показано, что солж На+ окятапшпт стаДилизирутшее действие ва липазу гриба $. лгу я ае Ш4 (тайд.Х2). Игучеваеффективиость композиций при обеажм-риьашш юли образцов стандартно загрязненных шерстяных я хлопчатобу-

Совместимость » стабильность Липоризика ГЗХ в составе чистящих композиций ори хранении

Таблица 12

Кси-

пози-

Состав

чистящих ; композиций'

Концентрация. компонентов,?

Липолитическая актевнооть,$

Длительность, сутки__

О I 5 "f ю ") ','.'. 30 „.

ДяпоразхнГЗХ

ТИ-На

HaaS04

1.0 20,0 79,0

97,0 80,0 76,0 72,0

■ Лшюриэиц ГЗХ 2 Снвтамид-5.

х» о 20,0 79,0

94,0 20,0 9,0 6,0

Лнпоризин ГЗХ 1,0

На^Од л' ■ . 99,0

94,0 36,0 30,0 30,0

мажных тканей. На основании проведенного исследования по применению Лиаоразина ГЗХ;в составе чистящих композиций можно утверждать, что:

- наилучшие результаты достигаются при использовании композиции, состоящей из 20$ триполифосфата натрия, 79$ сульфата натрия а 1% Лдпо-риаива ГЗХ о активность» 50*Ю3 ед/г;

наибольший чистящий Цфект (на 25-60$ вше,чем при химической ^ чмсгхе) долучаотся на образцах загрязненной шерсти; . '

- использование Липоризина ГЗХ в чистящем растворе (1$) экономически выгодно, а главное снимает необходимость работать с органическими растворителями, улучиаот условия работы и не снижает качество очищаемых тканей!; -

.■■'. Липоризин ГЗХ испытан в составе биологического чистящего пятнови-водного средства (БЧС) в сочетании с амилазой я нейтральной протеазой и средства для предварительной обработки текстильных изделий "Москвичка" » сочетании о щелочной протеазой. Работа проводилась в лаборатории промышленного биокатализа АО "Биотехнология* совместно с д.т.н. Гребе-шовой Р.Н. и к.т.н. Рышковой Т.М,

, Лабораторные испытания показали 100<-ную стабильность препарата Липориэкн ГЗХ в смеси о указанными средствами при хранении в течение трех месяцев при комнатной температуре. Диоаза совместно с амилазой и протеазой в'составе БЧС обеспечивала полное удаление с ткани искусственного загрязнения из молочного жира, растительного масла и молока. Однако, существенных улучшений чистящих способностей ШО с комплексом ферментов по отношению к БЧС с Липорнзшюм ГЗХ не наблюдалось. Йо-аи-днмому, »тот,факт возможно объяснить том, что Липоризш ГЗХ явллотся

хомпдексным преоаратом, обладапдлм наряду со способность» расщеплять хиры протеоитичосяой я амклаэной активностями, Оценка действия Лшо-рвзява Г31 в составе пятвовыводных средств проводилась в химик о-евап-тжческой лаборатории ЦЕШН битового обслуживания. Результаты испытаний показали высокую эффективность дятновывсдопа препаратов "Цультявнахм", "Субтянол*, содержащих Липоризин Г31, в отношения удаления жировых загрязнений.

2.4.2. Применение липазы в составе иопогх

средств дня пищевого оборудования .,! -

". ■ , ' е

Исследование в внедрение проводили совместно о лабораторией ВНИК-синтезбеяок, руководимой Суповой JT.II.

Проблемой первостепенной важности в рыбоперорабатывапцей отрасли является мытье коптильных подносов х оборудования для тепловой обра- ■ ботхи рыбы. Плохое снятие жирового загрязнения приводит к ухудшению качества рыбного продукта, к увеличению обсемененностд михрооргадизма-на оборудования во время простоя, к прогоркашт жира, придающего неприятный запах в вгфс продукту, к ухудаению условий труда*

Изучение действия Липори вина ГЗХ проводили в составе ыощяг средств "Триас", "11охсин", "Лабошт", "Порошок для мойки пищевой посуды", разработанных БНШСИНХ ж Щебвхв&еким химкомбинатом (табл. 13). ,

. ,Таблжш 13

Совместимость и стабильность Лшюриахна ГЗХ в составе различных мовдих средств

*» ЦП Наименование СЫС Совнестхмооть,£ Стабильность при• длительности хранения 6 месяцев Д

