автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.07, диссертация на тему:Технология биологически активной добавки к пище на основе каротиноидов асцидии Halocynthia aurantium

На правах рукописи

МОТОРЯ Екатерина Сергеевна

ТЕХНОЛОГИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ К ПИЩЕ НА ОСНОВЕ КАРОТИНОИДОВ АСЦИДИИ НАЮСУУТтЛ А иКАПТШМ

Специальности:

05.18.07 - биотехнология пищевых проду ктов (биотехнология гидробпонтов): 03.00.04 - биохимия — технические науки

" 3 ДЕК 2009

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Владивосток - 2009

Райи [а. выполнена в лаборатории биохимии гидробионтов Федерального государственного унитарного предприятия «Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйст-венный центр (ФГУП «ТИНРО-Цекгр»).

Научный руководитель

- доктор биологических наук, старший научный сотрудник Пивненко Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты

- доктор технических наук, профессор Подкорытова Антонина Владимировна

кандидат отологических наук, старший научный сотрудник Касьянов Сергей Павлович

Ведущая организация

— Дальневосточный государственный университет

Защита диссертации состоится 25 декабря 2009 г. в 13 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д 307.012.01 при ФГУП «Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр» по адресу:

690091, г. Владивосток, пер. Шевченко, 4, факс: (4232) 300-751 e-mail: p.ivnenko@tiiiro.tt!

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ТИНРО-Центр». Автореферат разослан «20» ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

О.С. Темных

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование химических компонентов, входящих в состав морских животных, в течение последних лет1 остается на пике интересов биохимиков, фармакологов и исследователей смежных специальностей. Обнаружение компонентов с новыми качественными характеристиками, изучение их структуры и биологической активности позволяет выявить новые виды природных соединении, оценить их физиологическую активность (Еляков н др., 1992; Еляков, Столик, 2003; Пнвненко, 2006: Суховеева, Подкорытова, 2006; Стоник, Толстиков, 2008). Гидробионгы, особенно беспозвоночные животные, отличаются от наземных организмов значительным разнообразием вторичных метаболитов, среди которых доминирующая часть представлена функциональными соединениями. К соединениям такого типа относятся каротшкшды, которые проявляют широкий спектр биологической активности (Cantrell et al., 2003; Chew, Park. 2004; IConishi et al., 2006; Santocono et al., 2007; McNulty et al., 2008). Анализ литературных источников показывает, что каротиноиды морских организмов изучены недостаточно. В настоящее время исследования каротиноидов ведутся по нескольким направлениям. Прежде всего, это исследования состава и метаболизма, а также антноксидантных свойств (Young et в!., 2004; Stahl, Sies, 2005; Wolf et al., 2009), в основе которых лежат окислительно-восстановительные характеристики этих веществ с их уникальной системой сопряженных связей (C'arotenoids 1А, 1В, 1995). На примере астаксан-тнна морских животных показано, что его активность в десять раз превышает аналогичные свойства p-каротина (Mild, 1991). Также проводятся исследования иммуномоАудирующей, противоопухолевой активностей, способности модулировать экспрессию генов, обеспечивал защиту от воспалительных повреждений и неопластических трансформаций (Nishino et al., 1992; Hix et al., 2004; Hughes, 2004; Ishikawa et al., 2008).

В настоящее время в нашей стране происходят существенные изменения в структуре промысла, наблюдается расширение списка объектов за счет видов ранее считавшихся не пригодными для пищевого использования. К ним относятся многие виды моллюсков, иглокожих, ракообразных. В странах АТР ассортимент привлекаемых к пищевому использованию гидробионтов значительно шире, он включает также асцидий — животных, принадлежащих к типу хордовых (Chordata), подпту оболочников (Tmicata). Наибольшее количество их видов принадлежит к классу асцидий (Ascidiacea), химический состав которых характеризуется наличием специфических компонентов пз разряда пептидов (Lee et al., 2001; Jang et al., 2002), каротиноидов (Ookubo, Matsuno, 1985; Choi et al., 1994a; Белорукова и др., 2006), алкалоидов (Еляков, Стоник, 2003; Agrawal et al., 2004; Issa et al., 2004), углеводов (Anno et al., 1974; Lee et al., 1998a; Усов и др., 2002).

В дальневосточных и арктических морях России широко распространена асцидия На-1осушЫа аигаШшт, содержащая в своих тканях каротиноиды в высоких концентрациях. Она обитает преимущественно на глубине от 1 до 65 м, и ее запасы позволяют производить промышленный вылов. Ранее предпринимались попытки обоснования пищевого использования этого Рида асцидии, не получившие дальнейшего развития (Савватеева, 1990), поэтому био-технологпческий и биогенный потенциал данного вида сырья не имеет объективной оценки.

Известны работы по использованию туники II. аигапШпп для получения БАД «Хау-рантин», обладающей стресс-протекторной активностью (Кушнерова и др., 2000; Добряков, 2004). Однако предлагаемая технология обеспечивает еыход каротнноцдов, не превышающий 1 % их суммарного количества в исходном сырье.

Таким образом, широкий спектр биологической активности каротиноидов морских организмов свидетельствует о целесообразности их выделения и использования в лечебных и профилактических целях. Обоснование использования асцидии пурпурной в качестве источника каротиноидов позволит не только расширить сырьевую базу биопрепаратов, но и выявить особенности их состава и биологической активности, предложить новые рациональные технологии переработки.

Цель работы — исследование распределения и свойств биологически активных компонентов асцидии пурпурной как перспективного промыслового объекта, разработка эффективных технологий концентратов каротиноидов и определение их биологической активности.

Задачи исследования:

- исследовать технохимический состав тканей и органов асцидии пурпурной как основу для рекомендаций по ее переработке для производства БАД и пищевых продуктов;

- исследовагь состав биологически активных компонентов в тканях асцидии для обоснования направлений их применения;

- исследовать качественный и количественный состав каротиноидов в тканях асцидии;

- определить структуру преобладающих каротиноидов, входящих в состав сырья и препаратов;

- определить рациональные параметры процесса экстракции и концентрирования каротиноидов;

- обосновать и разработать технологию масляных экстрактов каротиноидов в качестве БАД к пище;

- провести оценку безопасности и биологической активности БАД к пище, исследовать антиоксидантные и мембранотропные свойства препаратов;

Научная новизна. На основе новых инструментальных методов пересмотрены данные по составу биологически активных соединений в различных органах и тканях асцндин пурпурной Я. аигапНит. дана сравнительная характеристика качественного и количественного содержания азотистых соединений (свободных аминокислот, дипептидов, амшгосаха-ров). Впервые проведен анализ компонентного состава каропшопдов тканей и органов асцндин и покачано наличие 8 индивидуальных соединений в тунике методом ВЭЖХ. Выявлено значительное преобладание кислородсодержащих форм (ксантофиллов).

Значения молекулярных масс (с точностью до третьего знака), полученные масс-спектрометрией высокого разрешения, и характеры электронных спектров поглощения использованы для идентификации каротпнопдов и построения структурных формул 5 преобладающих компонентов.

На основе сравнительного анализа способности каротиноидов аецндии к экстракции и реэкстракции в различных системах растворителей впервые разработан способ получения масляных концентратов, показано влияние органических кислот на процесс разрушения ка-рогинопротеиновых комплексов асцндин. Показана зависимость процесса реэкстракции от лнпндного состава растительных масел и жиров морских организмов.

Разработана и научно обоснована технология БАД к пище «Экстракт асцидни масляный» га тушгки Н. аигапИит. Показателем подлинности сырья и продуктов на его основе может служить количественное содержание каротиноида галоцттщкеантина.

Впервые исследовано влияние каротиноидов Н. аигапШип на текучесть мембран в модельных экспериментах. Показано, что каротиноиды из тупики аецндии обеспечивают увеличение структурной стабильности, уменьшение текучести и повышение термостабильности мембраны в жидкокристаллическом состоянии. Установлены антиоксидантндя и иммуно-тропная активности БАД к пище «Экстракт асцидии масляный».

Практическая значимость состоит в обосновании способов утилизации ранее не используемого вида морских органшмов; разработке рекомендаций то комплексной безотходной переработке асцидии пурпурной, включающей создание БАД направленного типа действия; разработке технологии концентрированных масляных экстрактов каротиноидов.

Разработана и утверждена нормативная документация на «Асцидию пурпурную — сырец» ТУ 9253-308-00472012-06, «Асцидию пурпурную мороженую» ТУ 9265-31100472012-06, БАД к пище «Экстракт асцидни масляный» ТУ 9283-315-00472012-07.

По результатам экспертной оценки и санитарно-гигиенических исследований в Федеральном центре Госсанэпиднадзора РФ «Экстракт асцидии масляный» соответствует требованиям СанПиН и зарегистрирован как БАД к пище (санитарно-эпидемиологическое заключите № 77.99.13.003.Т.002367 от 31.10.2007).

Реализация результатов исследования. В настоящее время промышленный выпуск БАД к пище «Экстракт асцидии масляный» (субстанция) осуществляется на экспериментальном участке ФГУП «ТИНРО-Центр», конечная форма производится в ООО «Биополимеры». Установлена экономическая эффективность производства БАД.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на «XII Международном конгрессе по реабилитации в медицине и нммунореабилита-ции» (Таиланд, 2007); на конференции «Современное состояние водных биоресурсов», посвященной 70-летию С.М. Коновалова (Владивосток, 2008); на 9-й Тихоокеанской международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (Владивосток, 2008); на научной конференции «Иммуномодуляторы природного происхождения» (Владивосток, 2009).

Основные положения, выносимые на запит'

> По совокупным признакам (распространению, химическому составу и составу БАВ) асцидия пурпурная На1осутЫа аигапНит является наиболее перспективным видом ас-цидий Дальневосточного региона России для использования в пищевой промышленности.

> Исследование каротиноидов асцидии Я. аигапНит методами ВЭЖХ и масс-спекгрометрни позволяет выделить и идентифицировать преобладающие компоненты. В качестве показателя подлинности сырья и продуктов на его основе может быть использован галоцинтиаксанпш.

> Технология масляного экстракта асцидии Я. аигапНит позволяет получать кислородсодержащие каротиноиды (ксантофиллы) в виде концентрированных препаратов, обладающих широким спектром биологической активности.

Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ, в том числе 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК и один патент на изобретение

Структура п объем диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальную часть, выводы, список цитируемой литературы, содержащий 215 источников, в том числе 140 зарубежных. Работа изложена на 141 странице, содержит 31 таблицу, 30 рисунков и 8 приложений.

Благодарности. Я искренне благодарна своему научному руководителю Т.Н. Пив-некко за помощь и наставления при написании диссертации, а также выражаю признательность П.А. Задорожному, В.Г. Рыбину, Н.М. Саниной за помощь в работе и полезные советы, Н.М. Купиной за ценные замечания по улучшению структуры работы.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Введение. Обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, научная новизна и пракшческая значимость работы.

Гляря I. Обзор литературы. Проведен анализ отечественной и иностранной научной и патентной литературы о химическом составе асциднй, распространении каротиноидов и методах выделения их из природных источников. Показано, что асцидин рода Halocynthia характеризуются наличием высоких конценграций каротиноидов в тунике и мантии, которая в странах АТР является ценным пищевым сырьем. Показано, что каротиноиды проявляют ярко выраженный антноксидантный эффект, являющийся основным механизмом их биологической активности. Каротиноиды обладают мембранотропной, нммуномодулнрующей, противоопухолевой, противоатеросклеротической н противопшемической активностями, способны защищать ДНК от мутаций, воздействовать на экспрессию генов. Показаны существенные различия в биологической активности ксантофиллов (преобладающих в морских организмах) и каротинов (преобладающих в растениях). Проанализированы технологические подходы к получению препаратов каротиноидов. Показана необходимость учета особенностей химического состава объекта, подбора условий, обеспечивающих стабильность, высокий выход и адекватные экономические затраты.

Глава 2. Объекты, материалы и методы исследований. Объектами исследований являлись асцидии Я. aurantiimi, выловленные в зал. Петра Великого (Японское море), а также Styela clava. Сбор Я. aurantium проводили в марте, августе и ноябре 2005-2009 гг., S. clava - в июне 2006 г. Материалом исследований служили: ткани и органы асиид1ш; подсолнечное, льняное, рапсовое и оливковое масла; жиры морских организмов, полученные в лаборатории БАД и фармпрепаратов ФГУП «ТИНРО-Центр»; ДПФХ 99 %-ной чистоты (Sigma Chemical Со. США).

