автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.04, диссертация на тему:Разработка технологии бактериального концентрата на основе симбиоза бифидобактерий и сливочного стрептококка

КУЗНЕЦОВА АННА БОРИСОВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БАКТЕРИАЛЬНОГО КОНЦЕНТРАТА НА ОСНОВЕ СИМБИОЗА БИФИДОБАКТЕРИЙ И СЛИВОЧНОГО СТРЕПТОКОККА

Специальность: 05.18.04- Технология мясных, молочных, рыбных продуктов и холодильных производств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

003068240

КУЗНЕЦОВА АННА БОРИСОВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ БАКТЕРИАЛЬНОГО КОНЦЕНТРАТА НА ОСНОВЕ СИМБИОЗА БИФИДОБАКТЕРИЙ И СЛИВОЧНОГО СТРЕПТОКОККА

Специальность: 05.18.04- Технология мясных, молочных, рыбных продуктов и холодильных производств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный технологический университет» (ВСГТУ)

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор

Хамагаева Ирина Сергеевна

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Битуева Эльвира Борисовна

кандидат технических наук, доцент Занданова Туяна Нимбуевна

Ведущая организация : ФГОУ ВПО « Бурятская государственная

сельскохозяйственная академия» им. В.Р. Филиппова

Защита диссертации состоится «04» мая 2007г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 212.039.01 при ГОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный технологический университет» по адресу: 670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40в.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВСГТУ и на сайте www.esstu.ru.

Автореферат разослан « 4 » апреля 2007г.

Ученый секретарь диссертационного совета -' " Столярова А.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Механизм лечебно-профилактического действия пробиотиков является многогранным и обусловлен не только высоким содержанием жизнеспособных клеток, но и синтезом внеклеточных метаболитов, которые усиливают пробиотический эффект. Экзометаболиты пробиотических микроорганизмов подавляют рост патогенной микрофлоры, обладают радиопротекторными, противоопухолевыми и иммунокоррегирующими свойствами. Это свидетельствует о перспективности изучения прокариот, как источников биологически активных субстанций экзополисахаридов, антимикробных и антимутагенных веществ, для создания пробиотических продуктов нового поколения.

Потенциальная возможность к накоплению биологически активных веществ пробиотическими микроорганизмами различна и зависит от видовой и штаммовой принадлежности и проявляется в определенных условиях культивирования.

Известно, что бифидобактерии синтезируют экзополисахариды, обладающие низкой структурообразующей способностью, что затрудняет получение кисломолочных продуктов с высокой вязкостью. В связи с этим является актуальным создание бактериального концентрата на основе сочетания бифидобак-терий и сливочного стрептококка вязкой расы с высоким экзополисахаридным потенциалом, что позволит улучшить органолептические и реологические свойства продукта, а также расширить спектр профилактического действия.

Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы является разработка технологии комбинированного бактериального концентрата на основе сочетания бифидобактерий и сливочного стрептококка вязкой расы, обладающего высокими пробиотическими и структурно-механическими свойствами.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследований:

- подобрать оптимальное соотношение заквасочных культур различных таксономических групп в комбинированной закваске;

- изучить биосинтез внеклеточных метаболитов при культивировании микроорганизмов;

- разработать схему приготовления комбинированной закваски;

- подобрать условия культивирования комбинированной закваски для получения бактериального концентрата;

- разработать технологию жидкого бактериального концентрата;

- исследовать защитные функции экзополисахаридов и антимутагенных веществ, синтезируемых пробиотическими микроорганизмами;

- разработать технологию замороженного и сухого бактериального концентрата;

- обосновать практические аспекты использования бактериального концентрата;

- провести опытно-промышленную проверку разработанных технологий.

Научная новизна. В результате пиоведенных исследований установлено, что при совместном культивировании бифидобактерий и сливочного стрептококка повышается синтез внеклеточных метаболитов, экзополисахаридов, антимутагенных и антимикробных веществ. Доказана возможность направленного биосинтеза экзополисахаридов с помощью различного соотношения заквасочных культур в комбинированной закваске. Выявлено, что при наращивании биомассы экзополисахариды образуются в первые часы культивирования, синтез антимутагенных веществ начинается через 6 часов и максимальное количество экзоме-таболитов накапливается в стационарной фазе роста. Обнаружено, что наиболее устойчивыми к низким значениям рН, замораживанию и высушиванию оказались клетки стационарной фазы роста. Теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены защитные функции синтезируемых экзополисахаридов, которые предохраняют клетки пробиотических микроорганизмов от неблагоприятных факторов среды.

Практическая ценность работы. На основании результатов исследований разработана технология жидкого, замороженного и сухого концентратов для клиники и производства кисломолочных продуктов. На производство жидкого и замороженного концентрата разработаны ТУ (9229-015-0269473-2007). Проведена опытно-промышленная проверка технологии препаратов в научно-исследовательской лаборатории заквасок ВСГТУ.

Апробация результатов работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на научных конференциях ВСГТУ (г. Улан-Удэ, 2003-2006); второй Всероссийской научно-технической конференции-выставке с международным участием «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» при МГУПП (г. Москва, 2004); второй Международной научно-технической конференции, посвященной 100-летию заслуженного деятеля науки и техники РСФСР, профессора В.И. Попова «Прогрессивные технологии и оборудование в пищевой промышленности» (г. Воронеж, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Достижения науки и практики в деятельности образовательных учреждений» (г. Кемерово, 2003); девятой научно-технической конференции «Интеллект — здоровое общество» при ЗИПСибУПК (г. Чита, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора, методической части, результатов эксперимента и их анализа, выводов, списка литературы и приложений. Основная часть работы изложена на 135 страницах, включает 20 таблиц и 17 рисунков.

МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Экспериментальная часть исследований проводилась в лаборатории кафедры «Технология молочных продуктов. Товароведение и экспертиза товаров» и проблемной лаборатории Восточно-Сибирского государственного технологического университета.

Объектами исследований служили культуры бифидобактерий (штамм В1ШоЬас1егшт 1о1^ит В379М) и молочнокислый стрептококк (штамм Ьа^ососсш 1асйз эиЬзр. сгетош) вязкий (сливочный стрептококк). В качестве основного сырья использовали стерилизованное обезжиренное молоко. Для получения биомассы использовали питательную среду на основе осветленной творожной сыворотки, оптимизированную добавлением ростовых компонентов, для активного роста микроорганизмов.

При проведении экспериментальных исследований использовали общепринятые и современные методы анализа.

Схема проведения эксперимента представлена на рисунке 1.

Определяли показатели: активную кислотность - потенциометрическим методом по ГОСТ 3624-87; титруемую кислотность - титриметрическим методом по ГОСТ 3624-92; оптическую плотность - фотоколориметрическим методом на КР -77 при X = 550нм; количественный учет жизнеспособных клеток бифидобактерий проводили методом предельных разведений на среде ГМК; идентификацию культур при совместном культивировании - методом угнетения Ьа^ососсиэ 1асиз БиЬБр. сгетош с помощью антибиотика тетрациклина по разработанной нами методике; количественный учет микроорганизмов — методом предельных разведений по ТУ 10-10-02-789-182-95; морфологию клеток бактерий — путем приготовления препаратов, окрашенных метиленовым синим или по Граму с последующим микрокопированием в иммерсионной системе; содержание молочной кислоты - кблориметрическим ферментным методом; антимутагенную активность - по тесту Эймса; антимикробную активность оценивали по величине зон угнетения роста тест- культуры вокруг цилиндрика; концентрацию экзополисахаридов - антроновым методом; количество бактерий групп кишечных палочек - по ГОСТ 9225-84; контаминацию - по ГОСТ 922584.