I г Трвао иолеин 100 юо • 60 во

3 Лабомит х00 50 ...... • ••

4 Порошок для ио&кв пищевой посуды 72 56>

Исследование действия фермента в растворах мпттпг сродотв при различных температурах дало возможность определять оптждальвух температуру ыойкя пищевого оборудования - 400с. Одним из требований,предъявляемых к цопцим средствам для пищевого оборудования, является жх ав-тхкоррозийность. Доя придания антжкоррозжйных свойств СПС всполыуют различные ингибиторы корроаиж, вводя их в состав мохщхх средств жлх хспохьауя в качестве самостоятельных растворов. Еажболое распроотра--яеннымн ингибиторами корроавх являются метасхлххат натржя, Г-2-41 (гек:> саметшенжмжн нктробевзойвоА хголоты) ж ДЬАН-2 (диэтмлаюга-Ц-нггробен-

. ; V " - 49 -

войнохяслнй). Результата исследования воздействия ингибиторов коррозии

па фермент представлены в табл. 14, из которое следует, тго Дипоризин

ГЗХ полностью совмещается (на 100*) я проявляет лучшую стабильность

(60?) о метасяхннатом патрия.

. - таблица 14

Действие различных ингибиторов коррозии па Липоризин ГЗХ

«9 ПП Наименование - ингибитора коррозии- Концентрация ингибитора коррозии, > . Совместимость, % Стабильность, X

I Ыатасвлжхат натрия ОД 100,0 60,0

2 Г-2-41 ( 0,5 33,6 0

3 ДаАИ-2 : : ^ 0,5 33,0 0

ИатаяЯ препарет СМС-1, вклгчапдий в качестве основы мовдее средство "Триас",'Дипоризин Г31 2% к массе СМС з-0,тХ метасиливата натрия, был яаштйл ва рыбзавсде СОЕК пм.С.М.Кирова (Эстония). Для испытания были ислолъзогпны разделочные подносы яз алшшшя. Визуально результата мойки оценщ-мись положятально. Дополнительным положительным »фрахтом от яспохв&яаняя предлагаемого энзимссперавщего мошего средства явхязясь сохранение потребления предприятием алектроэнергии (подогрев воды), улучшение экологической обстановки предприятия (снижение доз . мовдвгосредства).*

2.4:3. Ферментативное обезжиривание меха я воин ->'.• Показана перспектквность использования липазы Й.ои/гсге 1414 при обработка шховаго к кожевенного сырья в качестве обезжириваниях агентов. Использование предлагаемых ыопцкх растворов для обезжиривания моховых овчин способствует более интенсивному удалении дипидов о волосяного покрова, сокращенно длительности процесса обезжиривания с 2,5-4,0 часевдо 1,0-1,5 часов, улучшению пластических свойств коже-вой тханя (табл.15).

' , :. Ва АЛш-АтЕнскоц маховом комбинате им.50-детжя СССР в условиях снрейно—красильного производства при обработке меховой овчины препара-. том ДипорнзинГЗХ подучен годовой экономический з$фект 10000 долларов. Заявленная потребность данного комбината в препарате Дипоризин Г31 составила 3,5 тонны в год.

2.4.4. Разработка условий применения Лхпоризина ГЗХ в

, обработке кишечного сырья для колбасного производства

• Исследование и внедрение проводило совместно с чд.корр. Мсддуна-рсщной Академии "Холод4 профессор«« АнтгповоЗ Л.В., ааведуксей кафедрой "Технологии мяса и мясных продуктов" и Воронеже ко Л Государствен-

Таблица 15

Вдяязше состава допрос растворов на свойства волосяного покрова в ножевой ткани овчины

Показатели качества волосяного покрова и кояевой ткани Вариант обработки

I 1 Ш и (контроль)

Реакция Либеркана.1

-поело I стадии обезжиривания зеленый зеленый зеленый темно-зел.

-поело П стадии обезжиривания св.-зел. св.-зел. св.-зел. зеленый

Содержание лиаядов в волосяном

покрове, %

-лосло I стадии обезжиривания 3.4 3,5 ' 4.6 8,3

-после П стадо обезжиривания 2.3 2,3 2,3 2,5

Нагрузка при разрыве, Н 42,5 52,6 34,4 43,0

Предел прочности при разрыве,Ша 7,3 - 10.0 6,1 ' 9,1

Удлинение при разрыве, % 98,0 ' 90,8 65,4 79.4-

Удлинение при напряжении 4,9 Ша • *

-ПОЛНОЙ, % 73,0 61,5 6.3,4 61.7

-остаточное, % 54,5 45,7 48.0 46,8

—упругое, % 18,5 15.0 15,4. 16,0

Появление трезвы лицевого слоя:

-при нагрузке, Н 29,5 40,7 22,7 ,34.2

-при удалении: % ' ' 74,5 73.2 70.3 69,0.