Массовую долю воды определяли по ГОСТу 7636-85. Содержание общего азота — по методу Кьельдаля на приборе «Kjeltec 2300» (Foss, Швеция). Содержание связанных аминокислот устанавлшалн после 24 ч гидролиза обезжиренной ацетоном ткани в 6 N HCl. Свободные аминокислоты экстрагирован! 70 %-ным водным этанолом. Состав аминокислот определяли в стандартных условиях на амшюкислотном анализаторе «L-8800» (Hitachi, Япония). Экстракцию липидов проводили по методу Фолча (Folch et al., 1957). Общее содержание фосфолипидов н их отдельных классов устанавливали по методу Васьковского и Кос-тецкого (Vaskovsky et al., 1975). Жирные кислоты анализировали на газожидкостном хроматографе «GC-16A» (Shimadzu, Япония). Содержание углеводов определяли алтроновьш методом (Кочетков, 1967). Содержание гексозаминов и сульфат-ионов — спектрофотометриче-ски согласно фармакопейной статье (ФС Л» 42-1286-99). Мннерачьный состав устанавливали

в лаборатории прикладной экологии и токсикологии ТИНРО-Центра методом атомно-абсорбционной спектроскошш на пламенно-эмиссионном спектрофотометре «АА-855» (Nippon Jarrel Ash, Япония). Количественное содержание каротиноидов определяли спектрофо-тометрическим методом (Карнаухов, 1988). Состав каротиноидов анализировали высокоэффективной жидкостной хроматографией на приборе «LC-6A>> (Shimadzu, Япония). Исследование токсичных элементов, радионуклидов и микробиологических контаминантов осуществляли согласно СанПиН 2.3.2.1078-01. Согласно известным методам определяли фагоцитарную и бактерицидную активности нейтрофилов (Лебедев, 1990; Хаитов, 1995) и антиокислительную активность крови (Бородин, Арчаков, 1987; Чумак и др., 1992). Мембранотропную активность каротиноидов определяли методом дифференциальной сканирующей калориметрии на приборе «ДСМ-2М» (НПО «Биоприбор», Пущино, Россия).

Глава 3. Результаты и обсуждение. Технохимическая характеристика а с индий. Показано, что размерно-массовый состав асцидии //. aurantium значительно варьирует в зависимости от сезона. Наибольшая предельная масса животного зафиксирована в августе (398 г), наименьшая - в марте (25 г), на долю гемолимфы приходится 40-49 %, желудка с содержимым - 15-32 %, туники - 10-20 %, подошвы - 6-9 %, мантии - 6-7 %, пищеварительной железы - 1,4-1,9 %, гонад- 1,2-1,8 % общей массы.

В результате исследования химического состава асщщии Я. aurantium показано (табл. 1), что ткани и органы животного значительно обводнены (85-90 %) и только жестко структурированная внешняя оболочка — туника — содержит до 80 % воды. Все ткани Я. ашап-tirnn отличаются низкой концентрацией белка: в мантии содержится 10 % общей массы, в гонадах - 9 %, в тунике - 8 %, в пищеварительной железе - 5 %.

Таблица 1

Общий химический состав асцидии И. aurantium, % от общей массы, среднее ± о

Ткани и органы Вода Белок Липиды Углеводы Минеральные вещества Энергетическая ценность, ккал'100 г

Мантия 85,40±1,71 10,1010,21 0,55±0,01 0,62+0,02 3.36+0,15 49,03

Туника 79,70±1,9б 7,90+0,14 0,14±0,0 11,70+0,09 0.52+0,10 81,70

Пищеварительная железа 89,90±2,07 4.90±0,32 0,89+0,02 0,72±0,10 3,47+0,23 31,44

Гонады 87,40±2,14 8,70±ОД6 1,96+0,01 0,83+0,07 1,16+0,11 57,39

Гемолимфа 95,90±1,01 2,80±0,53 - - - -

Примечание. Прочерк-нами не определено.

При исследовании аминокислотного состава асцидий установлено, что преобладающими протеиногеннымн кислотами являются глутаминовая (11-16 %), аспарагиновая кисло-

ты (10-13 %), лизин, лейцин, аргинин. Содержание незаменимых аминокислот в белках тканей асцидин Н. aurantium составляет 35-37 % общей суммы кислот, в тунике их количество значительно ниже. По сравнению с идеальным белком наблюдается дефицит лейцина, изо-лейцина, фенилаланина и некоторых других.

Ткани асциднй также содержат значительное количество свободных аминокислот (САК). Содержание САК уменьшается в ряду пищеварительная железа —► туника —> мантия. Во всех тканях преобладает аминосульфокиелота таурин (33-47 % общего количества аминокислот), что типично для морских организмов. Для гонад асцидин наблюдается значительная сезонная изменчивость количества САК. Относительно высокое содержание таурнна, глицина и пролина определяется осморегулятивнымн функциями этих аминокислот, их соотношение отличает этот класс животных как от беспозвоночных, так и от позвоночных. Отдельно рассмотрен состав протенногенных и свободных аминокислот в гемолимфе, суммарное содержание САК н таурнна в пересчете на сухую массу в этой ткани наиболее высоко и превышает таковое в тунике, маптии и внутрешшх органах в 8-25 раз.

Количество липидов асцидин пурпурной в мантии, тунике, пищеварительной железе не превышает 1 % общей массы, только в гонадах их содержаЕше около 2 %. На долю фосфа-тидилхолина приходится 44-54 % суммы фосфолипидов. Содержание полиеновых жирных кислот 25—18 % суммы кислот в зависимости от органа. Количество углеводных компонентов в асцндии невелико - около 1 %, только туника содержит углеводы (предположительно сульфатпрованный хитин «туницин» (Anno et al., 1974)) в значимых количествах — 12 %.

Для сравнения и определения возможности использования был исследован химический состав другого массового вида асциднй - S. clava, которая значительно меньше по размеру: масса одной особи не превышает 20 г. Доля белковых соединений S. clava также невелика и составляет 5,5 % в тунике и 7,5 % общей массы в остальных органах. Количество аминокислот, образующих белок, в асцидин S. clava ниже, чем в Я. aurantium, а распределение САК подобно: во внешней оболочке содержание таурина - 33 %, ео внутренних органах - 29 %.

Проведено сравнение содержания каротиноидов в различных видах асцидий и показано, что только Я. roretzi (туника) и Я. aurantium (туника и мантия) содержат значительное количество каротиноидов (табл. 2). Обнаружена сезонная изменчивость содержания каротиноидов в тунике: наибольшая концентрация наблюдается в марте. Для других органов заметных сезонных различий не наблюдали. В целом, содержание каротиноидов асцидий уменьшается в ряду туника —> мантия —> пищеварительная железа —» гонады.

В тканях и органах асцидин пурпурной содержится ряд физиологически важных минеральных элементов: К, Са, Mg, Zn, Fe, Mn, Cu. Установлено, что гемолимфа асцидии

включает большое количество ванадия — 220 мкг/г сухого веса, что предполагает возможность рассмотрения ее в качестве перспективного источника для получения препаратов, обо-

гащенных этим элементом.

Содержание каротиноидов в некоторых видах асцпдий, мг/100 г

Таблица 2

сырой ткани

Вид

Орган

Содержание каротиноидов

Источник данных

HalocyrUhia aurantium

Гонады

Пшцев. железа

Мантия

Туника

Целиком

3,2

10,8

16,7

31.6-39,5

Собств. данные

Собств. данные

Собств. данные

Собств. данные

Собств. данные

Halocynthia roretzi

Туника

Мантия

Целиком

41,0-55,4

2,4-3,0

10,6

Choietal, 1994

Chol et al., 1994

Ookubo, Matsnno, 198S

%е/а сг/яга

Туника

Остальные ткани*

Целиком

Целиком

3,2

1,0

1,4

7,5

Собств. данные

Собств. данные

Собств. данные

Ookubo, Matsuno, 1985

S'yela plicata

Целиком

1,6

Ookubo, Mateuno, 1985

Bothrvlhis schlossert

Целиком

2,8

Ookubo, Matsuno, 1985

Bothrvllus violaceus

Целиком

Ookubo, Matsuno, 1985

Amoroucium plicif

Целиком

3,5

Ookubo, Matsuno, 1985

Cicm intestinalis

Целиком

1,4

Ookubo, Matsuno, 1985

Ascidia zara

Целиком

1,5

Ookubo, Matsuno, 1985

Didemnum mosclevi

Целиком

2,5

Ookubo, Matsuno, 1985

Polycitor proliferus

Целиком

9,2

Ookubo, Matsuno. 1985

* Вместе с содержимым желудка.

Санитарно-эпидемиологическая оценка содержания токсичных элементов (ртути, свинца, мышьяка и кадмия), а также радионуклидов показала, что в тканях асцидии данные элементы не достигали предельно допустимых уровней, определяемых СанПиН 2.3.2.1078. По микробиологическим показателям, включающим определение парагемолитическнх вибрионов - возбудителей пищевых токсикоияфекций, асцидия пурпурная также соответствует требованиям СанПиН 2.3.2.1078.

Полученные результаты позволяют предложить следующие направления дая переработки тканей и органов асцидии пурпурной:

1. Пищевое использование — мантия асцидии целиком:

2. БАД к пище и лекарственные препарата: экстракты туники и мантии - источники каротиноидов; гидролизаты мантии и гонад в качестве источника аминокислот, белков и ка-ротиноидов; гемолимфа асцидии - в качестве источника свободных аминокислот и ванадия.

Из перечисленных направлений для дальнейшей работы были выбраны исследования каротиноидов, их состава, свойств и методов выделения.

Разработка технологии заготовки сырья. Показаны и обоснованы условия заготовки, транспортировки и хранения асциднн-сырца и асцидии мороженой. Предчожено выпускать мороженую асцидшо в неразделенном виде (целиком) и с разделкой на органы (мантия, туника). При разработке технологии мороженой продукции нсследоваяы изменения концентрации каротиноидов в тунике и мантии в целой и разделанной аспидии. Установлено, что за 6 мес холодильного хранения при температуре минус ] 8 °С асцидии разделанной и за 4 мес — неразделашюй сохраняется качество сырья, необходимое дзя создания БАД к пище на основе каротиноидов асцидии пурпурной.

Сравнительная характеристика способов выделения каротипопдов. Исследованы различные способы и условия экстракции каротиноидов для обоснования рационального сочетаю« таких показателей, как выход и стабильность каротиноидов. Показано, что для каротиноидов, находящихся в нативных тканях в ассоциащш с белками и лшщцами, наиболее эффективным способом извлечения является первоначальная экстракция этанолом с последующей реэкстракцпей растительным маслом. Использование системы этанол-гексан дает наилучший количественный выход, однако использование гексана не приемлемо в пищевых продуктах. Эффективности систем ацетон-масло и этанол-масло сравнимы. Однако в случае туники система этанол-масло показала лучший результат. При использовании такой двухступенчатой методики выход каротиноидов составляет 82,5 % по отношению к содержанию в исходной ткани (табл. 3). Результаты проведенных исследований защищены патентом № 2339387 «Способ получения биологически активной добавки из асцидии».

Таблица 3

Выход каротиноидов при использовании различных способов экстракции, %_

Ткани и органы Ацетон-масло Этанол-масло Масло Этанол-гексан

Мантия 57,5 50,5 Следы 68.5

Туника 66,3 82,5 0,5 96,7

Пищеварительная железа 40,8 41,2 9,1 100,0

Гонады 66,8 53,1 2,2 100,0

Примечание. За 100 % принято количество каротиноидов, извлекаемое системой ацетен-гексан (Schiedt, Liaaen-Jensen, 1995) при следующих соотношениях: сырье : экстрагент (M/V) - 1 : 10; экстракт: реэкстрагент (V/V) -5:1.

Для исследования влияния состава реэкстрагентов на эффективность перехода каротиноидов в жировую фракцию и получеши препаратов, обогащенных каротиноидами, были использованы различные растительные масла (подсолнечное, рапсовое, оливковое и льняное) и жиры морских организмов (жир из печени сельдевой акулы, рыбный жир. подкожный жир кольчатой нерпы, жир из печени командорского кальмара) (рис. 1).

0,25 -

0

0,02 0,02

0,01 0,005

2 3 4 5 6 7 8

Растительные масла Жиры морских организмов

Рис 1 Способность растительных масел и жиров морских организмов различного состава реэкстрагировать каротиноиды из этанояьного раствора, при концентрации последних 0,04 мг/мл: 1 — подсолнечное, 2 - льняное, 3 — рапсовое, 4 - оливковое, 5 — жир из печени сельдевой акулы, (, — рыбный жир, 7 — жир из подкожного сала нерпы кольчатой, 8 — жир из печени командорского кальмара. Соотношение этанольный экстракт : реэкстрагевт -5:1. Температура реэкстрак-ции 38±2 °С

По способности к реэкстракции каротиноидов наилучшие результаты показаны для подсолнечного и льняного масел, значительно меньше каротиноидов переходит в рапсовое и оливковое масла. Используя масла различного состава, можно получать варианты продуктов, различающиеся составом компонентов (прежде всего ПЖК) и биологической активностью, а также стоимостью. Морские жиры обладают более слабой способностью по сравнению с растительными маслами реэкстрагировать каротиноиды из этанольных растворов. Для создания новых проду ктов, обеспечивающих стабилизацию рыбных жиров и синергетический эффект БАВ, в данном случае рекомендовано простое смешивание компонентов. При наиболее высоком содержании триглицеридов в подсолнечном масле (99%) и их самом низком содержании (40%) в жире из печени командорского кальмара зафиксированы максимальная (0,2 мг/мл) и минимальная (0,005 мг/мл) концентрации каротиноидов в экстрактах.