Полученные экспериментальные данные статистически обрабатывали методами математического и корреляционного анализа на ЭВМ, используя пакет стандартных программ.

Создание комбинированной закваски на основе бифидобактерий и сливочного стрептококка 1-3,5-7,10,12

Исследование внеклеточных метаболитов, синтезируемых пробиотическими микроорганизмами _8,9,10,11_

Подбор условий культивирования для получения биомассы комбинированной закваски 2-6, 8,11,12-15

Исследование защитных свойств экзополисахаридов 2,5,6,9,12

Разработка технологии БАД и концентратов 1,2,5,6,12-15

Практические аспекты применения концентрированной закваски 1,5,6,10-15

Опытно-промышленная проверка технологии и оценка качества концентрата 1,3,5,6,10,12-15

Показатели 1 .Органолептические показатели

2. Активная кислотность

3. Титруемая кислотность

4. Оптическая плотность

5. Количество клеток бифидобактерий

6. Количество клеток сливочного стрептококка

7. Содержание молочной кислоты

8. Антимутагенная активность

9. Антибиотическая активность

10. Структурно- механические свойства

11. Концентрация ЭПС

12. Микроскопический препарат

13. Определение БГПК

14. Контаминация

15.Показатели безопасности

Рисунок 1 - Схема проведения эксперимента

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Создание комбинированной закваски на основе бифидобактерий и сливочного стрептококка

В последние годы повысился интерес к вязким закваскам, вырабатывающим экзополисахариды, способные повышать вязкость и влагоудерживаю-щую способность сгустка. Данные закваски в процессе ферментации образуют естественные загустители, которые могут заменить стабилизаторы растительного и животного происхождения. Теоретическим обоснованием для включения в состав комбинированной закваски сливочного стрептококка послужили следующие факторы, высокая структурообразующая способность, умеренная кислотность и продуцирование L-формы молочной кислоты.

Следует отметить, что роль лактококков как пробиотиков в настоящее время изучена недостаточно подробно. В то же время известны успешные попытки применения при имуннодефицитах препаратов из пробиотиков - представителей Lactococcus и Streptococcus. Сочетание бифидобактерий и лактококков позволит создать комплексный препарат, содержащий бактерии разных таксономических групп, которые будут дополнять по своим эффектам друг друга и оказывать наиболее корригирующее действие на организм человека.

Оптимальное соотношение культур в комбинированной закваске выбирали с учетом сбалансированного роста B.longum В379М и Lactococcus lactis subsp. cremoris вязкий, синтеза внеклеточных метаболитов и органолептических показателей. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1- Выбор оптимального соотношения культур комбинированной закваски

Показа- Характеристика заквасок

тели B.longum L.cremoris Варианты комбинированной закваски

В379М 90:10 80:20 70:30 60:40

1 2 3 4 5 6 7

Конси- однород- однород- однород- однород- одно- вязкая,

стенция и ная, ная, ная, сгу- ная, родная, плот-

внешний жидкая вязкая, сток в меру вязкая ная

вид плотная нежный, слабый вязкая

Вкус и мягкий, мягкий, мягкий приятный кисло- кисло-

запах кисломо- кисломо- кисломо- кисломо- молоч- молоч-

лочный лочный лочный лочный ный ный

Продолжение таблицы 1

1 2 3 4 5 6 7-

Цвет Молочно-белый, равномерный по всей массе

Активность, ч 18 16 18 17 16 16

Кислотность, °Т 56 76 68,3 75,:3 77,3 78,7

Содержание бактерий КОЕ/см3: В.кнщит В379М Ь.сгетопБ 6 109 2 • 109 3 109 2 108 7 109 3 109 2 108 5 109 8 108 6 109

Содержание молочной кислоты, мг/100г 768 795 773 784 813 819

Степень синерезиса, мл 27 12 24 21 17 15

Как видно из данных таблицы 1, при соотношении бифидобактерий и сливочного стрептококка 80:20 наблюдается высокое количество жизнеспособных клеток пробиотических микроорганизмов. Дальнейшее увеличение сливочного стрептококка приводило к ухудшению органолептических свойств и снижению клеток бифидобактерий. Высокая плотность популяции пробиотических микроорганизмов 109 КОЕ/см3 при выбранном соотношении культур свидетельствует о симбиотических взаимоотношениях бифидобактерий и сливочного стрептококка.

Таким образом, в результате проведенных исследований разработана комбинированная закваска, активно ферментирующая молоко с образованием структурированных сгустков, обладающих хорошей влагоудерживающей способностью.

Исследование внеклеточных метаболитов, синтезируемых пробиотическими микроорганизмами

Перспективы совершенствования пробиотических препаратов заключаются в изучении продуктов метаболизма микробной клетки, синергического и ингибиторного действия различных видов бактерий при совместном культивировании. Согласно современным представлениям механизм положительного действия пробиотиков связан с подавлением патогенных и условно-патогенных микроорганизмов за счет продукции антимикробных веществ. В связи с этим в дальнейших исследованиях изучали антагонистическую активность комбинированной закваски. Необходимо отметить, что молочнокислые бактерии имеют разные пути метаболизма и не все проявляют высокую антагонистическую активность по отношению к патогенным микроорганизмам. Антимикробную активность оценивали ло величине зон угнетения роста тест- культуры вокруг цилиндрика. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2- Антимикробные свойства заквасочных культур

Вид Зоны угнетения роста, мм

В. Longum В379М L. cremoris Кремовит

Escherichie coli 21-23 20-22 22-26

Staphilococcus aureus 20-22 19-21 22-26

Salmonella typhimurium 24-26 22-25 25-27

Shigella sonnei 22-25 21-24 25-29

Shigella flexneri 18-20 22-24 24-25

Proteus sp 22-25 18-24 24-27

Наиболее высокой антимикробной активностью отличаются бифидо-бактерии, сочетание которых со сливочным стрептококком повышает антагонистическую активность комбинированной закваски. Высокая антагонистическая активность комбинированной закваски отмечена по отношению к тест - культурам Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Proteus sp , где наблюдается высокая задержка роста, бактериоцинами, выделяемыми микроорганизмами комбинированной закваски. Полученные экспериментальные данные показали, что антимикробная активность комбинированной закваски по эффективности действия на патогенные и условно-патогенные микроорганизмы значительно выше отдельных культур. Высокая антагонистическая активность комбинированной закваски объясняется не только синтезом лактобревина бифидобактериями и лактококцина сливочным стрептококком, но и образованием L- молочной кислоты, что согласуется с данными литературы о ее высокой антимикробной активности.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что комбинированная закваска обладает более высокой антагонистической активностью и широким спектром действия по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам.

Известно, что микроорганизмы в зависимости от условий культивирования синтезируют экзополисахариды (ЭПС) различного состава и с различными физико-химическими свойствами, что дает возможность ЭПС постоянно выполнять свои биологические функции и, таким образом, позволяет микробным популяциям обеспечить возможность своего существования. Поэтому дальнейшие исследования были посвящены изучению биосинтеза ЭПС при совместном культивировании бифидобактерий и сливочного стрептококка.Результаты исследований, представленные на рисунке 2 показывают, что культивирование бифидобактерий со сливочным стрептококком повышает биосинтез ЭПС и вязкость полученного сгустка.

с; 2

О С

о

10

Ж Ж ж ж

/ ж £ А

—

1 2 3 4 5 6 7 8 время, ч

♦ соотношение микроорганизмов 90:10 -И- 80:20 —А— 70:30

Рисунок 2 - Влияние соотношения культур в комбинированной закваске на накопление экзополисахаридов

Основной вклад в повышение ЭПС вносит сливочный стрептококк, который, вероятно, синтезирует ацилированные ЭПС, обладающие высокой структурообразующей способностью и повышающие реологические свойства сгустка. Результаты исследований свидетельствуют о возможности направленного биосинтеза ЭПС с помощью различного соотношения заквасочных культур бифи-добактерий и сливочного стрептококка в комбинированной закваске и подбора условий культивирования.