вой технологической Академия. Результаты проверки на патогешость втам-ма Я. atyiatUlA показали, что введение в корм животных гриба в дозах' 1*1(Р и 1-ГО8 не позволило выявить патологических изменений внутрсянжг органов подопытных животных, их гибели на указанных дозах и носитедьст-ва штамма. По результатам токсикологической оценки препарат Липоризин ГЗХ относится к мадотоксичявм химическим веществам - 4 класса токсич- . ности. Липоризин Г31 не обладает аллергенными ж ембриотоксггескимн свойствами в дозах, рекомендованных для его исааяьзовайия в промттлен- ... ности. Скаршшвание препарата балы» красам в течение 35 дней в субтое-сических дозах (1/ГО ЛДад и 1/50 ДДзд) не вызывало у них летальных походов и патологических изменений внутренних органов, что свидетельствует об отсутствии эффекта материально! ^функциональной кумуляции препарата. Безвредность препарата Липоризин ГЗХ отиршт. новый аспект исполу зованяя о того препарата в цвдовой промышленности, в частности, в обра- . Сотке кишечного сырья для колбасного производства.

В соответствии с проведенными исследованиями предложена новая технология обработки кишечного сырья (рмг.19). * - "

-SI -

Гистологические исследования тканей кишечного сырья, обработанного механическим и ферментативный способами) показали идентичные результаты, т.е. эффективность действия этях двух способов на серозный уюй одинакова. - .'

Предлагаемая технология имеет следунцие преимущества по сравнение традиционной (механической): .

- водностью заменяет наиболее сложное електромеханяческое оборудование по разрыхлении и удалении серозных слоев (оляма), которое требует значительных энергетических затрат на аксддуатацип; в случае лредлагаемого решения энергозатраты связаны лишь с использованием воды с температурой 37-40°С;

- практически не влияет на деформацию тканей, и не вызывает разрывов кишок, равномерно я полностью удаляет шлям;

- значительно улучшатся условия труда (отсутствие пума,вибрации, значительно сокращаются ручные операции).

Патент, полученный на использование препарата Липоризвн ГЗХ в гахиологии мяса и мясных продуктов на способ обработки кишечного сырья пдя колбасного производства, успешно используется на Воронежском мясокомбинате. Экономический эффект составил 1600000 рублей при обработке ] т кишечного сырья в ценах 1993 г. :

ВЫВ ОДЫ

1. Путем скрининга среди эукариогкых в прокариотгод микроорганизмов и естественного отбора получен швш. S.spfinoidts U8-2, обладающий высокой биосинтетической способностью к образованию дшокеиге-назы. Доказано, что липоксягеваза S. sphtwtcfts ltö-2 принадлежит ж псллферментной системе (ПГ-синтетазв), осуществляющей биоспецифачес-хяй синтез простагланданов. Изучены особенности биосинтеза ПГ—синте-тазы и протеолятических ферментов штаммом в процессе роста, определены ■, факторы, регулирулдие биосинтез этих ферментов. -

На основе полученных экспериментальных данных я теоретического обобщения выявленных закономерностей регуляции биосинтеза ферментов сформулирована концепция единого механизма регуляции синтеза послед- : нзех. Предложена универсальная модель процессов биосинтеза и его регуляции. На основе предложенной модели описана биохимическая основа функционирования ПГ-синтетаэ, протеаз на генетическом уровне. Ыодель позволяет прогнозировать ход реакций синтеза определенных ферментов я спрэдэ.ищт пути их интенсификации.

2. Разработаны научные основы,! не имевдие аналогов, технологии

и.применения, простаглацдшюв.и ПГ-подобннх веществ.Доказана

пврспекткввость их применения в качестве кормовых добавок в зверок, отве я как профилактическое средство, стичудирупцее репродуктивную систему хивотша в ветеринарии.

Предложена технология комплексного использования культуральной жидкости S. spheioidís ДО-2 с целью производства различных групп Оио логически активных веществ, образуемых ддн1шм продуцентом.

3. Разработана я апробирована в промышленных условиях технолога культивирования Л, atezas 1414, явившаяся основой для составления на обходимой технологической документации по этой стадии производства:

- разработаны эффектные метсгз* поддержания штамма-продуцента. Сконструированы новые питательные среда на основе дешевых в доступных видов отечественного сырья для стадии размножения вегетативного посевного материала я биосинтеза ферментов,

- экспериментально обоснованы оптимальные параметры биосинтеза липазы (рН среды, возраст и доза посевного материала, аэрация),обвеян чиващиз максимум накопления фермента,

- разработаны условия культивирования И. oi^iat 1414, позволнвди учесть физжолопгчеокие особеннооти микроорганизма. Опытным путем о во пользованием. квазидинамического управления по температуре определен оптимальный:1 профиль культивирования, обеспечиваадий максимальное накопление липазы. Па Приволжском биохимическом заводе использование разработанного температурного профиля позволило увеличить выход целевого продукта на 60-65?, сократить время культивирования до 44 ч, а также повысить стабильность культуры.