Исследование состава каротиноидов асцидии пурпурной. Для спектрофотометри-ческого анализа каротиноиды из тканей и органов асцидии пурпурной выделяли по общепринятой методике (Schiedt, Liaaen-Jensen, 1995). Полученные экстракты имели окраску от желто-оранжевой до красной и типичный для каротиноидов трехпиковый спектр поглощения с четко выраженными главными максимумами 452-456 нм (рис. 2). Величина оптической плотности отражала концентрацию каротиноидов.

Учитывая сложный состав каротиноидов асцидии пурпурной и близкие значения Rf хроматографических зон при разделении методом ТСХ, нами был проведен качественный

анализ пигментов туники обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с детектором на диодной матрице.

Рис. 2. Спектры поглощения гексановых экстрактов асцидии Н. аигатшт'. 1 - гонады, 2 - пищеварительная железа, 3 - мантия, 4 - туника

При подборе условий для разделения каротиноидов туники халоцинтни использовали элюенты метанол или ацетонитрил в градиенте концентрации. Однако, несмотря на большую элюирующую силу последнего (Энгельгардт, 1980), эффективность разделения смеси данных пигментов выше в водно-метанольной системе (рис. 3).

(А)

13.5 >8 " Ы.Ь ' » 31.8 34

О 3 Ь Э 12 13 21 24 2* 30

Рис. 3. Хроматограмма этанольного экстракта каротиноидов туники асцидии пурпурной (ОитапЭер (2x20 мм. 3 мкм), скорость элюарованчя 0,5 мл/мин, градиент - 0-20 мин 60-80 %, 20-30 мин 80-100 %, 30-45 100 %, температура колонки — 55 °С). Элюент метанол (А), ацетонитрил (Б). Обозначенные пики соответствуют веществам, характеризующимся спектрами поглощения каротиноидов

Были идентифицированы четыре превалирующих каротиноида туники асцидии пурпурной: астаксантин (3,3'-Д1цтщрокси-р,(3-карот1га-4,4'-дион), аллоксантин (7,8,7',8'-

гетрвдегидро-3,3'-дагвдроксн-р,р-каропш)! Р,р-каротин-2,2'-дион и гидроксиэхиненон (4-гидрокси-р,р-каротин-4-он). Критериями идентификации п построения структурных формул каротиноидов служили значения их молекулярных масс, определенные с точностью до третьего знака, полученные масс-спектрометрией высокого разрешения и характеры электронных спектров поглощения (табл. 4, рис. 4).

Таблица 4

Характеристики превалирующих каротиноидов туники асцидии пурпурной

№ пика Каротиноид Брутго-формула Молекулярная масса, а.е.м. ^тпа.ч

2 Астаксангин С40Н52О4 597,397 465

4 Аллоксантин С40Н52О2 565,402 453

5 Р,р-каротин-2,2'-дион с«н52о2 565,402 423.453,478

6 Гидроксиэхиненон C40II54O2 567,419 477

Мах= 423, 453, 478(nm)

/\

Р,Р-каротцн-2,2'-дион

но Гидроксиэхиненон

Рис. 4. Спектры электронного поглощения в видимой области в метаноле и структурные формулы идентифицированных каротиноидов туники асцидии Я. аигапИит

Идентифицированные каротиноиды имеют в своем составе кислородсодержащие функциональные группы, которые определяют их высокую биологическую активность (Ni-shino, 1998; Ishikawa et al., 2008; Konishi et al., 2008; Hashimoto et al., 2009; Shen et al., 2009).

Критерий подлинности сырья и продуктов на его основе (выделение н характеристика галоциптпаксантипа). Для идентификации сырья и продуктов на его основе предложили использовать каротиноид галоцинтиаксантин (5,6-эпокси-3,3'-дпгндроксн-7',8'-дидегндро-5,6.7,8-тетрап1дро-р.р-каротин-8-ои) (рис. 5), который присутствует в значимых количествах только в асцидиях. Содержание его в сырье и экстрактах составляет около 6,5 % общего количества каротинондов. Наличие галоцинтиаксалтина в БАД и пищевых продуктах из асцидий свидетельствует об их подлинности. Особенность структуры этого каротиноида заключается в высоком содержании кислородсодержащих функциональных групп, что позволяет легко отделить его от остальных пигментов при разделении на прямой фазе ВЭЖХ. Вещество, имеющее время удерживания 12,8-13,0 мин (рис. 5) и спектр поглощения в элюеп-те с максимумом 449 им (рис. 6), представляет собой галоцинтиаксантин. В результате последующего анализа ВЭЖХ на обращенной фазе с масс-спектрометрическнм детектированием в условиях химической ионизации положительными ионами было получено значение молекулярной массы этого каротиноида 598.854 а.е.м., что соответствует молекулярной массе галоцинтиаксантин а.

Рис. 5 Xpouai о-грамма каротиновдов масляного экстракта асцидии Я aitrantivm (Zorbax Sil, гек-сан-ацетон 7 3, 1 мл'мин, 450 им). Пик, характеризующийся временем удерживания 12,8 мин, - галоцинтиаксантин

Время удгржЕЭйняя, мкя

Мах= 449(nm)

! I

Галоциигааксшшш

тг

Рис. 6. Спектр поглощения в видимой области в элгоенте (гексан-ацетон 7 : 3) и структурная формула галоцинтиаксантина

Определение рациональных условий выделения каротинондов из асцидии пурпурной. Обоснованы следующие рациональные условия и параметры ступенчатой этаноль-ио-масляной экстракции каротинондов: соотношение сырая туника : этанол (95 %) -1:5; температура экстракции - 20±2 °С; продолжительность экстракции - 24 ч; соотношение эта-

нольный экстракт : масло : вода - 5:1: 10; температура реэкстракцин - 38±2 °С; продолжительность реэкстракцин -16 ч (рис. 7-12).

40 30

I 20г 10 1

0

14,:

23,4 •5-

30,8 £

35,6 §

1:2 !:3 1:4 1:5 1:10 Массово-объемкое соотношение г»ннка : этанол

Рис. 7. Зависимость выхода каротиноидов из туники асцидии от массово-объемного соотношения туника: этанол_

40 -

и 30 -о

Я 20 -5 10 -

о -

= 11,2

0

10

20 1,°с

30 40

Рис. 8. Зависимость выхода каротиноидов из туники асцидии от температуры экстракции этанолом_____

35,1

I

40

и 30

§ 20 и

3 10 1 Г'

0 5 10 15 20 25 30 35 40 Время, ч

Рис. 9. Зависимость выхода каротиноидов из туники асцидии от продолжительности экстракции этанолом_

0,3 -| 0,25 -| 0.2

0,15 -| 0,1 0,05 0

0,25

Й§5 0,19

0,13 . ■ г- 70б| Ж

;г . Ф

Щ ■

11

¡1

1:3 1:5 1:6 Соотношение этанол: масло

Рис. 10. Влияние соотношения объемов этанольного экстракта и масла на концентри- I рование каротиноидов_

0,3 ! 0,25

г. °-2 0,15

I 0,1

0,05 -о

20 ¡°с:

30

Рис. 11 Зависимость реэкстракцин каротиноидов маслом из этанольного раствора от температуры_______

0,3 и

025-1 0,2 0,15 -ОД 0,05 0

0,25

0

10

Время, час

Рис. 12. Зависимость реэкстракцин каротиноидов маслом из этанольного раствора от продолжительности__

Результаты проведенных исследований были положены в основу технологии БАД к пище. На изготовление «Экстракта асцидии масляного. Биологически активной добавки к

пище» разработана нормативно-техническая документация (ТИ № 36-317-07 к ТУ 9283-31500472012-07).

Была исследована возможность использования сушеных тканей асцидии для полу чеши каротиноидов вследствие ограниченного срока хранения мороженого сырья. Тунику и мантию асцидии сушили лиофильно при температу ре конечного продукта 38±2 °С. Исходное содержание влаги в мантии составляло 85 %. в тунике - 80 %. После лиофилизацки остаточная влажность в обоих случаях составляла 7.5 %. Установлено, что сушка тканей уменьшает экстракцию каротиноидов на 26 и 48 % соответственно для туники и мантии (рис. 13).

40

35 30 25 20 -15 10 -

0

35.6

26,5

6,8

1 1* 2 2* Рис. 13. Зависимость выхода каротиноидов при использовании тканей асцидии до и после сублимации. Массово-объемное соотношение ткань : этанол — 1 : 5. - сырая туника. Г* — сублимированная туника, 2 - сырая мантия. 2* — сублимированная мании.

Присутствующие в тунике асцидии каротиноиды находятся в ассоциации с белками и образуют стабильные комплексы. Известно, что органические и неорганические кислоты способствуют разрушению каротинопрогеиновых комплексов (N1 еЛ а1„ 2008). Эффективность их влияния объясняется кислотной силой и длиной углеродной цепи. В ряду кислот соляная - уксусная - молочная (СНзСН(ОН)СООН) наиболее эффективное влияние оказывала последняя. Влияние на сырую и сушеную ткани было различным, в случае сублимированной туники использование молочной кислоты позволило увеличить выход каротиноидов в масляном экстракте на 15 % (табл. 5).

Таблица 5

Влияние предварительной обработки сырья молочной кислотой на вьгход каротиноидов

1 Содержание каротиноидов

Сырье Исходная ткань, мг/г Масляный экстракт без обработки кислотой, мг/мл Масляный экстракт после обработки кислотой мг/мл

Туника сырая 0.3 0,124 0.023

Туника сублимированная 1.5 0,100 0,146

Разработка технологии БАД к пище «Экстракт асцидии масляный». Схема предлагаемого технологического процесса включает следующие стадии:

Прием и хранение сырья

4>

Подготовка сырья 1

Разделка и мойка

4-

Измельчение 1

-► Экстракция

I

Фильтрование

I

-► Реэкстракция

Этиловый спирт 95 % ■

Растительное масло, вода

Осадок 1

Разделение фракций

Вторичное сырье в качестве источника полисахаридов

Масляная фракция Нормализация

Розлив Капсудцрование

\ /

Упаковывание

4-

Маркирование

4-

Хранение

Водно-этанольная фракция

САК па получение Восстановление

пищевых или этанола

кормовых добавок

При использовании асцидаш-сырца или мороженой неразделенной асцидии для получения туники и мантии обрезали подошву и ротовой сифон с продольным разрезом туловища, отгибали края туловища, удаляли внутренности, зачищали и промывали брюшную полость, отделяли тунику и мантию. К промытой и измельченной тунике добавляли 95 %-ный этиловый спирт в массово-объемном соотношение туника : этиловый спирт -1:5 и выдерживали смесь в течение 24 ч при 20±2 °С. Этанольный экстракт, содержащий каротиноиды, отделяли от осадка фильтрованием, сливали в делительную воронку и добавляли растительное масло и дистиллированную воду, которая способствует расслоению образовавшейся при этом эмульсии на два отчетливых слоя. Смесь выдерживали в темном месте при постоянном перемешивании в течение 8 ч при 38±2 СС. В результате отстаивания наблюдали разделение фаз эмульсии и образование двух фракций - масляной и водно-этанольной. После отделения

масляной фракции водно-этанольный слой направляли на регенерацию спирта. Выход конечного продукта составлял 1,0 ± 0,05 л на 1,0 кг сырья при концентрации каротпнмгдов в масляном экстракте 0,25±0,05 мг/мл из расчета содержания каротнноидов в исходной ткани 36,8±2,0 мг/100 г и выходе 82,5 %.

Одними го основных нормируемых параметров полученного продукта являются показатели: общее содержание каропшоидов и доля галоцинтигксантина, наличие которого свидетельствует о подлинности продукта (табл. б).

Таблица 6

Физические и химические показатели БАД к пище «Экстракт асцидии масляный"

Наименование показателя Значение показателя

Общее содержание каротинолдои, мг/г 0,25±0,05

Доля галоцинтиаксантина от общего содержания каротнноидов. % 6,5 ± 0.5

Массовая доля воды и примесей нежнрового характера, ?4 0,5+0,)

Массовая доля жира, % 98,0±1,0

При исследовании состава липидов в предлагаемом продукте было показано, что состав и содержание фосфолипидов, жирных, кислот и других составляющих полностью соответствует компонентам используемого растительного масла, для контроля качества которого используют согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 следующие показатели: содержание полихлорн-рованных бифенилов, величины кислотного и перекисного чисел. При исследовании контролируемых показателей при храпении при температуре 8±2 °С свыше 12 мес наблюдали увеличение кислотного числа более допустимого, поэтому продолжительность хранения была ограничена этим сроком.