Таким образом, содержание ЭПС является одним из важных показателей при подборе культур для практического применения, так как от их количества зависят функционально-технологические свойства кисломолочных продуктов, процесс структурсобразования и вязкость.

На следующем этапе исследований была изучена антимутагенная активность заквасочных культур при совместном культивировании. Нами установлено, что Ь.сгетопБ снижает мутагенное действие азида натрия на 38% (таблица 3).

Таблица 3- Антимутагенные свойства комбинированной закваски

Вид микроорганизмов Среднее число реверантов на чашку Ингибирование, %

В.1о1^ит В379М 675 43,5

Ь.сгетопз 765 38,5

Комбинированная закваска 80:20 591 68,1

Наиболее ярко выраженный антимутагенный эффект проявляла комбинированная закваска, ингибиторный эффект которой составил 68%.

В результате проведенных исследований установлено, что в сравнении с отдельными культурами комбинированная закваска обладает более высокой антагонистической активностью к возбудителям кишечных инфекций, синтезирует больше экзополисахаридов и антимутагенных веществ, что очень важно для создания пробиотичеких продуктов.

Подбор условий культивирования для получения биомассы комбинированной закваски

Важную роль при культивировании микроорганизмов играет активность посевного материала. Нами установлено, что комбинированная закваска, состоящая из бифидобактерий и сливочного стрептококка, обладает высокой биохимической активностью (таблица 4).

Таблица 4- Качественная характеристика инокулята

Характеристика Показатели

Активность сквашивания, ч 16-18

Кислотность:

титруемая, °Т не более 75

активная, рН не более 4,76

Количество жизнеспособных клеток, КОЕ/ см3

B.longum В 379М 5 109

L. cremoris 2 109

Объем продукта (см3) в котором не допускаются:

БГКП (колиформы) 10

S. aureus 10

Патогенные микроорганизмы (в т.ч. сальмонеллы) 100

Дрожжи, КОЕ/ см3, не более 5

Плесени, КОЕ/ см3, не более 5

Из данных таблицы 4 следует, что инокулят характеризуется высоким количеством жизнеспособных клеток пробиотических микроорганизмов.

В последнее десятилетие неуклонно расширяется список изученных микробных процессов, реализуемых только при наличии достаточной плотности популяции (кворума). Культивирование бактерий часто не удается, если взята слишком низкая плотность популяции. Нами установлено, что необходимая плотность популяции пробиотических микроорганизмов обеспечивается при внесении 5 % инокулята. При выбранной дозе инокулята наблюдается активное накопление клеточной биомассы, о чем свидетельствует повышение оптической плотности. Установлено, что количество клеток бифидобактерий в конце культивирования достигает (1 10й) КОЕ/ см3, а сливочного стрептококка (1 Ю10) КОЕ/см3. Рост биомассы сопровождается образованием ЭПС (рисунок 3).

о: к ш га О

о л" 9 £

3 о

Ё Р

О о

0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0

/ у л 7

А г" р —

< 1 £ 1 г

15 |

10 5 о"

5 о

8 12 16 20 24 время, Ч биомасса —в— ЭПС

Рисунок 3 - Накопление биомассы и экзополисахаридов при периодическом культивировании

Данные представленные на рисунке 3 показывают, что синтез ЭПС начинается с первых часов развития заквасочных культур и продолжается на всех стадиях. Максимальное количество ЭПС отмечено в стационарной фазе роста. Вязкость культуральной жидкости достигает максимальных значений так же в стационарной фазе роста бактерий.

В процессе роста пробиотических микроорганизмов ее антимутагенные свойства могут изменяться. Поэтому в дальнейших исследованиях изучали проявление антимутагенной активности в процессе культивирования. Результаты исследований представлены на рисунке 4.

3

Щ *

о пз

(3 Р

Ь и

г I

а <и

80 70 60 50 40 30 20 10 0

. А т~ .—< и

А

/А \— —1 I—"

> У

Р

—> Г

6 12 24 48 время,ч

♦ В 1оп^ит В379М —А— Комбинированная закваска —Ьсгетога

Рисунок 4 - Динамика антимутагенной активности

Из рисунка 4 следует, что антимутагенная активность бактерий в отношении мутагенеза азида натрия зависит от возраста культуры. В первые 6 часов роста бактерий она не обнаружена, но уже через 12 часов роста эффект достигает 50%

у комбинированной закваски, 40 и 33% у бифидобактерий и сливочного стрептококка соответственно. Через 24 часа роста от начала культивирования наблюдается наиболее высокая антимутагенная активность, далее к 48 часам защитное действие почти не изменяется.

По нашему мнению, антимутагенные вещества защищают бактерии от неблагоприятных факторов окружающей среды, окислительного стресса, который может вызвать повреждение ДНК, РНК, белков и липидов, разрыв сшивки белковых молекул и просто энергетическое истощение клетки.

Более высокое количество антимутагенных веществ, синтезируемых бифидобактериями, обусловлено тем, что они относятся к анаэробам. Вследствие чего, культивирование бифидобактерий при доступе кислорода вызывает ответную реакцию, защищающую микробную клетку путем синтеза антимутагенных веществ. Поскольку сливочный стрептококк может развиваться в присутствии кислорода, защита от окислительного стресса менее эффективна. Что касается комбинированной закваски, то симбиоз бифидобактерий и лактококка способствует более высокому синтезу антимутагенных веществ. Кроме того, посредством внеклеточных метаболитов возможно межвидовое взаимодействие пробиотических микроорганизмов.

Результаты исследований свидетельствуют, что симбиоз бифидобактерий и сливочного стрептококка представляет собой своеобразную надорганиз-менную систему, свойством которой является кооперация отдельных клеток, когда их согласованная деятельность направлена на достижение одного и того же результата, то есть повышение синтеза внеклеточных метаболитов, образование молочной кислоты, летучих кислот, биосинтеза ЭПС, антимикробных и антимутагенных веществ.

Исследование защитных свойств экзополисахаридов

Для получения биопрепаратов высокой биохимической активности необходимо изучение факторов, влияющих на жизнеспособность клеток на всех этапах технологического процесса: культивирования, замораживания, сушки и хранения. Для этого требуется оптимизация технологии культивирования и изучение стрессовых воздействий на микроорганизмы для получения полноценных по технологическим характеристикам препаратов, основными из которых являются высокая жизнеспособность и активность ферментации молока.

В связи с этим дальнейшие исследования посвящены изучению некоторых защитных функций ЭПС, синтезируемых в процессе наращивания биомассы микроорганизмов. В экспоненциальной и стационарной фазах роста отбирали пробы и исследовали устойчивость клеток бифидобактерий к низким значениям рН, замораживанию и высушиванию.

Установлено, что при снижении рН культуры в экспоненциальной фазе роста до 3 выживало 30 и 20% клеток соответственно (рисунок 5).

Клетки стационарной фазы роста оказались более устойчивыми к действию низких значений рИ. В начале стационарной фазы роста количество жизнеспособных клеток составило 90%, а в более поздней стационарной фазе в аналогичных условиях все клетки остались в жизнеспособном состоянии. Очевидно, это связано с более высоким содержанием синтезируемых ЭПС и вязкости культуральной жидкости.

100

£

5 80

н

ш

<8 40

0

1 20

0

1 0

а - середина экспоненциальной фазы б - стационарная фаза в — поздняя стационарная фаза

Рисунок 5 - Влияние различных значении р}1 на Выживаемость клеток

Клетки в экспоненциальной и Стационарной фазах роста обладали одинаковой устойчивостью к замораживанию. Тогда как при высушивании, более устойчивыми оказались клетки из стационарной фазы (рисунок 6 а ,б).