. ; 4. Разработаны для промышленного использования способы выделения васоаоочащенвого ферментного препарата липазы из R. oiyzan 1414 с выходом .ХЗ^г-Впервые применен метод металло-хелавдффшшой хроматографии для фракционирования ферментного комплекса R. aigiae 1414 При иэу чонеи свойств высокоочищенного препарата впервые осуществлено выделение гомогенной липазы ,R, otyzaí 1414 о pl 4,7.- Степень очистки при по-лучевая гомогенного препарата составила 44 раза (по сравнению о исходным препаратом/Ллпоразан ГШ), удельная активность 142«Ю3 ед/мг белка. Опвородаость ферыэята подтверждена методом електрофореэа, методом определения коэффициента скорости седиментации, гель-фильтрацией,изо-влвктрофокусированием. Определены молекулярная масса, коэффициент скорости седиментации, изоэлактрнческая точка, термоотабильность и pfi-стабильность, юшетжческио свойства лхпазы. Установлено, что липаза & 0«^М£1414-гликапротеид, обладают чй четвертичной структурой. Она ' состоят иу'двух субъодишщ с молекулярной массой от 18 до 20 цЦ, активных в отношения триацилглицеринов с короткоцепочечными насыщенными

• - 54 - S;-;'

ирпша кислотами (триацетжн, трвОутараа).

Выделенная липаза обладает позиционной спвцнфячиостыг--1(3. •

Подтверждена концепция od участии дипавы в реакциях перевтериф*-хацжи я синтеза ионо— я даацжжцжжцерИнов.

5. Изучены различные способы нимпбцизагшилипази нворгвничесю^ и минеральных носителях. Показана перспективность использования методов физическое.демобилизации ва минеральных носителях для прокшаленво» то использования. Проведено сравнительное изучение свойств и кинетических характеристик вативаой. я яммобвливованнов липазы* Подтверждена принципиальная'возможность разработки промышленного непрерывного гидролиза жиров и ше&з на основе гетерогенного катализа о применением иммобилизованных липаз.

6. Разработаны научные основы технологии применения препаратов "Липоризин" различной степени очистки: .

- показана возможность применения Лиооривиаа Г31 в меховом и кожевенном производстве, что подтверждено лабораторными и полупроязвод-ственными испытаниями. В результате сокращается время обезжиривания, улучшатся прочностные ж пластические свойства боковой ткани вцдалая-ных шкур, свойства и качеств" меха;

- разработавы ваучно-обоснованные режимы применения липаза в сом1 отаве синтетических мощкх средств (CMC) бытового назвачвцжя и для • тодических нужд пищевой промышленности; Предлагаемые рехамацдадЕН ш» составлению рецептур CMC апробированы в полупроиаводстведшд ушгояшл/ Выявлена высокая мощая способность биоактивных СИС»пр* удаления загрязнения на 35-45JC древосходячая »тот показатель в случае обычно ио-» пользуемых детергентов* Чистящий еффект композиций, содераащих Липоризин ГЗХ, при чистка перстяных тканей ва'б(# превышал »ффактявнооть действия органических растворителей, применяемых в настоящее время яри химической чистке;

- эффективность действия цреоаратов липазы /?. ои/Юв 1414 при гидролизе жиров позволила осуществить внедрение их в «яюну» прсмыдден» иость в процесс обработки кишечного сырья ддя колбасного производства Разработана и внедрена принципиально новая технология удаления сероэ-« внх слоев кишечного сырья, ш>звсжявдая без'деформации ж разрыва киво* равномерно удалять вш/. ,;:' ч.7:-'.- • '■■■' ■'"■', *' " ■ v "'■"'■! х

7. Внедрение результатов научно обоснованных режимов применения исследованных ферментов в различных отраслях отечественной прокымлев* кости позволило получить зкономический аффект свыше 45000 долл.в год. Применение липолитических ферментов в кожевенном,моховом производствах, в вдсолерерабатнвапцей промышленности, при использовании внзим-осхда-^гх »:ояаи£ и чистящих средств дозволяет внедрить малоотходные

»

я безотходные технологах, что в современных условиях ори возрастай^ загрязнении окружавшей среди является исключительно актуальный.