Предложения по использованию вторичного сырья, образующегося на различных этапах производства БАД к пище «Экстракт асцпдип масляный». В процессе изготовления масляного экстракта на стадии разделения фракций отделяется водно-этанольный экстракт, который рекомендовано направлять на восстановление этанола, а водный остаток, содержащий свободные аминокислоты, - на получение пищевых пли кормовых добавок.

На стадии фильтрования образуется осадок, составляющий до 20 % исходной ткани. Проведено сравнительное исследование углеводных фрагментов и сульфат-ионов в проэкс-трагироваиной этанолом тунике асцидии 1!. аигапНит и сульфатированном полисахариде «туницине» из асцидии Н. гоге1г1 (табл. 7). Показано сходство в соотношении количества глнжозомпнов и сульфат-ионов и различие в содержании галактозаминов. Наличие сульфа-тированного полисахарида в осадке после фильтрования позволяет рекомендовать использование этого вторичного ресурса для создания нового биопрепарата.

Таблица 7

Содержание полисахарпдных фрагментов в тунике асцидии Я. аигапЧит __и туницине та Я. гогсЫ, %_

Компонент Туника асцидии Н. аигаштт после этанольной экстракции Туницин асцидии Я. гогсй/*

Глюкозамины 6,34 39,6

Гачактозамины 5,59 5,7

Сульфат-ионы 3,18 26,5

* Данные го работы Аппо е! а1. (1974).

Исследование биологической активности каротнноизов асцидии пурпурной. Для

оценки биологического действия препаратов исследовали мембранотропную, антиоксидант-ную и иммуномодулирующую активности.

Для изучения способности каротиноидов асцидии встраиваться в фосфолипндный слой определяли температуру фазового перехода (Тши) и энтальпию перехода чистого ди-пальмитоплфосфатадилхолина (ДПФХ) и комплекса ДПФХ-каротиноиды методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) (рис. 14).

Рис. 14. ДСК-термограммы фазовых переходов гидратированного дипальмитоипфосфатл-дилхоппна (ДПФХ): его смеси с 1,7 моль% каротнноидами тунихи Я. пигапйнт (А) и растительным каротиноцдом лтотеином (Е) (Ков1еска-01^а1а е( а!, 2003). По оси ординат - тгплопоглоще-ние

Добавление 1,7 моль% каротипоидов асцидип мало отражалось на Ттах, которая снижалась всего на 2 °С, но резко влияло на энтальпию фазового перехода, которая уменьшалась с 7,0 до 3,4 Дж/г. Одновременно с этим исчезал предпереход при 37 °С, который характерен дая водной дисперсии ДПФХ. Добавление 5 моль% каротиноидов приводило к полному исчезновению калориметрического фазового перехода ДПФХ, в то время как лютеин (растительный каротиноид) оказывал подобный эффект при заметно больших концентрациях.' при концентрации 5 моль% регистрировался отчетливый калориметрический переход ДПФХ (Коз1еска<^а1а е1 а1„ 2003).

Функционирование иммунных клеток во многом зависит от межклеточных взаимодействий и мембраносвязанных рецепторов. Каротиноиды способны встраиваться и защищать мембраны клеток, сохраняя целостность иммунной клетки, уменьшая повреждения мембраны н ассоциированных рецепторов. Для оценки влияния каропшондов асцищш на функщюиаадную активность иммунных клеток исследовали фагоцитарную и бактерицидную активности пейтрофилов (по отношению к Staphylococcus aureus штамм 2,09) перитонеалыюй полости мышей, а также антиоксидакгную активность (АОА) сыворотки крови мышей (табл. 8). При изучении эффектов были использованы дозировки, соответствующие адекватным суточным нормам и в 100 раз меньшие. Установлено выраженное иммуномодулирующее действие БАД к пище «Экстракт асцидии масляный». Данный препарат может быть рекомендован в качестве общеукрепляющего средства для снижения риска возникновения сердечно-сосудистых и воспалительных заболеваний.

Таблица 8

Исследование биологического действия БАД к пище _«Экстракт асцидии масляный», среднее±а__

Показатель Контроль Доза .масляного экстракта в расчете на 1 мышь

50.0 мкл 0,5 мкл

НСТ-тест. ОП ■ 103 93,4±1,2 107,8±6.9 104,1+3,3

ФП, % 64,0±3.6 67,6±5,9 82,7±6.9

ФЧ 1,98±0.2 5,0+1,0 2,8±0,4

АОА, % 15,2±3,8 32.0±3.1 25,1±3,0

МДА, нмояь/г 9,5±0,2 8,3+0,2 7.0±0,3

Примечание. ОП - оптическая гаотность; ФЧ - среднее число микроорганизмов, поглощенных одним фагоцитом; ФП - доля клеток, участвующих в фагоцитозе; АОА - антиокислительная активность крови; МДА - малоновый диальдегид.

Результаты токсикологической экспертизы показали, что образцы препаратов асцидии пурпурной не вызывали побочных реакций и гибели мышей. Препарат вводили внутригаста-рально в дозах, в 100 раз превышающих рекомендованные. Полученные данные позволили рекомендовать БАД «Экстракт асцидии масляный» для расширенных клинических испытаний.

В настоящее время промышленный выпуск БАД к пшце «Экстракт асцидии масляный» осуществляется на экспериментальном участке ФГУП «ТИНРО-Центр» и ООО «Биополимеры». Определена экономическая эффективность производства. Выход конечного продукта (масляного экстракта) составляет 1,0 л из 1,0 кг сырья (туника), при концентрации каротиноидов в масляном экстракте 0,25±0,05 мг/мл. При выпуске продукции 100 л за 1 мес и рентабельности производства ДО % стоимость масляного экстракта составляет 982,29 руб. за 1 л.

22

Выводы

1. Научно обоснованы рекомендации по рациональном)' использованию органов и тканей асцидии пурпурной, технология БАД к пище на основе каротиноидов, обеспечивающая их концентрирование и сохранение биологической, активности.

2. Среди наиболее распространенных видов асцидий, обитающих в российской зоне Японского моря, перспективной для использования в пищевой промышленности является асцидия пурпурная Я. аигапПит. Химический состав тканей (мантии, пищеварительной железы, гонад) характеризуется высоким содержанием воды (80-90 %), низким количеством азотистых соединений, включая белки (3,4-9,6 %) и свободные аминокислоты (0,1-3,3 %). малым содержанием липндов (0,2-0,6 %). Для внешней оболочки (туники) наиболее характерными соединениями являются каротиноиды и сульфатированные гексозамины.

3. Сравнительный анализ количественного содержания каротиноидов в различных органах асцидии Я. аигапПит показал, что концентрация каротиноидов уменьшается в ряду туника —> мантия —» пищеварительная железа —> гонады. В качестве их источника целесообразно использовать тунику (40 мг/100 г) и мантию (17 мг/100 г)

4. Каротиноиды Я. аигапПит представлены окисленным» формами (ксантофиллами), состоящими из 8 основных компонентов, из которых 5 идентифицированы методами ВЭЖХ и масс-спекгрометрией высокого разрешения: астаксантин, алдоксантин, ¡$,р-каротин-2,2'-дион, гидроксиэхиненон, галоцпнтпаксантнн. В качестве показателя подлинности сырья и продукции на основе асцидий может быть использован галоцинтиаксантин.

5. Обоснован выбор этанола в качестве экстрагента и растительного масла в качестве реэкстрагеша для выделения и концентрирования каротиноидов с целью получения БАД к пище. Обоснованы рациональные режимы экстракции и реэкстракцин каротиноидов: соотношение сырье-экстрагент 1 : 5, температура 20 °С, продолжительность экстракции 24 ч, соотношение масло-этанол - 1 : 5, температура 38 °С, продолжительность 8 ч.

6. Исследование экстракционной способности растительных масел различного происхождения показало, что наиболее высокий выход позволяет получить использование для ре-экстракции подсолнечного и льняного масел. Установлено, что жиры морских животных обладают слабой способностью аккумулировать каротинонды.

7. Мембрапнотропная активность каротиноидов асцидии характеризуется снижением энтальпии фазового перехода ДПФХ с 7,0 Дж/г до 3,4 Дж/г и температуры фазового перехода на 2 "С, что свидетельствует о стабилизации мембран за счет уменьшения их текучести.

8. Каротиноиды Н. аигапПит проявляют значительный антноксидантный эффект, а также обладают выраженным иммуномодулирующнм действием, увеличивая бактерицидную и фагоцитарную активность нейтрофилов перитонеачьной полости мышей

9. Технохпмическве решения производства БАД «Экстракт асцидии масляный» использованы при разработке нормативной документации: ТУ 9283-315-00472012-07, ТИ № 36-317-07 - и при внедрении препарата в промышленное прошводство. Новизна технических решений подтверждена патентом РФ № 2339387 «Способ получения биологически активной добавки из асцидии». Препарат внедрен в промышленное прошводство.

10. Результаты исследований безопасности и медико-биологической активности БАД «Экстракт асцидии масляный» явились научным обоснованием для использования препарата в качестве дополнительного источника каротиноидов (ксантофиллов), что подтверждено санитарно-эпидемиологическим заключением Л» 77.99.13.603.Т.002367 от 31.10.2007.

Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях:

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК

1. Пивненко Т.Н., Моторя Е.С., Задорожный H.A., Запорожец Т.С. НоЕые природные каротиноиды из дальневосточной асцидии в качестве иммуностимуляторов и антиоксидан-тов // Аллергология и иммунология. 2007. Т. 8, № 3. С. 339.

2. Задорожный П.А., Моторя Е.С., Пивненко Т.Н., Дроздова Л.И. Технохимическая характеристика и перспективы применения дальневосточной асцидии Halocynthia auranüum //Хранение и переработка сельхозсырья. 2009. № 7. С. 34-37.

3. Моторя Е.С., Пивненко Т.Н., Гажа A.C. и др. Исследование иммуномодулирующей и мембранотропной активностей каротиноидов из туники асцидии Halocynthia aurantmm // Тихоокеанский медицинский журнал. 2009. №3. С. 28-32.

4. Моторя Е.С., Пивненко Т.Н. Исследование условий экстракции каротиноидов из туники асцидии пурпурной с использованием органических кислот и жиров морских организмов //Изв. ТИНРО. 2009. Т. 158. С. 388-392.

Патент

5. Задорожный П.А., Эпштейн JIM., Ковалев H.H., Пивненко Т.Н., Якуш Е В., Бело-рукова A.A., Моторя Е.С. Способ получения биологически активной добавки из асцидии : Патент России № 2339387.2008. Бюл. №> 33.

Материалы конференций

6. Моторя Е.С., Пивненко Т.Н., Задорожный П.А. Каротиноиды асцидии пурпурной. Способы выделения и критерий идентификации // Материалы научной конференции, посвященной 70-летию С.М. Коновалова «Современное состояние водных биоресурсов». Владивосток : ТИНРО-Центр, 2008. С. 914-918.

Подписано в печать 11.11.2009 г. Формат 60x84/16. 1 уч.-шд. л. Тираж 100 экз. Заказ № 30. Отпечатано в типографии издательского центра ФГУП «ТИНРО-Центр» г. Владивосток, ул. Западная, 10.

ВВЕДЕНИЕ.б

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Характеристика асцидииЯ. aurantium.

1.2 Химический состав асцидий.

1.3 Общая характеристика каротиноидов.

1.4 Каротиноиды морских животных.

1.5 Биологическая роль каротиноидов у животных.

1.6 Биологическая активность каротиноидов.

1.6.1 Антиоксидантная активность каротиноидов.

1.6.1.1 Свободнорадикальные реакции в организме.

1.6.1.2 Антиокислителиюе действие каротиноидов.

1.6.2 Иммуномодулирующая активность каротиноидов.

1.6.3 Противоопухолевая активность каротиноидов.

1.6.4 Мембраностабилизирующая активность каротиноидов.

1.7 Методы выделения каротиноидов.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Объекты и материалы исследований.

2.2 Методы исследований.

2.2.1 Определение белка и аминокислот.

2.2.2 Определение липидов.

2.2.3 Определение углеводных компонентов.

2.2.4 Определение макро- и микроэлементов.

2.2.5 Определение каротиноидов.

2.2.6 Тонкослойная хроматография/.

2.2.7 Высокоэффективная жидкостная хроматография.

2.2.8 Определение мембранотропной активности.

2.2.9 Определение биологической активности.

2.2.10 Статистическая обработка результатов.

2.2.11 Методы контроля масляного экстракта.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Технохимическая характеристика асцидий.

3.1.1 Размерно-массовый состав асцидий Японского моря.

3.1.2 Общий химический состав асцидии пурпурной.

3.1.3 Состав аминокислот асцидий Н. aurantium и S. clava.

3.1.3.1 Протеиногенные аминокислоты асцидий.

3.1.3.2 Свободные аминокислоты асцидий.

3.1.4 Состав липидов асцидии пурпурной.

3.1.5 Состав жирных кислот асцидии пурпурной.

3.1.6 Сравнительное содержание каротиноидов у асцидий

3.1.7 Состав макро- и микроэлементов асцидии пурпурной.