Использование защитных сред повышало устойчивость клеток к замораживанию и сушке, которая достигала 90%.

В результате проведенных исследований установлена способность ЭПС защищать клетки пробиотических микроорганизмов от стрессовых воздействий, вызванных действием низких значений рН, замораживанием и высушиванием. Защитные функции могут быть обусловлены как свободным» ЭПС, находящимися в культур альной жидкости, так и полисахаридами, ассоциированными с клетками.

□ рН= 7 ®рН= 5 □ рН- 3

1 2 3 4 1 2 3 4

а б

а:

1-до замораживания, 2- после замораживания (экспоненциальная фаза роста)

3-после замораживания (стационарная фаза роста)

4-после замораживания с защитной средой (стационарная фаза роста)

б:

1-до высушивания, 2- экспоненциальная фаза роста,

3- стационарная фаза роста, 4- стационарная фаза роста с защитной средой

Рисунок 6 - Влияние технологических процессов на выживаемость микроорганизмов (а- замораживания, б- лиофильной сушки)

На основании изучения физиологических особенностей роста бактерий и физико-химических свойств синтезируемых ими ЭПС нами установлено, что основной физиологической функцией ЭПС изученных нами микроорганизмов является защитная функция этих полимеров.

Данные "итературы свидетельствуют о том, что ЭПС обладают протекторным действием и непосредственно через физические или химические взаимодействия с клеточными структурами и макромолекулами защищают клетки от повреждающих воздействий. По видимому, в экстремальных ситуациях именно протекторы играют защитную роль, поскольку они действуют гораздо быстрее по сравнению с индуцибельными системами защиты.

На основании проведенных исследований можно сделать вывод, что подготовка биомассы к замораживанию и высушиванию на всех стадиях технологического процесса должна проводиться с учетом функционального состояния бактерий. Установлено, что наибольшей устойчивостью к замораживанию и сушке заквасочные культуры обладают в стационарной фазе роста.

Разработка технологии БАД и концентратов комбинированной закваски

. На основании полученных экспериментальных данных разработана технологическая схема производства жидкой, замороженной и сухой концентрированных заквасок, представленная на рисунке 7.

Приготовление питательной среды

Внесение инокулята в количестве 5%

Наращивание биомассы (Н37±1)°С,1=(24±2ч) с двукратной нейтрализацией

Отделение верхнего слоя культуральной жидкости

Розлив во флаконы, укупоривание, маркировка

Хранение (1= не выше 6°С, 3 мес)

Жидкая концентрированная закваска (БАД)

Подготовка инокулята

Приготовление защитной среды

I

->■ Центрифугирование, смешивание с защитной средой 1: 1

Розлив во флаконы, укупоривание

Маркировка, хранение (1= минус 18°С, 6 мес)

Лиофильная сушка

1

1

Замороженная концентрированная закваска

Маркировка, хранение 0= минус 18°С,12 мес)

I

Сухая концентрированная закваска

Рисунок 7- Схема приготовления жидкой, замороженной и сухой концентрированных заквасок

Качественная характеристика концентрированных заквасок представле на в таблице 5.

Таблица 5- Качественная характеристика концентрированных заквасок

Наименование Показатель концентрированной закваски

показателей жидкой (БАД) замороженной сухой

Органолептические: Консистенция и внешний однородная, в столбик замороженной сус- столбик сухой сус-

вид меру вязкая пензии пензии

Цвет от белого до светло-желтого

Вкус и запах чистый, кисломолочный - -

Физико-химические:

Активность сквашивания, ч - 10-12 10-12

Предельные значения, рН 4,5-7 4,5-7 4,5-7

Температура при выпуске с

предприятия °С, не выше плюс 4 минус 18 минус 18

Микробиологические: • Количество бактерий на конец

срока годности, КОЕ/ см3, не

менее:

ВЛопцит В379М Ь. сгетош 107 107 10ю Ю10 1010 Ю10

Объем продукта (см^), в котором

не допускаются: БГКП (колиформы) Б.аигеиБ 10 10 10 10 1 1

Патогенные микроорганизмы (в т.ч. сальмонеллы) Дрожжи, КОЕ/см3 не более Плесени, КОЕ/см3 не более 50 10 10 100 5 5 10 5 5

Данные таблицы 5 свидетельствуют о том, что полученные препараты характеризуются высоким содержанием жизнеспособных клеток бифидобакте-рий, сливочного стрептококка и активностью ферментации молока.

На основании проведенных исследований разработаны технологии концентрированных заквасок на основе симбиоза пробиотических бактерий. Жидкая закваска может быть рекомендована в качестве биологически активной добавки к пище. Замороженный и сухой концентраты - в качестве заквасок прямого внесения для производства кисломолочных продуктов.

Практические аспекты применения концентрированной закваски

На следующем этапе работы разработана технология пробиотического кисломолочного продукта «Кремовит». Особенностью производства разработанного продукта является использование закваски прямого внесения, которая позволяет получить кисломолочный продукт с высокими органолептическими и пробиотическими свойствами.

Применение замороженного препарата осуществляли из расчета 2 ед.активности концентрата на 200 л молока путем прямого внесения в молоко. Оценку качества готового кисломолочного продукта проводили по органолеп-тическим, физико-химическим и микробиологическим показателям. Полученные результаты представлены в таблице 6.

Добавление сахарного сиропа с сухим порошком ягод малины придает готовому продукту нежно-розовую окраску, гармоничное сочетание кислого и сладкого вкусов с привкусом наполнителя. По результатам проведенных исследований установлено, что введение наполнителей улучшает органолептические показатели готового продукта и не оказывает значительного действия на рост и развитие бифидобактерий (табл.6).

Таблица 6- Качественная характеристика готового продукта

Показатели Кисломолочный напиток «Кремовит»

Без добавок С добавками

1 2 3

Органолептические: Внешний вид Поверхность блестящая, однородная, в меру вязкая, без отделения сыворотки на поверхности. Поверхность блестящая, при использовании фруктово-ягодных наполнителей — с наличием их включений. Без отделения сыворотки на поверхности.

Цвет Окраска равномерная, молочно-белого цвета. Окраска равномерная, нежно-розового цвета, свойственная внесенным добавкам.

Вкус и запах Приятный кисломолочный, без посторонних привкусов и запахов, с легким сливочным оттенком. Приятный кисломолочный, с ярко выраженными, соответствующими внесенным ингредиентам вкусом и ароматом.

Консистенция Однородная, в меру вязкая, нежная без нарушения сгустка Однородная, в меру вязкая, нежная без нарушения сгустка, при использовании . . фруктово-ягодных наполнителей с наличием их включений.

Продолжение таблицы 6

1 2 3

Физико-химические: Титруемая кислотность, °Т не более 75 75

Микробиологические: Количество жизнеспособных клеток, КОЕ/см3, не менее: В. longum В379М L. cremoris 107 107 107 107 •

Объем продукта, в котором не допускаются:

БГКП 0,1 од

S. aureus 1,0 1,0

Патогенные микроорганизмы (в т.ч. сальмонеллы) 25 25

Дрожжи, КОЕ/см\не более 50 50

Плесени, КОЕ/см3, не более 50 50

Кисломолочные продукты характеризуются хорошими органолептиче-скими показателями и содержат высокое количество жизнеспособных клеток бифидобактерий и сливочного стрептококка, что важно при производстве продуктов, обладающих лечебно-профилактическими свойствами.

Выводы

1. В результате проведенных исследований разработана технология бактериального концентрата на основе сочетания бифидобактерий и сливочного стрептококка.

2. Выбрано оптимальное соотношение заквасочных культур, позволяющее повысить реологические и пробиотические свойства комбинированной закваски.