Список работ* опубликованных во теме диссертации

1. Захустина H.A.. Тихомирова A.C., Рафаловская Т.Д., Янголь Кривова A.D., ФадиЕсова F .В. Получение и свойства препарата Фермента вз йШхпачд -ttnms . // Приклад.биохимия я макрооцилогм. 1975, 1Q, вып.5, С.725-72Э. .

2. Каяушшц К.А., Ваганова И.О., Щусь Г.В,, Грачев Ю.П.,Кр*шош А.*;, Оптимизация состава питательной среды для глубинного культнг>иро№ няя // Цикробиологгческая прои-сть, спец.выпуск, С.24-Ш.

3. Кривова A.D., Аль-tíypa U.A., Егоров Н.С. Сютимвзакия пмтатолыша среды для S. spHttetats - продуцента протеолитяческих фераеигоь фибраволитжчесящ действием /ЛМикробиологня,197е,45,4,С.б1Г/-С1;;.

4. Егоров Я.С.* Кривова А.Ю.. /лъ-КУРИ U.A. Влияние состава дитатши вой среды на торао- я рН-стабпльиость препарата протеаз // Приклад йхохимяя.я микробиология, 1977, 13, 5, С.659-662.

5. Егоров U.C., Краьова A.D., Аль-Цурн ÏIJU Влияние состава сраку и дкитальностя культивирования на рост $. sphezeiäes я биосиитоз

. /Тиифобнодогая, 1977, 46, 6, СЛ007-ЮЙ.

Кривова A.D.. Егоров Н.С., Аль-Лури U.A. Влияние аэрации а шзшт> •

-, протеаз я новобиоцииа при глубин-

•ДЗГ47 ЬЖЖ. 1 " DPW.ÖHOXHMHH И «икробио.

7. Кривова A.C.. Ахь^Нур* U.A. Биосинтез нротеодитичвских ферментов и дняоксягеказы культурой s, spf>etot4¿s 7/ в «б. "Проблемы микробиологии я вирусологии*, 1977, изд. Зинанте, Ржга, C.I06-IÍ2.

8. Кривова A.C. Биосинтез Ферментов культурой S, tphttotde$. // рес-^^д.ваучн^тео^аонф.модо^сученых микробиааогов. Тез.донл,,

9. Крявова A.D., Аль-йуря ПЛ. Биосинтез Ферментов медицинского назначения ^^öS^fl ' sf>Aexoideí // микробиологический хурн..

10. Кривова A.C. Образован» актхяомицвтов рода Sttepürnycts шютеаа о фибривалитическим действием я лхпокскгенаэы // 6-ая конф.иоладш ученых. Латв.респ.отд.B-îÛ3. Тезисы докладов. Рига, *977,С.1ГМ1.

П. Егоров.Н.С.» Грачев D.H., Кржвова A.C., Аль-Нури М.А.., Баранова ■ ^дда йюсашмаа^пртводжтяческих феркештов //A.c. ссор

12. Кривова A.D.. Аль-Üyp* U.A. Биосинтез ферментов культурой S. s/>he-

13• Кохе II*. Кривова A.C.* Воробьева Л.И., Бабьава И.П, .Вокшковб h.C. Оптямиза^ая^среды^дая обжалования биотит дрожжами // Сриккад.био-

14. Кшвова A.D. Влияние шпш восстаиоаятолей на синтез фошоптоо К^турой ¿ ученых. ЧГез.до1сдадо6. Изд. а^твеГРжга; 1980, СЛ24.

15. - tXiivava ¿Ju., Cjaior fi S. &t-tfux¿ MJ. Ъ-fftci aération and teduceis : on iht Siosunthtùt of pwitases ал</ hovabiocin alvtirtg suémeigm

cuCiiiration of Octinorrryces spftewitfes //QSsiiact Symposium * áúrt«t/rno¿óp¿e* Svdopesí, fSSo,p.¿>7.

' ' - SS "*

. ;{;)iiBûEii н.О., ¡¡торов U.C. »А.ть-Бурп ¿i.A. Регулцроваеяы2 Ö£OCJ3T0J 6O> пиески активных-вз-пств яультуроЦ S.sphtt»iats. /лТзорлЯ а практика управллз:хэго кудьтдв.ийкро-./ов^11а;.г1Сот а. Клав »1981,0.69-70.

•7. Кровава A.D., Егоров Н.С., Адь-Йурн U.A. Регулируемый биосинтез биологически активных веществ культурой s. sp/nioidts // Сборник ' статей "Теория я практика управляемого вужьпшярованяя няхроорга- . нязмов. Наукова думка, Киев, 1981, С.&9-78. ••...-.