3.1.8 Содержание токсичных компонентов и микробных контаминантов в асцидии пурпурной.

3.2 Разработка технология заготовки сырья

3.3 Сравнительная характеристика способов выделения каротиноидов.

3.4 Исследование состава каротиноидов асцидии пурпурной

3.4.1 Спектрофотометрический анализ каротиноидов асцидии пурпурной.

3.4.2 Тонкослойная хроматография экстрактов асцидии пурпурной.

3.4.3 Высокоэффективная жидкостная хроматография каротиноидов асцидии пурпурной.

3.4.4 Критерий подлинности сырья и продуктов на его основе выделение и характеристика галоцинтиаксантина).

3.5 Определение рациональных условий выделения каротиноидов из туники и мантии асцидии пурпурной.

3.6 Использование растительных масел различного происхождения и жиров морских организмов для реэкстракции каротиноидов.

3.7 Разработка технологии Б АД к пище

Экстракт асцидии масляный».

3.8 Предложения по использованию вторичного сырья, образующегося на различных этапах производства БАД к пище

Экстракт асцидии масляный».

3.8.1 Направления использования водно-этанольной фракции.

3.8.2 Возможные направления использования осадка (туники) после экстракции.

3.9 Разработка методов интенсификации процессов экстракции каротиноидов из сублимированной туники асцидии пурпурной.

3.10 Исследование биологической активности каротиноидов асцидии пурпурной.

3.10.1 Исследование мембранотропной активности каротиноидов асцидии пурпурной.

3.10.2 Исследование иммуномодулирующей и антиоксидантной активностей каротиноидов асцидии пурпурной.

3.11 Расчет экономической эффективности производства

Б АД к пище «Экстракт асцидии масляный».

ВЫВОДЫ.

Актуальность проблемы. Исследование химических компонентов, входящих в состав морских животных в течение последних лет остается на пике интересов биохимиков, фармакологов и исследователей смежных специальностей. Обнаружение компонентов с новыми качественными характеристиками, изучение их структуры и биологической активности позволяет выявить новые виды природных соединений, оценить их физиологическую активность (Еляков и др., 1992; Еляков, Стоник, 2003; Пивненко, 2006; Суховеева, Подкорытова, 2006; Стоник, Толстиков, 2008). Гидробионты, особенно беспозвоночные животные, отличаются от наземных организмов значительным разнообразием вторичных метаболитов, среди которых доминирующая часть представлена функциональными соединениями. К соединениям такого типа относятся каротиноиды, которые проявляют широкий спектр биологической активности (Cantrell et al., 2003; Chew, Park, 2004; Konishi et al., 2006; Santocono et al., 2007; McNulty et al., 2008). Анализ литературных источников показывает, что каротиноиды морских организмов изучены недостаточно. В настоящее время исследования каротиноидов ведутся по нескольким направлениям. Прежде всего, это исследования состава и метаболизма, а также антиоксидант-ных свойств (Young et al., 2004; Stahl, Sies, 2005; Wolf et al., 2009), в основе которых лежат окислительно-восстановительные характеристики этих веществ с их уникальной системой сопряженных связей (Carotenoids 1А, 1В, 1995). На примере астаксантина морских животных показано, что его активность в десять раз превышает аналогичные свойства (3-каротина (Miki, 1991). Также проводятся исследования иммуномодулирующей, противоопухолевой активностей каротиноидов и способности модулировать экспрессию генов, обеспечивая защиту от экспериментальных воспалительных повреждений и неопластических трансформаций (Nishino et al., 1992; Bianchi et al., 1993; Hughes, 2004; Wojcik et al., 2008).

В настоящее время в нашей стране происходят существенные изменения в структуре промысла, при этом наблюдается расширение списка объектов за счет видов ранее не считавшихся пригодными для пищевого использования. К ним относятся многие виды моллюсков, иглокожих, ракообразных. В странах АТР ассортимент привлекаемых к пищевому использованию гидробионтов значительно шире. Помимо традиционных он включает также асцидий - животных, принадлежащих к типу хордовых, подтипу оболочников (Tunicata). Наибольшее количество их видов принадлежит к классу асцидий (Ascidiacea), образующих одиночные и колониальные формы. Химический состав этих животных характеризуется наличием специфических, характерных только для них компонентов из разряда пептидов (Lee et al., 2001; Jang et al., 2002), каротиноидов (Ookubo, Matsuno, 1985; Choi et al., 1994a; Белорукова и др., 2006), алкалоидов (Еляков, Стоник, 2003; Agrawal et al., 2004; Issa et al., 2004), углеводов (Anno et al., 1974; Jong et al., 1998; Lee et al., 1998a; Cavalcante et al., 1999).

В дальневосточных и арктических морях России широко распространена ас-цидия пурпурная Halocynthia aurantium, содержащая в своих тканях каротнноиды в высоких концентрациях. Она обитает преимущественно на глубине от 1 до 65 м, а ее запасы позволяют производить промышленный вылов.

В нашей стране предпринимались попытки обоснования пищевого использования этого вида асцидий (Савватеева, 1990), не получившие дальнейшего развития. Поэтому биотехнологический и биогенный потенциал данного вида сырья не получил объективной оценки.

Имеются работы по использованию туники Н. aurantium, для получения БАД «Хаурантин», обладающей стресс-протекторной активностью (Кушнерова и др., 2000; Добряков, 2004). Однако предлагаемая технология обеспечивает выход каротиноидов, не превышающий 1% от их суммарного количества в исходном сырье.

Таким образом, широкий спектр биологических активностей каротиноидов, содержащихся в морских организмах, свидетельствует о целесообразности их выделения и использования в лечебных и профилактических целях. Обоснование использования асцидии пурпурной в качестве источника каротиноидов позволит не только расширить сырьевую базу биопрепаратов, но и выявить особенности их состава и биологической активности, предложить новые рациональные технологии переработки.

Цель работы - исследование распределения и свойств биологически активных компонентов асцидии пурпурной как перспективного промыслового объекта, разработка эффективных технологий концентратов каротиноидов и определение их биологической активности.

Задачи исследования:

- исследовать технохимический состав тканей и органов асцидии пурпурной как основу для рекомендаций по ее переработке для производства БАД и пищевых продуктов;

- исследовать состав биологически активных компонентов в тканях асцидии для обоснования направлений их применения;

- исследовать качественный и количественный состав каротиноидов в тканях асцидии;

- определить структуру преобладающих каротиноидов, входящих в состав сырья и препаратов;

- определить рациональные параметры процесса экстракции и концентрирования каротиноидов;

- обосновать и разработать технологию масляных экстрактов каротиноидов в качестве БАД к пище;

- провести оценку безопасности и биологической активности БАД к пище, исследовать антиоксидантные и мембранотропные свойства препаратов;

Научная новизна. На основе новых инструментальных методов пересмотрены данные по составу биологически активных соединений в различных органах и тканях асцидии пурпурной Н. aurantium, дана сравнительная характеристика качественного и количественного содержания азотистых соединений (свободных аминокислот, дипептидов, аминосахаров). Впервые проведен анализ компонентного состава каротиноидов тканей и органов асцидии и показано наличие 8 индивидуальных соединений в тунике методом ВЭЖХ. Выявлено значительное преобладание кислородсодержащих форм (ксантофиллов).

Значения молекулярных масс (с точностью до третьего знака), полученные масс-спектрометрией высокого разрешения, и характеры электронных спектров поглощения использованы для идентификации;каротиноидов!и построения структурных формул 5 преобладающих компонентов.

На основе сравнительного анализа способности каротиноидов асцидии к экстракции и реэкстракции в различных системах растворителей впервые разработан способ получения масляных концентратов, показано влияние органических кислот на процесс разрушения каротинопротеиновых комплексов асцидии: Показана зависимость процесса реэкстракции от липидного состава растительных масел и жиров морских организмов.

Разработана и научно обоснована технология БАД к пище «Экстракт асцидии масляный» из туники Н. aurantium. Показателем подлинности сырья и продуктов на его основе может служить количественное содержание каротиноида гало-цинтиаксантина.

Впервые исследовано влияние каротиноидов Н. aurantium на текучесть мембран в модельных экспериментах. Показано, что каротиноиды из туники асцидии обеспечивают увеличение структурной стабильности, уменьшение текучести и повышение термостабильности мембраны в жидкокристаллическом состоянии. Установлены антиоксидантная и иммунотропная активности БАД к пище «Экстракт асцидии масляный».

Практическая значимость состоит в обосновании способов утилизации ранее не используемого вида морских организмов; разработке рекомендаций по комплексной безотходной переработке асцидии пурпурной, включающей создание БАД направленного типа действия; разработке технологии концентрированных масляных экстрактов каротиноидов, разработке нормативной документации на сырец, мороженое сырье и готовый продукт.

Разработана и утверждена нормативная документация на «Асцидию пурпурную — сырец» ТУ 9253-308-00472012-06, «Асцидию пурпурную мороженую» ТУ 9265-311-00472012-06, БАД к пище «Экстракт асцидии масляный» ТУ 9283-31500472012-07.

По результатам экспертной оценки и санитарно-гигиенических исследований в Федеральном центре Госсанэпиднадзора РФ «Экстракт асцидии масляный» соответствует требованиям СанПиН и зарегистрирован как БАД к пище (санитарно-эпидемиологическое заключение № 77.99.13.003.Т.002367 от 31.10.2007).

Реализация результатов исследования. В настоящее время промышленный выпуск БАД к пище «Экстракт асцидии масляный» (субстанция) осуществляется на экспериментальном участке ФГУП «ТИНРО-Центр», конечная форма производится в ООО «Биополимеры». Установлена экономическая эффективность производства БАД.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на «XII Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации» (Таиланд, 2007); на конференции «Современное состояние водных биоресурсов», посвященной 70-летию С.М. Коновалова (Владивосток, 2008); на 9-й Тихоокеанской международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (Владивосток, 2008); на научной конференции «Иммуномодуляторы природного происхождения» (Владивосток, 2009).

Положения, выносимые на защиту:

1. По совокупным признакам (распространению, химическому составу и составу БАВ) асцидия пурпурная Halocynthia aurantium является наиболее перспективным видом асцидий Дальневосточного региона России для использования в пищевой промышленности.

2. Исследование каротиноидов асцидии Н. aurantium методами ВЭЖХ и масс-спектрометрии позволяет выделить и идентифицировать преобладающие компоненты. В качестве показателя подлинности сырья и продуктов на его основе может быть использован галоцинтиаксантин.

3. Технология масляного экстракта асцидии Н. aurantium позволяет получать кислородсодержащие каротиноиды (ксантофиллы) в виде концентрированных препаратов, обладающих широким спектром биологической активности.

Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ, в том числе 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК и один патент на изобретение

112 ВЫВОДЫ

1. Научно обоснованы рекомендации по рациональному использованию органов н тканей асцидии пурпурной, технология БАД к пище на основе каротиноидов, обеспечивающая их концентрирование и сохранение биологической активности.

2. Среди наиболее распространенных видов асцидий, обитающих в российской зоне Японского моря, перспективной для использования в пищевой промышленности является асцидия пурпурная Н. aurantium. Химический состав тканей (мантии, пищеварительной железы, гонад) характеризуется высоким содержанием воды (80-90 %), низким количеством азотистых соединений, включая белки (3,49,6 %) и свободные аминокислоты (0,1-3,3 %), малым содержанием липидов (0,20,6 %). Для внешней оболочки (туники) наиболее характерными соединениями являются каротиноиды и сульфатированные гексозамины.

3. Сравнительный анализ количественного содержания каротиноидов в различных органах асцидии Н. aurantium показал, что концентрация каротиноидов уменьшается в ряду туника —» мантия —> пищеварительная железа —> гонады. В качестве их источника целесообразно использовать тунику (40 мг/100 г) и мантию (17 мг/ 100 г)

4. Каротиноиды Н. aurantium представлены окисленными формами (ксантофиллами), состоящими из 8 основных компонентов, из которых 5 идентифицированы методами ВЭЖХ и масс-спектрометрией высокого разрешения: астаксантин, аллоксантин, р,(3-каротин-2,2'-дион, гидроксиэхиненон, галоцинтиаксантин. В качестве показателя подлинности сырья и продукции на основе асцидий может быть использован галоцинтиаксантин.

5. Обоснован выбор этанола в качестве экстрагента и растительного масла в качестве реэкстрагента для выделения и концентрирования каротиноидов с целью получения БАД к пище. Обоснованы рациональные режимы экстракции и реэкстракции каротиноидов: соотношение сырье-экстрагент 1 : 5, температура 20 °С, продолжительность экстракции 24 ч, соотношение масло-этанол -1:5, температура 38 °С, продолжительность 8 ч.

6. Исследование экстракционной способности растительных масел различного происхождения показало, что наиболее высокий выход позволяет получить использование для реэкстракции подсолнечного и льняного масел. Установлено, что жиры морских животных обладают слабой способностью аккумулировать каротиноиды.