3. Установлено, что заквасочные культуры обладают широким спектром антимикробной активности.

4. Отмечен высокий синтез внеклеточных метаболитов, экзополисаха-ридов, антимутагенных и антимикробных веществ, при ферментации молока комбинированной закваской.

5. Подобраны условия культивирования комбинированной закваски для получения бактериального концентрата

6. Установлено, что с увеличением количества синтезированного ЭПС и вязкости культуральной жидкости повышается устойчивость клеток микроорганизмов к низким значениям рН, замораживанию и высушиванию.

7. Обоснованы технологические параметры производства жйдкого, замороженного и сухого бактериального концентрата.

8. Установлено, что концентрированная закваска, включающая в свой состав бактерии с разным механизмом биологической активности, улучшает

органолептические свойства кисломолочного продукта и расширяет спектр профилактического действия.

9. Проведена опытно-промышленная проверка технологии бактериального концентрата в условиях производства.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Кузнецова А.Б. Функциональное питание как образ жизни будущего поколения // Молодежь Забайкалья: интеллект и здоровье: Мат-лы 8-й науч.- практ. конф. - Чита: Изд-во ЗИП СибУПК, 2003. - С.155-157.

2. Хамагаева И.С., Кузнецова А.Б., Куклина В.Н. Разработка технологии комбинированной закваски П Прогрессивные технологии и оборудование в пищевой промышленности: Материалы второй международной научно-технической конференции. - Воронеж, 2004. - С. 223-224.

3. Хамагаева И.С. Кузнецова А.Б. Влияние состава микрофлоры на реологические свойства кисломолочных продуктов // Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации: Вторая Всероссийская научно-техническая конференция - выставка с международным участием / МГУПП. - Москва, 2004.-С. 280-283.

4. Хамагаева И.С., Кузнецова А.Б. Пробиотики как основа функционального питания// Ученые записки: Сб. науч. ст. / ЗИП СибУПК. - Чита, 2004. -№5. - С.393-399.

5. Хамагаева И.С., Кузнецова А.Б., Куклина В.Н. Выбор оптимального соотношения бифидобактерий и сливочного стрептококка в комбинированной закваске // Сб. науч.тр. ВСГТУ. - Улан - Удэ, 2005. -С.26-28

6. Кузнецова А.Б. Здоровье - функциональное питание // Исследовательская деятельность студентов специальностей «Товароведение и экспертиза товаров» и «Реклама»//Сборник статей. - Чита: Изд-во ЗИП СибУПК, 2005. - С.24-27.

7. Кузнецова А.Б. Использование заквасок прямого внесения - один из путей повышения качества бифидосодержащих молочных продуктов // Состояние и перспективы развития регионального потребительского рынка. - Тюмень, 2005. -С. 279282.

8. Кузнецова А.Б. Исследование органолептических свойств нового кисломолочного продукта // Технология и техника Агропромышленного комплекса. — Улан - Удэ, 2005. -С. 290-293.

9. Кузнецова А.Б. Качественная характеристика кисломолочного продукта «Кремовит» // Технология и техника Агропромышленного комплекса. - Улан-Удэ, 2005.-С. 280-281.

10. Хамагаева И.С. Кузнецова А.Б., Кривоносова A.B. Закваска для «"Бифивит» //Молочная промышленность, 2007. - №3. -С.48-49.

Отпечатано в типографии ВСГТУ Усл. пл. 1,16. Тир.80 -2007. Заказ №70

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. СОСТОЯНИЕ ВОПРОСА И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ

1.1. Современные представления о пробиотиках и пробиотических продуктах.

1.1.1. Пробиотики и механизм их действия.

1.1.2. Пробиотические продукты.

1.2. Внеклеточные метаболиты, как факторы адаптации бактерий к неблагоприятным условиям среды.

1.2.1. Антимутагенез бактерий.

1.2.2. Экзополисахариды.

В соответствии, с концепцией государственной политики в области здорового питания населения России, уделяется большое внимание увеличению производства пищевых продуктов функционального назначения.

Под продуктами функционального назначения подразумевают, употребление таких продуктов естественного происхождения, которые при ежедневном применении, оказывают определенное регулирующее действие на организм в целом или на его определенные системы, органы и их функции (иммуностимуляторы, биокорректоры кровяного давления, уровня холестерина и т.п.) [13,43,44].

Функциональные свойства продуктам питания придают пищевые волокна, витамины, минеральные вещества, полиненасыщенные жирные кислоты, олигосахариды, а также группы, включающие микроэлементы, пребиотики, пробиотики и другие составляющие [45,46].

Ингредиенты, придающие продуктам функциональные свойства, должны быть натуральными, не иметь побочных эффектов, употребляться без ограничений и не вызывать снижение биологической ценности продуктов.

Для создания продуктов с лечебно-профилактическими свойствами используют пробиотические микроорганизмы, подавляющие рост патогенной микрофлоры, обладающие радиопротекторными, противоопухолевыми и имунно-коррегирующими свойствами.

Механизм лечебно-профилактического действия пробиотиков является многогранным и обусловлен не только высоким содержанием жизнеспособных клеток, но и синтезом внеклеточных метаболитов, которые усиливают пробиотический эффект. Экзометаболиты пробиотических микроорганизмов подавля

5' ют рост патогенной микрофлоры, обладают радиопротекторными, противоопухолевыми и иммунокоррегирующими свойствами. Это свидетельствует о перспективности изучения прокариот, как источников биологически активных субстанций экзополисахаридов, антимикробных и антимутагенных веществ, для создания пробиотических продуктов нового поколения.

Потенциальная возможность к накоплению биологически активных веществ пробиотическими микроорганизмами, различна и зависит от видовой и штаммовой принадлежности, а так же проявляется в определенных условиях культивирования[5,100,102].

Наиболее часто в качестве микроорганизмов, вводимых в состав про-биотиков, используют молочнокислые и бифидобактерии [97,99,102].

Известны успешные попытки применения при имуннодефицитах препаратов из пробиотиков - представителей Lactococcus и Streptococcus.

Бифидобактерии синтезируют экзополисахариды, обладающие низкой структурообразующей способностью, что затрудняет получение кисломолочных продуктов с высокой вязкостью, которым отдают предпочтения потребите-ли[34,73].

В связи с этим, является актуальным создание бактериального концентрата на основе сочетания бифидобактерий и сливочного стрептококка вязкой расы с высоким экзополисахаридным потенциалом, что позволит улучшить ор-ганолептические и реологические свойства продукта, а так же расширить спектр профилактического действия.

выводы

1. В результате проведенных исследований разработана технология бактериального концентрата на основе сочетания бифидобактерий и сливочного стрептококка.

2. Выбрано оптимальное соотношение заквасочных культур, позволяющее повысить реологические и пробиотические свойства комбинированной закваски.

3. Установлено, что заквасочные культуры обладают широким спектром антимикробной активности.

4. Отмечен высокий синтез внеклеточных метаболитов, экзополисахари-дов, антимутагенных и антимикробных веществ, при ферментации молока комбинированной закваски.

5. Подобраны условия культивирования комбинированной закваски для получения бактериального концентрата.

6. Установлено, что с увеличением количества синтезированного ЭПС и вязкости культуральной жидкости повышается устойчивость клеток микроорганизмов к низким значениям рН, замораживанию и высушиванию.

7. Обоснованы технологические параметры производства жидкого, замороженного и сухого бактериального концентрата.

8.Установлено, что концентрированная закваска включающая в свой состав бактерии с разным механизмом биологической активности улучшает ор-ганолептические свойства кисломолочного продукта и расширяет спектр профилактического действия.

9. Проведена опытно-промышленная проверка технологии бактериального концентрата в условиях производства.