»8. Крхвова A.D., Егоров U.C.,' Алв-Нуря H.A. Некоторые аспекты регуляции биосинтеза новобиоцива я вкзопротеаз в культуре S. spht\B¿ats - , //Антибиотика,. 1984, 5, С.332-344. - - :

X'i. Кривова A.D. Подавление внеклеточной фешентативяой активности некоторыми факторами среди // Цккроорганязмы-продуценты биологически активных веществ. Теа*докя. Рига, 1984, С.83. v

20. Кривова A.D. Зависимость синтеза вяаыеточных протоаз я липокси-, геиавы от фазы роста S. sphtwides .вошокность их применения // В сб. "Пути совершенствования технол.проц. д оборта.для проиэ., храя.,трап. продуктов питания . Твз.докладов.Ц.,1904, С.154.

21. ЕгоровН.С., Аль-41ури ПЛ., Иваница В.А.. Кривова A.D. Способ оп-^делегая^шбрхнсмштичеокои активности // A.c. СССР. * I2II292, -

22. Кпивова A.D. Регуляция синтеза ферментов в культуре S.sphtioiJtí П 7 сьеэдВМО. В со. "Достижения микробиологии - практика? Тез. докладов. Т.2, Наука, КОСР, Алма-Ата, 1985,. С.9-81..

23. Кривова АЛ). Дерепрессивный биосинтез зкзопротваз культуры $.tphti*l-dei // Совещ. но фермента* шкроорганизмов. Тев. докладов.Над. ; МГУ, 1985, С.69. . , .,■ - .;■■; ,

¿i. Кривова A.D. Влияние взрация на синтез цпотеодитячеоетх ферментов н новобиощша ктдьтуроЛ S. spAetoides 77 В книге "Метаболизм микроорганизмов*, иад.МГУ, I9G&, С.193-19Э; ,'■ .■"■■v ..:■ ■■ ■-..■'■

25. Кшвова A.D. Глпдоамадаззая активность аудьтущ £ndotr>ytt>p*is tp, ' /7. В ка.. "Метаболизм микроорганизмов", над. МГУ , 1966, C.2I9-225.

2S. Кровава

.Н., Кровова A.D. Оэтиыизаджя состава питательной среда тематического планирования, мсспэримоыта // В яв. "Ивта-роорганязмоа*, изд.ШУ, 1986, С.85-Х34. ... v.-^ ■ \ л

иэдл

27. Максимов В. методом математического болязм микроорганизмов"

28. Кржвова А.Ю., Егоров Н.С.,Аль-Нгря М.А.Иопольаовгшнв различных »«етадов хроштографии для очясхки балков культура S. sphexoidts //Материалы Симпозиум! по хроматографии. Будапешх, . Венгрия,1986, ■■

39, Аль-Нури Ы.Д., Кривова A.D. Усовершенствованные метода определения активности протеаз с фибринолитич еским действием я лшохсгг«-вазы // Материалы 5 Всесовзн.конф. по мвтодам цолучедияиаважиза ' бяохим.реактявов, Оршда, нзд.2ннатне, 1987, С.6-Э. ' ; -

-33, Кривова A.D., Аль-Пури М.А., Решотова И.С., Подозкова ЕД. Троно-формапия неласаденша жириых киолрт драпами // В сборп. "Ыххро-оийл.денотрукция орг.остатков, МГУ, П., Д987, : ;

31. Егоров Н.С., Аль-Нури МД., Прохорова А.Д., Кривова A.D..Bato особенности биосинтеза екзопротеаз культурой S. fpéttPides [ lio /? Лея. во ВШИСЭ1ГГИ, М.Г1989, * 2/C.83. ;

Svttanavtithjv.A., fCunn KtünovaXtitSarotchnina 'i.V. Rtattîanctiy

33. ¿Atorngtoexapty oppfScittair fox -fatty aart W pioduation oj tyfa-. stn'CCx* cômpovds in SUeptoim(ces xcseatcb. //QSsttact Jib.

Syrripostvm CnxamatogzQpAy. Qvdapest.^ /iSo.fi.S~

34. Мавх'А.Т.," Вржещ П.В., Кривова A.D., Еасеалч ß.B. Еяоспецифичео-синтез цростагдгшдеиов о участием иммобилизованных ферыелтов

., В cd. "Получение s применение иммобилизованных ферментов в науч.иссл. s медицине", тез.докл., 1980, С.87.