7. Мембраннотропная активность каротиноидов асцидии характеризуется снижением энтальпии фазового перехода ДПФХ с 7,0 Дж/г до 3,4 Дж/г и температуры фазового перехода на 2 °С, что свидетельствует о стабилизации мембран за счет уменьшения их текучести.

8. Каротиноиды Н. aurantium проявляют значительный антиоксидантный эффект, а также обладают выраженным иммуномодулирующим действием, увеличивая бактерицидную п фагоцитарную активность нейтрофилов перитонеальной полости мышей

9. Технохимические решения производства БАД «Экстракт асцидии масляный» использованы при разработке нормативной документации: ТУ 9283-31500472012-07, ТИ № 36-317-07 - и при внедрении препарата в промышленное производство. Новизна технических решений подтверждена патентом РФ № 2339387 «Способ получения биологически активной добавки из асцидии». Препарат внедрен в промышленное производство.

10. Результаты исследований безопасности и медико-биологической активности БАД «Экстракт асцидии масляный» явились научным обоснованием для использования препарата в качестве дополнительного источника каротиноидов (ксантофиллов), что подтверждено санитарно-эпидемиологическим заключением № 77.99.13.003.Т.002367 от 31.10.2007.

114

1. Алешина JI.A., Глазкова С.В., Луговская Л.А., Подойникова М.В., Фо-фонов А.Д., Силина Е.В. Современные представления о строении целлюлоз // Химия растительного сырья. 2001. №1. С.5-36.

2. Анапольский А.С., Быков В.П., Бахолдина Л.П. Способ выделения жирорастворимых каротиноидов из ракообразных или отходов их переработки: Патент СССР № 1 504 832. 1987.

3. Атлас беспозвоночных Дальневосточных морей СССР. М.; Л.: Изд-во АН СССР. 1955. 244 с.

4. Бакулина О.Н., Некрасова Т.Э. Каротиноиды: извлекаем пользу // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. 2009. №1. С. 44-46.

5. Белорукова А.А., Задорожный П.А., Пивненко Т.Н., Якуш Е.В. Оценка содержания каротиноидов у асцидий Halocynthia aurantium и Styela clava И Изв. ТИНРО. 2006. Т. 147. С. 347-353.

6. Бородин Е.А., Арчаков А.И. Стабилизация и реактивация цитохрома Р-450 фосфатидилхолином при перекисном окислении липидов // Биологические мембраны. 1987. № 7. С. 719-728.

7. Бородина А.В., Нехорошее М.В., Солдатов А.А. Каротиноидный состав тканей двустворчатого моллюска Anadara inaequivalvis вселенца в черное море // Экология моря. 2008. Вып. 76. С. 34-39.

8. Бриттон Г. Биохимия природных пигментов. М.: Мир. 1986. 442 с.

9. Воротников Б.Ю., Степанцова Г.Е. Способ получения пищевого красителя из гидробионтов: Патент России № 2 064 476. 1996.

10. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М.: Мир. 1976. 541 с.

11. ГОСТ 26927-86. Сырье и продукты пищевые. Метод определения ртути /I1. Изд-во стандартов. 1986.

12. ГОСТ 26930-86. Сырье и продукты пищевые. Метод определения мышьяка / Изд-во стандартов. 1986.

13. ГОСТ 26932-86. Сырье и продукты пищевые. Методы определения свинца / Изд-во стандартов. 1986.

14. ГОСТ 26933-86. Сырье и продукты пищевые. Методы определения кадмия / Изд-во стандартов. 1986.

15. ГОСТ 30178-96. Сырье и продукты пищевые. Атомно-адсорбционный метод определения токсичных элементов.

16. ГОСТ 30538-97. Продукты пищевые. Методика определения токсичных элементов атомно-эмиссионным методом

17. ГОСТ Р 51301-99. Продукты пищевые и продовольственное сырье. Инвер-сионно-вольтамперометрические методы определения содержания токсичных элементов (кадмия, свинца, меди, цинка).

18. ГОСТ Р 51766-2001. Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения мышьяка / Госстандарт России. М.: 2001. ИПК Изд-во стандартов.

19. ГОСТ Р 51962-2002. Продукты пищевые и продовольственное сырье. Ин-версионно-вольтамперометрический метод определения массовой концентрации мышьяка / Госстандарт России. М.: 2001. ИПК Изд-во стандартов.

20. Государственная Фармакопея СССР. Изд. XI. М.: 1998.

21. Государственная Фармакопея СССР. Изд. XI. Вып. 2. М.: 1998.

22. Добряков Е.Ю. Фармакологические эффекты экстракта из туники асцидии Halocynthia aurantium: Автореф. дисс. канд. мед. наук. Владивосток. 2004. 23 с.

23. Животные и растения залива Петра Великого. Л: Изд-во «Наука». 1976. С. 122-123.

24. Еляков Г.Б., Стоник В.А., Кузнецова Т.А., Михайлов В.В. Некоторые итоги и перспективы исследований в области морской биохимии и биотехнологии //Биоорган, химия. 1992. Т. 18. №10-11. С. 1424-1440.

25. Еляков Г.Б., Стоник В.А. Морская биоорганическая биохимия основа морской биотехнологии // Известия Академии Наук. Серия химическая. 2003. №1. С. 1-18.

26. Завалишин И.А., Захарова М.Н. Оксидантный стресс общий механизм повреждения при заболеваниях нервной системы // Журнал неврологии и психиатрии. 1996. Т. 96. №2. С. 111-114.

27. Задорожный П.А. Влияние среды и состояния организма на содержание каротиноидов у морских ежей: Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Владивосток. 2003. 20 с.

28. Задорожный П.А., Борисовец Е.Э., Якуш Е.В., Давидюк Т.С. Изменение состава каротиноидов у крабов при эмбриогенезе // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2008. Т. 44. №4. С. 381-390.

29. Казарян Р.В., Павленко С.Г., Евглевский А.А., Павлюченко И.И., Кун-делегов А.Г., Завалишин А.В. // International Journal of Immunoreabilitation. 2002. Vol. 4. №l.P. 74.

30. Казимирко B.K., Мальцев В.И. Антиоксидантная система и ее функционирование в организме человека // Медицинская Газета «Здоровье Украины». 2004. №98.

31. Капитонов А.Б., Пименов A.M. Каротиноиды как антиоксидантные модуляторы клеточного метаболизма // Успехи современной биологии. 1996. Т. 116. Вып. 2. С. 179-193.

32. Карнаухов В.Н. Биологические функции каротиноидов. М.: «Наука». 1988.240 с.

33. Кашкаров Д.Н., Станчинский В.В. Курс зоологии позвоночных животных. М.; Л.: АН СССР. 1940. С. 21-31.

34. Кику Д. Микроэлементный состав двустворчатых моллюсков залива Петра, Великого в связи с условиями существования: Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Владивосток. 2008. 23 с.

35. Клебанов Г.И. Антиоксиданты. Антиоксидантная активность. Методы исследования // Журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. Приложение №14. 2001. Т. 11. №4. С. 109-118.

36. Лазаревский А.А. Техно-химический контроль в рыбообрабатывающей промышленности. М.: «Пищепромиздат». 1955. 518 с.

37. Лебедев А.В. Азотистые экстрактивные вещества мышечной ткани беспозвоночных // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1974. Т. 10. С. 232242.

38. Лебедев К.А. Иммунология в клинической практике / К.А. Лебедев, И.Д. Понякина. М.: «Наука» 1990. 223 с.

39. Лебская Т.К., Дубницкая Г.М., Байдалова Г.Ф. Способ обогащения рыбного жира биологически активными веществами из беспозвоночных гидробионтов: Патент России № 2 162 647. 2001.

40. Манушина Т.И., Лебская Т.К. Антиокислительные эффекты БАД из гидробионтов в составе рыбных жиров // Техника и технологии пищевых производств на рубеже 21-го века: мат-лы науч.-практ. конф. Мурманск: МГТУ. 2000. С. 16-26.

41. Микулин А.Е. Причины изменения спектральных свойств каротиноидов в эмбриональном развитии костистых рыб // Сб.: ВНИРО Биологически активные вещества и факторы в аквакультуре. М.: ВНИРО. 1993. С. 163-177.

42. МУ 2142-80. Методические указания по определению хлорорганических, пестицидов в воде, продуктам питания, кормах и табачных изделиях хроматографией в тонком слое / М.: Роспотребнадзор. 1980.

43. МУК 2482-81. Временные методические указания по определению хлорорганических пестицидов (ДДТ, ДДЕ, ДДД, АЛЬФА-ГАММД-ГХЦГ). в рыбе и рыбной продукции методом газожидкостной хроматографии.

44. Мухин В.А., Новиков В.Ю., Шаповалова Л.А., Шевелева О.А. Способ получения комплекса жирорастворимых каротиноидов из гидробионтов и отходов их переработки: Патент России № 2 278 556. 2006.

45. Патент № 2 256 651: Выделение каротиноидных кристаллов. Сибейн М., Вольф Й.Х., Схап А. 2005.

46. Пивненко.Т.Н. Биологически активные добавки к пище из гидробионтов: состав, свойства и направления практического применения // Рыбоводство и рыбное хозяйство. 2006. №2. С. 5-18.

47. Плаксен Н.В., Хильченко Н.С. Коррекция иммунодефицитных состояний с помощью препарата из асцидии пурпурной «Мобилана» // Рациональное использованне лекарств: Материалы Российской научно-практической конференции. Пермь. 2004. С. 307-308.

48. Попков А.А., Касьянов С.П., Овчинников В.В., Акулин В.Н. Технология переработки пищеварительной железы командорского кальмара (Berryteuthis magis-ter)//Изв. ТИНРО. 1997. Т. 120. С. 77-85.

49. Попов A.M., Новиков В.В., Радченко О.С., Еляков Г.Б. Цитотоксическая и противоопухолевая активности имидазольного алкалоида поликарпина из тропической асцидии Polycarpa aurata и его синтетических аналогов // Доклады РАН. 2002. №385. С. 213-218.

50. Растения и животные Японского моря/краткий атлас-определитель. Фонд «Феникс». Project AWARE (UK). ДВГУ. Владивосток. 2006. 488 с.

51. Ребачук Н.М., Максисов О.Б., Богуславская Л.Б., Федореев С.А. Каротиноиды асцидии Halocynthia aurantium II Химия природных соединений. 1985. Т. 20. №4. С. 431-433.

52. Ржавская Ф.М. Жиры рыб и морских млекопитающих: монография. М."' 1976. 470 с.

53. Роит А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ. М.: Мир. 2000.592 с.

54. Рудаков О.Б., Перикова Л.И., Болотов В.М., Сташина Г.А. Хроматогра-фическое определение натуральных и искусственных каротиноидов в пищевых продуктах//Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2004. №1. С. 78-84.

55. Руководство Р 4.1.1672-03. Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище / Минздрав России. М.: 2004.

56. Рыбин В.Г., Павель К.Г., Караулов А.Е. Аспекты применения высокоэффективной жидкостной хроматографии в анализе жирных кислот, каротиноидов и стероидов в липидах и липидных препаратах из гидробионтов // Вопросы рыболовства. 2006. Т. 7. №2. С. 304-317.

57. Савватеева Л.Ю., Маслова М.Г., Володарский В.Л. Дальневосточные голотурии и асцидии как ценное пищевое сырье. Владивосток: Изд-во Дальневост. ун-та. 1983. 184 с.

58. Санина Н.М., Костецкий Э.Я. Влияние холестерина на фазовые переходы фосфатидилхолина, полученного из асцидии Halocynthia aurantium // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1995. Т.31. №1. С. 366-369.

59. СанПиН 2.3.2.1078-01. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы / Минздрав России. М.: 2002.

60. Степаненко Б.Н. Химия и биохимия углеводов (полисахариды). М.: Высшая школа. 1978. 256 с.

61. Стоник В.А., Толстиков Г.А. Природные соединения и создание отечественных лекарственных препаратов // Вестник Российской Академии Наук. 2008. Т. 78. №8. С. 675-687.

62. Суховеева М.В., Подкорытова А.В. Промысловые водоросли и травы морей Дальнего Востока: биология, распространение, запасы, технология переработки. Владивосток: ТИНРО-центр. 2006. 243 с.

63. Торкунов П.А., Сапронов Н.С. Кардиопротекторное действие таурина /У Экспериментальная и клиническая фармакология. 1997. Т. 60. №5. С. 72-77.

64. Тутельян В.А., Суханов Б.П., Австриевских А.Н., Поздняковский В.М. Биологически активные добавки в питании человека. Томск. Изд-во научн.-техн. лит-ры. 1999. 296 с.

65. Усов А.И., Сланчев К.И., Смиронова Г.П., Иванова А.П., Стефанов K.JL, Попов С.С., Андреев С.Н. Полярные компоненты асцидии Botiyllus schlosseri II Биоорганическая химия. 2002. Т. 28. №2. С. 168-172.