1. Абросимов М.А. Потребление молока и молочной продукции// Молочная промышленность, 2006. - № 1. - С. 11 -13.

2. Ананьева Н.Г., Ганина В.И., Нефедова Н.В., Габрильян Г.Р. Применение иммобилизированных форм пробиотических бактерий в производстве молочных продуктов// Молочная промышленность, 2006. -№11.- С.46 47

3. Анацкая А.Г. Создание новых молочных продуктов// Молочная промышленность, 2000. -№2. -С. 29-31.

4. Анищенко И.П. Бактериальный препарат ПБ-СМ для сметаны// Молочная промышленность, 2002. -№8.-С35-37.

5. Антибиотическая активность микроорганизмов. Методические указания для студентов пищевых специальностей по курсам: «Микробиология» и «Химия биологически активных веществ» / Т.Е. Данилова, Е.Т. Инешина, Л.Ю. Прудова. Улан-Удэ, 1997. - 80 с.

6. Аркадьева P.A., A.M. Безбородов, И.И. Блохина и др. Промышленная микробиология. Учебное пособие для вузов по спец. «Микробиология» и «Биология» М.: Высш. шк., 1989. - 688 с.

7. Артюхова С.И. Изучение природной устойчивости микроорганизмов поликомпонентной закваски для сметанного продукта к антибиотикам // Молочная промышленность, 2004. -№8. -С.24.

8. Артюхова С.И. Научно-экспериментальное обоснование новых биотехнологий синбиотических молочных продуктов. Автореферат. докт. техн. наук. - Улан-Удэ, 2006. - 43 с.

9. Леонов Н.Р. Микробиология. 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Колос, 1997. - 352 е.: ил. - Учебники и учебные пособия для студентов высших учебных заведений.

10. Банникова JI.A., Королева Н.С., Семенихина В.Ф. Микробиологические основы молочного производства. -М.: Пищевая пром-ть, 1987.-400 с.

11. Н.Белаева А.Г., Туполева А.Е. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты // Вопросы питания, 1999. №2.- с.32.

12. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. -М.: Медицина, 1982.-456 с.

13. Большаков О.В. Проблемам здорового питания государственный статус // Молочная промышленность, 1998. - № 2. - С. 4 - 6.

14. Бондаренко A.B., Бондаренко В.М. Пути совершенствования этиопатог генетической терапии дисбактериозов // Микробиология, 1998. № 5. - С. 96 -101.

15. Бочков Н. П. Система поиска и изучения соединений с антимутагенными свойствами // Хим.-фарм. журн., 1992. № 9-10. - С. 42-49.

16. Брайерли К. Биосинтез полисахаридов // Биотехнология. М.: Мир, 1988.-С. 229-234.

17. Волков B.JI. К вопросу о физиологических и физико-химических механизмах устойчивости микроорганизмов к замораживанию и высушиванию// Микробиология, 1994.- т. 63. № 1.- С. 5 -16.

18. Воробьев A.A., Абрамов H.A., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дис-бактериозы актуальная проблема медицины. Вестн. росс. АМН, 1997. - № 3. -С. 4 - 7.

19. Воробьёв A.A., Лыкова Е.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции // Микробиология, 1999. № 6. - С. 102 -105.

20. Воробьева Л. И. Антимутагенные свойства бактерий// Прикладная биохимия и микробиология, 2002. Т. 38. - № 2. - С 115.-127.

21. Воробьева Л.И. и др. Антимутагенность пропионовокислых бактерий // Микробиология, 1991. т. 60. - № 6. - С. 83 - 89.

22. Воробьева Л.И. и др. Антимутагенность пропионовокислых бактерий // Тез. докл. Всес. Кор. совещания «Гигиенические последствия загрязнения окружающей среды мутагенными факторами». Самарканд, 1990.

23. Воробьева Л.И. Техническая микробиология. М.: Изд-во МГУ.- 1995. -256 с.

24. Воробьева Л.И., Абилев С. К. Антимутагенные свойства бактерий // Прикладная биохимия и микробиология. Том.38,2002. №2 - С. 115-127.

25. Воробьева, Л. И. Внеклеточный белок пропионовокислых бактерий ин-гибирует индуцируемые мутации у штаммов Salmonella typhimurium// Микробиология, 2001. Т. 70. - № V. - С. 39-44.

26. Гаврилов Г.Б., Макарушин A.A., Гаврилов Б.Г. Сравнительное исследование методов определения антибиотиков//Молочная промышленность, 2006. -№ 5.- С. 34-36.

27. Ганбаров Х.Б., Джафаров М.М. Антибактериальная активность лакто-бактерий рода Lactobacillus// Молочная промышленность, 2006. № 8. - С. 56.

28. Ганина В.И. Пробиотики. Назначение, свойства и основы биотехнологии: Монография. М.: МГУПБ, 2001. - 169 е.: ил.

29. Ганина В.И., Рожкова Т.В., Хвыля С.И. Микроструктура сметаны на основе ЭПС стартерной культуры // Молочная промышленность, 2005. - № 7. -С. 36-37.

30. Ганина В.И., Ананьева Н.В., Борисова Л.А., Жаркова Е.Ю. Изучение стабильности свойств молочнокислых бактерий// Молочная промышленность, 2006.-№ 10.-С. 39-40.

31. Гиринович О.В Российский рынок детских продуктов питания // Молочная промышленность, 2006. № 10. - С. 9 - 11.

32. Голубев В.Н., Жиганов И.Н. Пищевая биотехнология. М.: ДеЛи принт. 2001.-122 с.

33. Гончиков Г.Г. Кометаболизм дисахаридов и микробные консорциумы: биоэкологические и биотехнологические перспективы // Инженерная экология, 2002.-№3.-С. 2-17.

34. Горбатова К.К. Физико-химические и биохимические основы производства молочных продуктов. СПб.: ГИОРД, 2004. 347 с.

35. Горбатова К.К. Химия и физика молока. Учебник для вузов. - СПб.: ГИОРД, 2003.-288 е.: ил.

36. Горощенко А.Г. Российский рынок молочных продуктов// Молочная промышленность, 2007. № 1. - С. 46 - 49.

37. ГОСТ 52054 2003 Молоко натуральное коровье - сырье. Технические условия: Введ. 30.06.2003. - М.: Изд-во стандартов, 2003. - 15 с.

38. ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа: переиздат. февраль 1986 с изм. 1. - Взамен ГОСТ 9225-68 Введ. 01.01.86. - М.: Изд-во стандартов, 1986. - 24с.

39. Грачёва И.М., Бутова С.Н., Типисева И.А., Эль-Регистан Г.И. Теоретические основы биотехнологии. Биохимические основы синтеза биологически активных веществ // М.: Элевар, 2003. 554 с.

40. Гринберг Т.А., Пирог Т.П., Малашенко Ю.Р., Пинчук Г.Э. Микробный синтез экзополисахаридов на Ci Сг - соединениях. - Киев: Наук. Думка, 1992. -212 с.

41. Гусев М.В., Минеева JI.A. Микробиология. М.: Академия, 2003. -463с.

42. Дранник, Г. Н. Иммунотропные препараты. Киев.: Здоровье, 1994. -286 с.

43. Драчева JI.B. Правильное питание и пищевые биологически активные добавки // Пищевая промышленность, 2000. №6 - С. 84 - 85.

44. Драчева JI.B. Пробиотические свойства кисломолочных продуктов// Пищевая промышленность, 2003. № 10 - С. 5 - 6.

45. Драчева JI.B., Короткова Е.И., Лукина А.Н. Антиоксидантные свойства пробиотиков// Молочная промышленность, 2006. № 12. - С. 62 - 63.

46. Зобкова З.С. Функциональные цельномолочные продукты// Молочная промышленность, 2006. № 4. - С. 86 - 70.