35. Мевк'А.Т., Варфоломеев С,Д., №колаев A.B., Игумнова it.Д., Мамо-. ■ дол Д.А., Кривова A.D., Захаров В*В., Чурюканов В .В. Q влиянии !' простагианкин Н-сгспгетазц на заживление линейных ран //В сб."Ии-, I' жйнерпая ввзимология", тез.докл., Вильнюс, 1989, С.83~Ь4.

33. Егоров Н.С., Ал£-Вура ИД., КрнвоваА.Ю., Прянишникова Н.И., Ва-I. сижьапа ЕД. Шташ актиноминота.ислольэуемыи для получения хипо-. ! ксягеваза//А.о. СССР * I4725ÖI, 1989, <tas.Î47

37. Кривова A.D., Полозкова Б Л., Егоров R.C. К вопросу о трансформа- • V .цяи ненасыщенных жирных кислот бактериями // CÖ лщтч.трудов "Био, |; лога ш*|оо|^ к лее использование р народ.хоэ.*, Иркутск,ИГУ,

'38. Кривова A.D., Дрдпгдктсова H.H., Ефремеш» A.A., ЕгоровН.С. Неко-I - торыэ своаства лнповсигеназн ахтиношщвта // Сб.науч.трудов "Вио-л^я MsiKgoojr^ я кс. использование в народ .юз.", Йрлугск, ИГУ»

39. Кривова A.C.. Оолозкова Е.А.. Казанская Л .в., Максимова Т.Н. Применение дипоксигеяазы при получении цроотаглаяотшов о использованием их'в животноводстве // Всесовэ.конф. "Uxxpoopr,стимуляторов гяо.роста растаы. и жив., Tos.докл. Тагаент, 1989, С.97.

40. Кривова A.D., Климова И.В., Савочкина ИЗ., Катуков Д.С., Цвотко-

, аа Н.Н., Фросина И.И. Выбор условийjroraeHHH культуральной жидкос-та^ст^ептоишугса^//Два. ВНИИСЭНТИ ВНШБиахиммашпроект. U. ,1909,

41. Кривсва А;!)/, Ириков И.В., Климова ИЛ», Зайцева C.B. Установление « .. оптимального температурного профиля стадии Ферментации // Дел.

: - ВНИИСЗНХИ ВШШБисмей^роектПГГ1990, * ЗуС.Э.^^

42. Кривова АЛ., Кламова И.В., Савочкина И.Н., Тихомирова л.А. Опре-.деление жирнохнелотного состава у рааличшх штаммов // Дел. ВНИИСЭЙШ ШШ^иошшшшроект, АГ./1990, « 2, С.73.

43. Кривова*A.D., Вубноэ В.В., Климова ИЛ., Зайцева C.B. Свойства

: препарата липазы ГЗХ в зависимости от стабилизирушж добавок и режимов (рвепилитвльаой суши // Передовой проиэ.ошгг & мед.пром, >' ; рвком. ддявнедр. 1990, 5, С.23-26. - v .

44. Кривова A.D., ЕгорозН.С., Прянгошиюэа Н.И. определение жирнокио-з - .дотного состава меидрса у продуцентов Ферментов, трансфориирущих Ц Улкдвды хроматограф, в.пищ. и микройиол.мад.

45. Кривова А.Ю., Климова И.В., Кутукоэ ".С., Кудрятов В.Д., Некрасо--i ва. Е.А. Выделение шдакжислог из отходов тйхмаяо-оаточного вроиз-■1т водства //Всесоюэ.науч.-теха.конф. "Совершен.теишол.прод. новых '.-' ^ддов пш^пр^д.^И доСавок испод.ВТ. сырья пищ.ресурсов , Тез.докл.

46; Кривова A.D., Климова И.В., Дмитриева D.E., Кудряшов В.Л., Некрасова Е.А. Культивирование SuviSaeUxivm spec. с целью солуче-

нля лизина на отходах крахмального производства // Всесот.науч.-техн.конф. Соверш.технол.проц, новых видов шщ.прод. в добавок невод.вг. сырья шщ.ресурсов, тез.докл. Киев, 1991, С.48,

I /. Кононова U.C., Судтанович С.А., Кракова Е.В., Кривова A.D. Вовыэ методы получения фарняшовтичесгои препаратов на основе липидов мицелиалышх грибов // Науч.-практ.ко»$. "Ученые в решении соц.-экон.пройд. страны"» тез.дохл. Ташкент» 1991, С.75,

Актидова Л.В., Сиделышкова В.Ц., Аотанин H.A., Кривова A.D. Еио-технологичвсхиА способ обработка юштч. сырья дня получения колбасных оболочек // Новые технологии, 1992» g, 4, С.456-459.