66. Фармакопейная статья № 42-1286-99 «Хонсурид».

67. Хаитов Р. М. Экологическая иммунология / Р. М. Хаитов, Б. В. Пинегин, X. И. Истамов. М. 1995. 219 с.

68. Чумак А.Д., Миленина Н.И., Слуцкая Т.Н. и др. Влияние различных добавок на окисление липидов и качество соленых лососевых // Известия ТИНРО. 1992. Т.114. С. 167-174.

69. Энгельгардт X. Жидкостная хроматография при высоких давлениях (пер. с англ.). М.: Мир. 1980. 245 с.

70. Agrawal M., Bowden В., McCool В., Willis R. Alkaloids and peptides from Australian sponges and Ascidians // International symposium on marine drugs. 2004.

71. Anno K., Otsuka K., Nobuko S. A chitin sulfite-like polysaccharide from the test of the tunicate Halocynthia roretzi II Biochem. Biophys. Acta. 1974. V. 362. P. 215-219.

72. Asai A., Sugawara Т., Ono H., Nagao A. Biotransformation of fucoxanthinol into amarouciaxanthin A in mice and HepG2 cells: formation and cytotoxicity of fucoxanthin metabolites // Drug. Metab. Dispos. 2004. Vol. 32. №2. P. 205-211.

73. Bendich A., Olson J. Biological actions of carotenoids // FASEB J. 1989. Vol. 3. I. 8. P. 1927-1932.

74. Bertram J.S., Bortkiewicz H. Dietary carotenoids inhibit neoplastic transformation and modulate gene expression in mouse and human cells // Am. J. Clin. Nutr. 1995. Vol. 62. Suppl. 6. P. 1327-1336.

75. Bertram J.S. Caroteniods and gene regulation //Nutr. Rev. 1999. Vol. 57.1. 6. P. 182-191.

76. Bertram J.S., Vine A.L. Cancer prevention by retinoids and carotenoids: independent action on a common target // Biochem. Biophys. Acta. 2005. Vol. 1740. I. 2. P. 170-178.

77. Bianclii L., Tateo F., Pizzala R. Carotenoids reduce the chromosomal damage induced by bleomycin in human cultured lymphocytes // Anticancer Res. 1993. Vol. 7. P. 1007-1010.

78. Burkhard S., Bohm V. Development of a new method for the complete extraction of carotenoids from cereals with special reference to durum wheat (Triticum durum Desf.) // J. Agric. Food Chem. 2007. Vol. 55.1. 21. P. 8295-8301.

79. Burton G.W., Ingold K.U. p-carotene: an unusual type of lipid antioxidant // Science. 1984. Vol. 224. P. 569-573.

80. Cantrell A., McGarvey D.J., Truscott T.G., Rancan F., Bohm F. Singlet oxygen quenching by dietary carotenoids in a model membrane environment // Arch. Biochem. Biophys. 2003. Vol. 412. №1. p. 47-54.

81. Cantrell A., Truscott T.G. Carotenoids and radicals; interactions with other nutrients / In Carotenoids in health and disease. Krinsky N. Mayne S., Sies H. 2004. P. 3151.

82. Carotenoids / G.Britton, S.Liaaen-Jensen, H.Pfander (Eds). Basel: Birkhauser, 1995. Vol. 1A. 328 p.

83. Carotenoids / G.Britton, S.Liaaen-Jensen, H.Pfander (Eds). Basel: Birkhauser, 1995. Vol. 1 B. 360 p.

84. Carotenoids in health and disease / N. Krinsky, S. Mayne, H. Sise. 2004. p. 425.

85. Carreau J.P., Dubacq J.P. Adaptation of macro-scale method to the micro-scale for fatty acid methyl transesterification of biological lipid extract // J. Chromatogr. 1978. Vol. 151. №3. P. 384-390.

86. Cavalcante M., Mourao P., Pavao M. Isolation and characterization of a highly sulfated heparan sulfate from ascidian test cell // Biochim. Biophys. Acta. 1999. Vol. 1428. P. 77-87.

87. Chen H.M., Meyer S.P. Extraction of astaxanthine pigment from crayfish waste using soy oil process // J. Food Sci. 1982. Vol. 47. №3. P. 892-896.

88. Chew B.P., Park J.S., Wong M.W., Wong T.S. A comparison of the anticancer activities of dietary beta-carotene, canthaxanthin and astaxanthin in mice in vivo II Anticancer Res. 1999. Vol. 19.1. ЗА. P. 1849-1853.

89. Chew B.P., Park J.S. Carotenoid action on the immune response // J. Nutr. 2004. Vol. 134. №1. P. 257-261.

90. Choi B.D., Kang S.J., Choi Y.J., Youm M.G., Lee K.H. Utilization of ascidian (Halocynthia roretzi) tunic. 3. Carotenoid composition of ascidian tunic // J. Korean Fish. Soc. 1994a. Vol. 27. №4. P. 344-350.

91. Choi B.D., Kang S.J., Clioi Y.J., Youm M.G., Lee K.H. Utilization of ascidian (Halocynthia roretzi) tunic. 4. The stability of ascidian tunic extracts // J. Korean Fish. Soc. 1994b. Vol. 27. №4. P. 351-356.

92. Choi S.K., Kim J.H., Park Y.S., Kim Y.J., Chang H.I. An efficient method for the extraction of astaxanthin from the red yeast Xanthophyllomyces dendrorhous II J. Microbiol. Biotechnol. 2007. Vol. 17.1. 5. P. 847-852.

93. Christie W.W. Equivalent chain-lengths of methyl ester derivatives of fatty acids on gas-chromatography a reappraisal // J. Chromatogr. A. 1988. Vol. 447. №2. P. 305314.

94. Dennison S.R., Kim Y.S., Cha H.J., Phoenix D.A. Investigations into the ability of the peptide, HAL 18, to interact with bacterial membranes // Eur. Biophys. J. 2008. Vol. 38.1. LP. 37-43.

95. Edge R., McGarvey D.J., Truscott T.G. The carotenoids as anti-oxidants a review // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 1997. Vol. 41. P. 189-200.

96. Fernandes-Carlos Т., Riondel J., Glise D., Guiraud P., Favier A. Modulation of natural killer cell functional activity in athymic mice by beta-carotene, oestrone and their association // Anticancer Res. 1997. Vol. 17. P. 2523-2527.

97. Folch J., Lees M., Sloane Stanley G.H. Method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem. 1957. Vol. 226. №1. P. 497-509.

98. Friend J. The coupled oxidation of P-carotene by linoleatelipoxidase system and by autoxidizing linoleate// Chem. Ind. (London). 1958. P. 597-598.

99. George P.J., Damodaran R. The intracellular fluid isosmotic regulation in yellow clam Sunetta scripta L. (Mollusca: Bivalvia) acclimated to different salinities // Indian. J. Mar. Sci. 1999. V. 28. №1. P. 83-86.

100. Gies J. Packaging, storage and delivery of ingredients // Food Technol. 1993. Vol. 47.1. 8. P. 54-63.

101. Gimeno M., Ramirez-Hernandez J.Y., Martinez-Ibarra C., Pacheco N., et al.

102. One-solvent extraction of astaxanthin from lactic acid fermented shrimp wastes // J. Ag-ric. Food Chem. 2007. Vol. 55.1. 25. P. 10345-10350.

103. Gruszecki W.I. Carotenoid orientation: role in membrane stabilization / In Carotenoids in health and disease. Krinsky N., Mayne S., Sies H. 2004. P. 151-163.

104. Guerin M., Huntley M.E., Olaizola M. Haematococcus astaxanthin: applications for human health and nutrition // Trends Biotechnol. 2003. Vol. 21.1. 5. P. 210-216.

105. Harris V. Sessile animals of the sea shore. 1990. p. 379.

106. Havaux M. Carotenoids as membrane stabilizers in chloroplasts // Tends in Plant. Sci. 1998. Vol. 3. №4. P. 147-151.

107. Hashimoto Т., Ozaki Y., Taminato M., Das S.K., Mizuno M., Yoshimura K., Maoka Т., Kanazawa K. The distribution and accumulation of fucoxanthin and its metabolites after oral administration in mice // Br. J. Nutr. 2009. P. 1-7.

108. Hennekens C.H., Buring J.E., Manson J.E., Stampfer M., Rosner B. Lack of effect of long-term supplementation with beta carotene on the incidence of malignant neoplasms and cardiovascular disease //N. Engl. J. Med. 1996. Vol. 334 .1. 18. P. 11451149.

109. Hix L.M., Lockwood S.F., Bertram J.S. Bioactive caratenoids: potent antioxidants and regulators of gene expression//Redox. Report. 2004. Vol. 9. №4. P. 181-191.

110. Huang Т. H., Lee C. W., Das Gupta S. K., et. al. A 13C and 2H nuclear magnetic resonance study of phosphatidylcholine/cholesterol interactions: characterization of liquid-gel phases //Biochemistry. 1993. Vol. 32. P. 13277-13287.

111. Jang W.S., Kim K.N., Lee Y.S., Nam M.H., Lee H. Halocidin: a new antimicrobial peptide from hemocytes of the solitary tunicate, Halocynthia aurantium // FEBS Lett. 2002. Vol. 521. P. 81-86.

112. Jang W.S., Kim H.K., Lee K.Y., Kim S.A., Han Y.S., Lee I.H. Antifungal activity of synthetic peptide derived from halocidin, antimicrobial peptide from the tunicate, Halocynthia aurantium И FEBS Lett. 2006. Vol. 580. P. 1490-1496.

113. Jong B.C., Ruck J.H., Jung W.J. Functional properties of sulfated polysaccharides in ascidian (Halocynthia roretzi) tunic // J. Korean Fish. Soc. 1998. Vol. 31. №3. P. 447-451.

114. Jyonouchi H., Zhang L., Gross M., Tomita Y. Immunomodulating actions of carotenoids: enhancement of in vivo and in vitro antibody production to T-dependent antigens //Nutr. Cancer. 1994. Vol. 21.1. 1. P.47-58.

115. Jyonouchi H., Sun S., Iijima K., Gross M.D. Antitumor activity of astaxanthin and its mode of action //Nutr. Cancer. 2000. Vol. 36. №1. P. 59-65.

116. Kang C.D., Sim S.J. Selective extraction of free astaxanthin from Hematococcus culture using a tandem organic solvent system // Biotechnol. Prog. 2007. Vol. 23.1. 4. P. 866-871.

117. Karppi J., Rissanen Т.Н., Nyyssonen K., Kaikkonen J., Olsson A.G., Voutilainen S., Salonen J.T. Effects of astaxanthin supplementation on lipid peroxidation // Int. J. Vitam. Nutr. Res. 2007. Vol. 77. №1. P. 3-11.

118. Kim N.H., Kang J.H. Protective effects of histidine dipeptides on the modification of neurofilament-L by the cytochrome c/hydrogen peroxide system // J. Biochem. Mol. Biol. 2007. Vol. 40.1. 1. P. 125-129.

119. Kotake-Nara E., Kushiro M., Zhang H., Sugawara Т., Miyashita K., Nagao A. Carotenoids affect proliferation of human prostate cancer cells // J. Nutr. 2001. Vol. 131. P. 3303-3306.

120. Kotake-Nara E., Asai A., Nagao A. Neoxanthin and fucoxanthin induce apop-tosis in PC-3 human prostate cancer cells // Cancer Lett. 2005. V. 220.1. 1. P. 75-84.

121. Krinsky N.I. Antioxidant functions of carotenoids // Free Radic. Biol. Med. 1989. Vol. 7. P. 617-635.

122. Kurashige M., Okimasu E., Inoue M., Utsumi K. Inhibition of oxidative injury of biological membranes by astaxanthin // Physiol. Chem. Phys. Med. NMR. 1990. Vol. 22.1. l.P. 27-38.

123. Maeda H., Tsukui Т., Sashima Т., Hosokawa M., Miyashita K. Seaweed carotenoid, fiicoxanthin, as a multi-functional nutrient // Asia Рас J Clin Nutr. 2008. Vol. 1. P. 196-199.

124. Martin K.R., Wu D., Meydani M. The effect of carotenoids on the expression of cell surface adhesion molecules and binding of monocytes to human aortic endothelial cells // Atherosclerosis. 2000. Vol. 150.1. 2. P. 265-274.

125. Matsuno Т., Ookubo M. A new carotenoid, halocynthiaxanthin from the sea squirt, Halocynthia roretzi II Tetrahedron Letters. 1981. Vol. 22. №46. P. 4659-4660.

126. Matsuno Т., Ookubo M., Komori T. Carotenoids of tunicates, III. The structural elucidation of two new marine carotenoids, amarouciaxanthin A and В // Journal of natural products. 1985. Vol. 48. №4. P. 606-613.

127. McNulty H., Jacob R.F., Mason R.P. Biological activity of carotenoids related to distinct membrane physicochemical interactions // Am. J. Cardiol. 2008. Vol. 101. I. 10A. P. 20-29.