47. Зобкова З.С., Фурсова Т.П. Особенности технологии и пути улучшения качества кисломолочных напитков, вырабатываемых резервуарным способом// Молочная промышленность, 2006. № 5. - С. 54 - 58.

48. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии. -М.: Academia. 2003. - 208 с.

49. Блинов Н.П. Основы биотехнологии. Для студентов институтов, аспирантов и практических работников. Издательская фирма «Наука» СПБ, 1995. -600 с.

50. Емцева Т.В., Лаврова JI.H., Константинова Н.Д. Влияние условий предварительного культивирования бактерий на их устойчивость и структуру клетки при замораживании и лиофилизации // Микробиология, 1991. т.60. - № 5. -С. 879 - 889.

51. Жарикова Г.Г., Козьмина А.О. Микробиология, санитария и гигиена пищевых продуктов. Практикум. - М.: Гелан, 2001. - 254 с.

52. Иванова Л.И. Антибиотически активные молочнокислые бактерии в производстве продуктов гарантированного качества. М.: Издательство ЦНИИТЭИ, 1993. - 38 с. - (Обзорная информация / Цельномолочная промышленность).

53. Квеситадзе Г.И., Безбородое A.M. Введение в биотехнологию. М.: Наука, 2002.-284 с.

54. Княжев В.А. Правильное питание. Биодобавки. М.: Изд-во МГУ, 1998. -240 с.

55. Комов В.П., Шведова В.Н. Биохимия: Учебник для вузов. М.: Дрофа, 2004.-639 с.

56. Коршунов В.М. Проблемы регуляции микрофлоры кишечника // Микробиология, 1995. № 3. - С. 48 - 53.

57. Коршунов В.М., Уртаева З.А. Ефимов Б.А. и др. Изучение антагонистической активности бифидобактерий in vitro и in vivo с использованием гно1 тобиологической технологии // Микробиология, 1999. № 5. - С. 72 - 77.

58. Красникова JI.B., Кострова Н.Е., Шаробайко В.И. Метаболизм молочнокислых бактерий. М.: ЦНИИТЭИ мясомолпром., 1980. - 40 с.

59. Красовский П.А. Экспертиза качества молока и кисломолочных продуктов. М.: Пищевая промышленность, 2001. - вып. 13. - 286 с.

60. Крусь Г.Н., Храмцов А.Г., Волокитина З.В. Технология молока и молочных продуктов. М.: Колос, 2004. - 456 с.

61. Крусь Г.Н., Шалыгина А.М., Волокитина З.В. Методы исследования молока и молочных продуктов. М.: Колос, 2002. - 367 с.

62. Куваева И.Б., Кузнецова Г.Г. Антагонистическая активность микробных популяций защитной флоры и её связи с характеристикой микробиоценоза и факторами питания // Вопросы питания, 1993. № 3. - С. 46 - 50.

63. Куликова Т.В. Бифидобактерии ВВ-12™- пробиотик №1 в мире// Мог лочная промышленность, 2006. № 11. - С. 44 - 45.

64. Липатов H.H., Конь И.Я., Ладодо К.С. и др. Новые специализированные кисломолочные продукты для профилактического питания детей // Пищевая промышленность, 1998. -№ 12. С. 14 -15.

65. Манаков М.Н., Победимский Д.Г. Теоретические основы технологии микробиологических производств. М.: Агропромиздат, 1990. - 272 с.

66. Метаболизм микроорганизмов / Под ред. Н.С. Егорова. М.: МГУ, 1986.-252 с.

67. Николаев Ю.А. Внеклеточные факторы адаптации бактерий к неблагоприятным условиям среды. Прикладная биохимия и микробиология, 2004. -том 40.-№4.- С. 387-397.

68. Новик Г.И., Высоцкий В.В. Архитектоника популяций бифидобакте-рий: субмикроскопический аспект когезии клеток: BIFIDOBACTERIUM ADO-LESCENTIS BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM // Микробиология, 1996. т. 65.-№1.-С. 60-66.

69. Новик Г.И., Высоцкий В.В. Изменение морфологии клеток в циклеразвития популяций BIFIDOBACTERIUM ADOLESCENTIS и BIFIDOBACt

70. TERIUM BIFIDUM. 11 Микробиология, 1996. том 65. - № 1. - С. 60 - 66.

71. Новик, Г. И. Архитектоника популяции бифидобактерий// Микробиология, 1995.-Т.64.-№2.-С. 222-227.

72. Охрименко О.В., Охрименко А.В. Исследование состава и свойств молока и молочных продуктов Вологда - Молочное: ВГМХА, 2000. - 162 с.

73. Пирог Т.П., Гринберг Т.А., Малашенко Ю.Р. Влияние факторов внешней среды на образование и свойства экзополисахаридов Acinetobacter sp. // Прикладная биохимия и микробиология, 1997. том 66. - № 4. - С. 340.

74. Пирог Т.П., Гринберг Т.А., Малашенко Ю.Р. Защитные функции экзополисахаридов, синтезируемых бактериями Acinetobacter sp. // Микробиология, 1997. том 66. - № 3. - С. 335 - 340.

75. Пирог Т.П., Коваленко М.А., Кузьминская Ю.В. Энергетические и биохимические аспекты интенсификации синтеза экзополисахаридов ACINETOBACTER SP. на смеси этанола и глюкозы // Микробиология, 2003. том 72. - № З.-с. 348-355.

76. Пирог Т.П., Корж Ю.В., Лащук Н.В. Влияние способа приготовления посевного материала на синтез экзополисахарида этаполана // Биотехнология, 2005.-№5.- С. 29-36.

77. Позняковский В.Н. Гигиенические основы питания. М.: Изд-во НГУ, 1999.-447 с.

78. Поспелова В.В., Грачева Н.М., Ханина Г.И. и др. Эубиотики эффекг тивное средство нормализации микрофлоры // Врач, 1997. - №4. - С. 30 - 32.

79. Приданникова И., Елизарова, Е. Закваски прямого внесения и ингредиенты для производства кисломолочных напитков // Молочная промышленность, 2004.-№2.-С. 32-33.

80. Рогов И.А. Пищевая биотехнология. М.: Колос, 2004. 440 с.

81. Семенихина В.Ф. Совершенствование способов приготовления заквасок и методов микробиологического контроля в молочной промышленности. -М.: 1989.-45 с.

82. Семенихина В.Ф., Рожкова И.В., Сундукова И.В. Кисломолочные продукты нового поколения // Молочная промышленность, 1999. № 7. - С. 29 - 30.

83. Семенихина В.Ф., Сундукова И.В., Хорькова Е.А. Питательная среда для накопления биомассы бифидобактерий // Молочная промышленность, 1985. -№9.-С. 16-17.

84. Соколова О.М. ОАО «Завод детских молочных продуктов» и компания «Христиан Хансен» 10 лет успешного сотрудничества» // Молочная промышленность, 2005. - № 9. - С. 18 -19.

85. Соловьева, Е., Карагодина, В. Новые заквасочные культуры для кисломолочных продуктов и сыров // Молочная промышленность, 2005.- №9. С. 1415.

86. Соловьева Е.Е. Ингредиенты для здорового питания// Молочная промышленность, 2006. № 6. - С. 90 - 91.

87. Сорен Оисен. Роль пробиотиков и стабилизаторов в производстве киг сломолочных продуктов // Молочная промышленность, 2002. № 8. - С. 32 -33.

88. Стенфельдт Э., Шаманова Г.П. Биопродукты продукты будущего. // Молочная промышленность, 2000. - № 11. - С. 20 - 21.

89. Степаненко П.П. Микробиология молока и молочных продуктов. -Учебник для вузов. М, 2002. - 413 с.