•Ь. кривова A.D., Волошина Т.О.» Мещеряков C.B., Тырсин O.A. Пере »те- • рифпкация жиров о применением иммобилизованной липазы на минеральномносителе // Изв.вузов, Пищевая технология, 1993, * 1-2,

С.64—66.

La. Антипова Л.В., Кривова A.D., Дясхлова Л.С. Способ обработки кишеч-ного^си^ья^дмп|оизв. колбасной оболочки // Патент СССР * I833I45

si, Кривова A.D., Волошина T.D. Оптимизация условий хультявированля липаз выгори* огузое ¿7 Материалы мехдунар.ховф. НТПв АПК, -.i & краткие сообщения. M., 1995, C.I48.

-ТО. Кривова A.D., Волошина Т.О., Мещеряков C.B., Тырсин D.A. Некоторые аспекты иммобилизации липодятическнх ферментов // Материалы международной конференции ИГО в АПК, краткие сообщения. М.,1995,

Кривова A.D., Волошяна Т ^. Влияние конов металлов на активность . нативяой и имиобилизовшшой лттт"*яц // Материалы междунар.ковф. КШ в АШ, краткие сообщения. U., 1995, С.150.

ou Кривова A.D., Волошина T.D., Тырслн Ю.А., Боттжнгер Г. Субъединичная структура s свойства липазы микробного отоисхондбнжя // Материалы ыеадунар.вовф. НТО в АПК, краткие сообщения, н.,1995, С.158.

«j. Оолошша Т.О., Кривова A.D. Новые аспекта применения препарата "Лшориэин гах." и Материалы мездунзр.конф. НШ в АПК, краткие сообщения. M., 1995, С.158. . ,

Тырсин В.А., Мещеряков C.B., Кривова A.D., Азнаурьян 11.П. Разработка малоотходной технологии производства жирных кислот на основе новых ионообменных минеральных катализаторов // Изв.вузов. Пищевая технология, * 1-Й, 1994, С.37-41. ■.'

Кривова A.D., Тырсхн D.A. Способ получения липазы // Поло*.решение ка авторских» заявяу Роспатента от 24.08.93, И 93042492.

S i. Кривова A.D., Волошина T.D., Медериков C.B., Тирсин D.A. Ишобнлн-зация липазы физическими методами и ев свойства // Прикладная бно-хим. н микроб* 1995 (в печати;. .s •

, кривова A.D., Волошина Т.О., Боттинхер Г., Нахалетян Л.А., Головина U.C., Тырсин D.A. ¡^мобилизация липазн химическими методами ж ее свойства // Прикладная биохим. и микроб. 1995 (в печати),

i . к^несна A.c., Тырсин O.A., Горячева Е.Д. Химия жиров // Метод. •паз. лаб.работ. МГА1Ш, 1993, 47 с.

. т^-.ин ii,к., ;ь>анова Д.А., Кривова А.Ю, Специальная биохимия // ■ i f>4i3. лабор.работ, ЙГАга!, 1993, 67. с. v - À ■

(

феосохдг Н.С.Егорову га вяяыввже х работе, д.т.н.» профессору Ю.А.Тыр-сжну за поокишнуюподдержку ироведпш исследований.

Автор яокревве благодарен д.т.в., профессору Л»В.Антхпово1,к.С.н, МЛ.Лх&^уря^ воготему научному сотруднику, к.х.н. Г.А.Фарунгухяну, ф *х.н.О Гв.Мещерякову, Ых.в, С.А.Сулхааовичу за помощь я ценные совели В работе. ; !.' . ' { Искренни) благодарность штор выражает коллегам, прикидавшим участие в выполнено различных атаповмой работы; д.б»н. Мевх АД., . д.м.н. Л.В.КазанскоВ, к.т.н. Т.Ы.РшховоХ, к.т.н. 1.11 Дуловой, к.б.н. ; ЙЛ.Вряшшнжковоа, к.б.н. ЕД.Палошишой, к.т.н. В.Ю.Пружанской.х.т.ы. ' Т.Ю.ВодошшоЙ, И.'в.Кимоьой, начальнжву технического отдела Бернского хшчесхого вавода, х?'б.и. Р.п.коиараасг, главному инженеру Приволл-Ьхого - биохимического вавода, х.т.а. В Л,Сергееву» начальнику отдела ферментация иястжту фитопатологии г.Голхцино,к.т.н, Г.Д.Хатутщэву.

Формат 62 X 84/16 уч. МЗЦ»Т. - листо» заказ » 166

бумаг»

типографекяя

I.I Пвч. Д. 1,1

Тар.

■г. 100

125080 Москва , Волоколшеко» - Ш. II

i - - ; Лейоратория оперативной печати UTAffil