128. Mild W. Biological functions and activities of animal carotenoids // Pure Appl. Chem. 1991. Vol. 63.1. 1. P. 141-146.

129. Miyashita К. Function of marine carotenoids // Forum Nutr. 2009 Vol. 61. P. 136-146.

130. Mizuta S., Isobe S., Yoshinaka R. Existence of two molecular species of collagen in the muscle layer of the ascidian (Halocynthia roretzi) // Food Chemistry. 2002. Vol. 79.1. l.P. 9-14.

131. Mortensen A., Skibsted L.H., Truscott T.G. The interaction of dietary carotenoids with radical species // Arch. Biochem. Biophys. 2001. Vol. 385. P. 13-19.

132. Muriana F.J., Ruiz-Gutierrez V., Gallardo-Guerrero M.L., Minguez-Mosquera M.I. A study of the lipids and carotenoprotein in the prawn, Penaens japoni-cus II J. Biochem. 1993. Vol. 114.1. 2. P. 223-229.

133. Naguib Y.M. Antioxidant activities of astaxanthin and related carotenoids // J. Agric. Food Chem. 2000. Vol. 48. №4. P. 1150-1154.

134. Nette G., Scippa S., Candia A., Vincentiis M. Cytochemical localisation of vanadium (III) in the blood cells of the ascidian Phallusia fumigate II Сотр. Biochem. Physiol. С Toxicol. Pharmacol. 2004. Vol. 137.1. 3. P. 271-279.

135. Ni H., Chen Q., He G. et al. Optimization of acidic extraction of astaxanthin from Phaffia rhodozyma I I J. Zhejiang Univ. Sci. B. 2008. Vol. 9.1. 1. P. 51-59.

136. Nishino H., Tsushima M., Matsuno Т., Tanaka Y., Okuzumi J., et al. Antineoplastic effect of halocynthiaxanthin, a metabolite of fucoxanthin // Anticancer Drugs. 1992. V. 3.P. 493-497.

137. Nishino H. Cancer prevention by Carotenoids // Mutat. Res. 1998. Vol. 402. № 12. P. 159-163.

138. Nishino H, Tokuda H, Murakoshi M, Satomi Y, Masuda M, Onozuka M, etal. Cancer prevention by natural carotenoids // Biofactors. 2000. Vol. 13.1. 1-4. P. 89-94.

139. Nontratip A., Yamanaka H. Seasonal variations of glycogen-degrading enzymes in ascidian muscle //Fisheries Science. 1994. Vol. 60. №1. P. 77-81.

140. Ohgami K., ShiratoriJK., Kotake S., Nishida Т., Mizuki N., Yazawa K., Olino S. Effects of astaxanthin on lipopolysaccharide-induced inflammation in vitro and in vivo /I Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2003. Vol. 44.1. 6. P. 2694-2701.

141. Okai Y., Higashi-Okai K. Possible immunomodulating activities of carotenoids in in vitro cell culture experiments // Int. J. Immunopharmacol. 1996. Vol. 18. №12. P. 753-758.

142. Ookubo M., Matsuno Т. Carotenoids of Sea Squirts II. Comparative Biochemical studies of carotenoids in Sea Squirts // Сотр. Biochem. Physiol. 1985. Vol. 81B, №1. P. 137-141.

143. Palozza P. Prooxidant actions of carotenoids in biological systems // Nutr. Rev. 1998. Vol. 56. P. 257-265.

144. Palozza P. Evidence for pro-oxidant effects of carotenoids in vitro and in vivo: implication in health and disease / In Carotenoids in health and disease. Krinsky N., Mayne S., Sies H. 2004. P. 127-149.

145. Park C., Matsui Т., Watanabe K., Yamaguchi K., Konosu S. Regional variation of extractive nitrogenous constituents in the ascidian Halocynthia roretzi muscle // Nippon Suisan Gakkaishi Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1991. Vol. 57. №4. P. 731-735.

146. Partali V., Tangen K., Liaaen-Jensen S. Carotenoids in food chain-studies. 3. Resorption carotenoids in Mytilus ednlis (edible mussel) // Сотр. Biochem. Physiol. 1989. Vol. 92B. №2. P. 239-246.

147. Pavao M.S. Unique sulfated polysaccharides from ascidians (Chordata, Tunicata) // Braz. J. Med. Biol. Res. 1996. Vol. 29.1. 9. P. 1227-1233.

148. Polyakov N.E., Kruppa A.I., Leshina T.V., Konovalova T.A., Kispert L.D. Carotenoids as antioxidants: spin trapping EPR and optical study // Free Radic. Biol. Med. 2001a. Vol. 31. P. 43-52.

149. Polyakov N.E., Leshina T.V., Konovalova T.A., Kispert L.D. Carotenoids as scavengers of free radicals in a Fenton reaction: antioxidants or pro-oxidants? // Free Radic. Biol. Med. 2001b. Vol. 31. P. 398-404.

150. Preston R.L. Transport of amino asids by marine invertebrates // J. Exp. Biol. 1993. V. 256. №4. P. 410-421.

151. Rich S.J. Encapsulation: overview of uses and techniques. Washington, D.C.: American Chemical Society S.S. 590.

152. Rock C.L. Relationship of carotenoids to cancer / In Carotenoids in health and disease. Krinsky N., Mayne S., Sies H. 2004. P. 373-407.

153. Rodriguez-Huezo M.E., Pedroza-Islas R., Prado-Barragan L.A., Beristain C.I., Vernon-Carter E.J. Microencapsulation by spray drying of multiple emulsions containing carotenoids // J. Food Sci. 2004. Vol. 69. №7. P. 351-359.

154. Sachindra N.M., Sato E., Maeda H., Hosokawa M., Nivvano Y., Kohno M., Miyashita K. Radical scavenging and singlet oxygen quenching activity of marine carotenoid fucoxanthin and its metabolites // J. Agric. Food. Chem. 2007. Vol. 55. №21. P. 8516-8522.

155. Sanina N.M., Kostetsky E.Y. Seasonal changes in thermotropic behavior of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine in different organs of the ascidian Halocynthia aurantium II Сотр. Biochem. Physiol. B. 2001. Vol. 128. P. 295-305.

156. Sanina N.M., Kostetsky E.Y. Thermotropic behavior of major phospholipids from marine invertebrates: changes with warm-acclimation and seasonal acclimatization // Сотр. Biochem. Physiol. B. 2002. Vol. 133. P. 143-153.

157. Santocono M., Zurria M., Berrettini M., Fedeli D., Falcioni G. Influence of astaxanthin, zeaxanthin and Lutein on DNA damage and repair in UVA-irradiated cells // J. Photochem. Photobiol. B. 2006. Vol. 85.1. 3. P. 205-215.

158. Sarada R., Vidhyavathi R., Usha D., Ravishankar G.A. An efficient method for extraction of astaxanthin from green alga Haematococcus pluvialis II J. Agric. Food. Chem. 2006. Vol. 54.1. 20. P. 7585-7588.

159. Schiedt K., Liaaen-Jensen S. Isolation and analysis / In Carotenoids. Vol. 1A: Isolation and Analysis. Britton G., Liaaen-Jensen S., Pfander H. (Eds). 1995.- Basel: Birkhauser. P. 81-108.

160. Schoffeniels E., Gilles R. Ionoregulation and osmoregulation in Mollusca // Chemical. Zoology. 1972.Vol. 7. P. 393-420.

161. Shahindra N.M., Mahendrakar N.S. Process optimization for extraction of carotenoids from shrimp waste with vegetable oils // Bioresour. Technol. 2005. Vol. 96.1. 10. P. 1195-1200.

162. Sharoni Y., Danilenko M., Levy J., Stahl W. Anticancer activity of carotenoids: from human studies to cellular processes and gene regulation / In Carotenoids in health and disease. Krinsky N., Mayne S., Sies H. 2004. P. 165-196.

163. Shen H., Kuo C.C., Chou J., Delvolve A., Jackson S.N. Astaxanthin reduces ischemic brain injury in adult rats // FASEB J. 2009. Vol. 23.1. 6. P. 1958-1968.

164. Shimidzu N. Carotenoids as singlet oxygen quenchers in marine organisms // Fish. Sci. 1996. Vol. 62. P. 134-137.

165. Siems W.G., Sommerburg O., van Kuijk F.J. Lycopene and beta-carotene decompose more rapidly than lutein and zeaxanthin upon exposure to various pro-oxidants in vitro // Biofactors. 1999. Vol 10. №2-3. P. 105-113.

166. Socaciu C., Jessel R., Diehl H.A. Competitive carotenoid and cholesterol incorporation into liposomes: effects on membrane phase transition, fluidity, polarity and ani-sotropy // Chem. Phys. Lipids. 2000. Vol.106.1.l.P. 79-88.

167. Sosa M.A., Fazely F., Koch J.A., Vercellotti S.V., Rupreclit R.M. N-carboxymethylchitosan-N,0-sulfate as an anti-HIV-1 agent // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. Vol. 174.1. 2. P. 489-496.

168. Stahl W., Sies H. Antioxidant activity of carotenoids // Mol. Aspects Med. 2003. Vol. 24.1. 6. P. 345-351.

169. Stahl W., Sies H. Bioactivity and protective effects of natural carotenoids // Bio-chim. Biophys. Acta. 2005. Vol. 1740.1. 2. P. 101-107.

170. Sujak A., Gruszecki W.I. Organization of mixed monomolecular layers formed with the xanthophyll pigments or zeaxanthin and dipalmitoylphosphatidylcholine at the argon-water interface // J. Photochem. Photobiol. B. 2000. Vol. 59. № 1-3. P. 42-47.

171. Timme E., Walwyn D., Bailey A. Characterisation of carotenoprotein found in carapace shells of Jasus lalandii // Сотр. Biochem. Physiol. В Biochem. Mol. Biol. 2009.

172. Trivedi S., Ueki Т., Yamaguchi N., Michibata H. Novel vanadium-binding proteins (vanabins) identified in cDNA libraries and the genome of the ascidian Ciona intes-tinalis // Biochim. Biophys. Acta. 2003. Vol. 1630. P. 64-70.

173. Ueki Т., Adachi Т., Kawano S., Aoshima M., Yamaguchi N., Kanamori K., Michibata H. Vanadium-binding proteins (vanabins) from a vanadium-rich ascidian As-cidia sydneiensis samea II Biochim. Biophys. Acta. 2003. Vol. 1626. P. 43-50.

174. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.Y., Vasendin I.M. A universal reagent for phospholipid analysis//J. Chromatogr. 1975. Vol. 114. №1. p. 129-141.

175. Vysotskii M.V., Ota Т., Takagi T. n-3 Polyunsaturated fatty acids in lipids of ascidian Halocynthia roretzi II Nippon Suisan Gakkaishi Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1992. Vol. 58. №5. P. 953-958.

176. Woodall A.A., Lee S.W., Weesie R.J., Jackson M.J., Britton G. Oxidation of carotenoids by free radicals: relationship between structure and reactivity // Biochim. Biophys. Acta. 1997a. Vol. 1336.1.l.P. 33-42.

177. Wojcik M., Bobowiec R., Martelli F. Effect of carotenoids on in vitro proliferation and differentiation of oval cells during neoplastic and non-neoplastic liver injuries in rats // J. Physiol. Pharmacol. 2008. Vol. 2. P. 203-213.

178. Wolf G. Retinoids and carotenoids as inhibitors of carcinogenesis and inducer of cell-cell communication //Nutr. Rev. 1992. Vol. 50.1. 9. P. 270-274.

179. Wolf A.M., Asoh S., Hiranuma H., Ohsawa I., Iio K., Satou A., Ishikura M., Ohta S. Astaxanthin protects mitochondrial redox state and functional integrity against oxidative stress // J. Nutr. Biochem. 2009.

180. Wright S.H. Multiple pathways for amino acid transport in Mytilus gill // J. Сотр. Physiol. 1985. V. 156 B. №2. P. 259-267.

181. Young AJ, Lowe GM. Antioxidant and prooxidant properties of carotenoids // Arch. Biochem. Biophys. 2001. Vol. 385.1. 1. P. 20-27.

182. Young A., Phillip D., Lowe G. Carotenoid antioxidant activity / In Carotenoids in health and disease. Krinsky N., Mayne S„ Sies H. 2004. P. 105-126.

183. Zachariassen K.E., Olsen A. The transmembrane distribution of free amino acids in the adductor muscle of blue mussels (Mytilus edulis) exposed to organic pollutants: A study on regulatory mechanisms // Rep. Bectos. Prog. 1993. P. 49-56.

184. Zagalsky P.F. Invertebrate carotenoproteins // Methods in enzymology. 1985. Vol. 111. P. 216-247.

185. Zagalsky P.F., Eliopoulos E.E., Findlay J.B.C. The architecture of invertebrate carotenoproteins // Сотр. Biochem Physiol. 1990. Vol. 97B. №1. P. 1-18.www. interne vod. comwww.provisor.com.ua/archive/1999/N6/karot.htm