90. Тубельян, В.А. Наше здоровье в наших руках// Пищевая промышленность, 2002.-№1.-С. 67-68.

91. Тубельян, В.А., Княжев, В.А. Реализация концепции государственной политики здорового питания населения России: Научное обеспечение // Вопросы питания, 2000. №3.- С. 16-19.

92. Ураков H.H., Волков В .Я., Боровик Р.В. Функциональное состояние и механизмы повреждения микроорганизмов в процессе приготовления бактериальных препаратов// Биотехнология, 1988. т.4. - С. 420 - 432.

93. Урсова Н.И., Римарчук Г.В., Щеплягина JI.A., Савицкая К.И. Современные методы коррекции дисбиоза кишечника у детей (учебное пособие) М., 2000. - 48 с.

94. Хамагаева И.С. Научные основы биотехнологии кисломолочных продуктов для детского и диетического питания: Монография. Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2005.-279 с.

95. Хамагаева И.С., Белозерова JI.M. Кисломолочный продукт функционального питания // Достижения науки и техники развитие Сибирских регионов: Материалы Всероссийской науч.-практ. конф. Красноярск, 1999. - С. 55 -56.

96. Хамагаева И.С., Белозерова Л.М. Новый кисломолочный продукт // Интеграция науки, производства и образования: Состояние и перспективы: Тез. докл. Всероссийской науч.-техн. конф. -Юрга, 1999. С. 88 - 89.

97. Харитонов В.Д., Федотова О.Б. Продукты лечебного и профилактического назначения //Молочная промышленность, 2003. № 12. - С. 71.

98. Хезекер Г. Данные о состоянии здоровья для выработки рекомендаций по питанию// Вопросы питания, 2000 № 3. - С. 8-13.

99. Шевелева С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса // Вопросы питания, 1999. № 2. - С. 32 - 39.

100. ЮО.Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том 1: Микрофлора человека и животных и ее функции. М.: Грантъ, 1998.- 199с.

101. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. М.: Грантъ, 2001. - 288 с.

102. Ю2.Шендеров, Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Пробиотики и функциональное питание. -М.: ГРАНТЪ, 2001. -288с.

103. Шендеров, Б.А. Пробиотики и функциональное питание. Общие и избранные разделы проблемы// Пищевые ингредиенты, сырье и добавки, 2005. -№2. -С23-26.

104. Эрвольдер Т.М. Бакпрепараты с бифидобактериями и методы их применения// Молочная промышленность, 1999. № 2. - С. 36 - 39.

105. Alexander, М. Biodesradation and bioremediaiion. New York. : Aca-dem. Press, 2000.-302 p.

106. Bacteria as multicellular Organisms / Eds. D. A. Shapiro, M. Dworkin. -N.Y.: Oxford Univ. Press, 2000. 456 p.

107. Bearson, S. W. Acid stress responses in enterobacterial // FEMS Microbiology Lett. 2004. - V. 147. - P. 173-180.

108. Bruckner D., Collona P. // J. Clinical Infection Diseases. 1999, V.25. P. 1-10.

109. Deegenaars, L. Stress protein and stress tolerance in an Antarctic, psychro-philic yeast, Candida psychrophila // FEMS Microbiol. Lett. 2001. - V. 151. - P. 191-196.

110. Fooks L.J., Fuller R., Gibson G. R. Prebiotics, probiotics and human gut microbiology // Inter. Dairy J. 2002. - Vol. 9. - №1. - P. 53 - 61.

111. Gibson G.R., Beaty E.R., Waney X. // Gastroenterology. 1999. Vol. 108, №4.- P. 975-982.

112. Gurr M.J. Dairy product in human health and nutrition (Proceedings of 1-st world congress of dairy products in human health and nutrion). A. A. Balkema / Rotterdam / Brookfield 2000.- P. 113 -119.

113. Hiirayama K., Rafter J. The role of probiotic bacteria in cancer prevention // Microbes Infect., 2001. -Vol. 2. № 6. P. 681 - 686.

114. Kets Edwin, P.W. Effect of carnitines on Lactobacillus plantarum subjected to osmotic stress // FEMS Microbiol. Lett. 1999. - V. 146. - P. 323-330.

115. Marshall Valerie M.E. The microflora and production of fermented milks // Progr. Ind. Microbial. 2002. - Vol. 23. - P. 1 - 44.

116. McGinley, Webster G.F., Leyden J.J. Regional variation of cutaneous propionibacteria // Appl. Environment. Microbial. 2000. Vol. 35, №1. - P. 62 - 66.

117. Nishioka H., Nunoshiba T. Role of enzymes in antimutagenesis of humanisaliva and serum// Antimutagenesis and Anticarcinogenesis Mechanisms. N.Y.; London, 1999. -P. 143 -151.

118. Ouwehand A. C., Kirijavainen P.V., Shortt C., Salminen S. Probiotics: mechanisms and established effect // Int. Dairy Journal. 2001. - Vol. 9. - № 1. - P. 43 -52.

119. Perez, Chaia A. The probiotic properties of bacteria // Le lait. 1999. - V. 79.- P. 175-185.

120. Piper, W., Peter. The heat shock and ehtanol stress responses of yeast exr hibit extensive similarity and functional overlap // FEMS : Microbiol. Lett. 1998. -V. 134.-P. 121-127.

121. Ritter P., Schwad H., Holzern. Testing the stimulatory or inhibitory effect of micrococci on propionic bacteria // Schweir. Milcgztg. 1999. Vol. 93. - № 113. -P. 929 - 930.

122. Road R., Reddy A.V., Pulusani S.R., Cornwell P.E. Biosynthesis and utilization of folic acid and vitamin lactic cultures in skim milk // J. Dairy Sci. 2000. -Vol. 67.-№6.-P. 1169- 1174.

123. Rowburry, R. J. Exstracellular proteins and other components as obligate intermediates in the induction of a range of acid tolerance and sensitisaition responses ofEscherichiacoli//FEMS Microbiol. Lett.-2002.- V. 166.-PJ 283-288.

124. Rowbury R. J. Humphrey T.J., Goodson M. //J. Appl. Microbiol. 1999. - V 86. - P. 325-330.

125. Rowbury R. J., Goodson M. // Science Progress. 2001. -V. 84. - № 3. -P.203-233.

126. Sanders, J. W. Environmental stress responses in Lactobacillus lactis // FEMS MicrobioL Rev. 1999. - V. 23. - P. 483-501.

127. Savage D.C. Microbial ecology of the gastrointestinal tract // Ann. Rev. Microbiol. 2001. - Vol. 31. - P. 107 - 133.

128. Scott K.G., Bishop D.R., Edwards-Webb. J.D. Nutrient content of liquid milk. Content of Vitamins in pacteurized milk as delived to the home and after Storage in the domastic refrigerater // J. Dairy Res., 1999. Vol. 51. - No. 1. - P. 52 -57.

129. Shackelford, L. A. Effect of feeding fermented milk in the incidence of chemically induced colon tumors in rats // Nutr. Cancer. 2000. - V. 5. - P. 159164.

130. Sjoberg L.B. Infant foods // Bull. Fed. Int. lait. 2001. - No. 147. - P. 6771.

131. Speckmann E.W. Present and future health issues and milk and dairy products // Austral. J. Dairy Technol. 1999. - Vol. 42. - No. 1. - P. 37 - 42.

132. Starke, P. E. Ferric iron and superoxide irons are required for the killing of cultured hepatocytes by hydrogen peroxide// J. Bio. Chem. 1999. - V. 260. - P. 10099-10104.

133. Tannock G.W. Studies of the intestinal microflora: a prerejuisite for the development of probiotics // Ins. D. J., 2001. Vol. 8. - № 5/6. P. 527 - 533.

134. Tereguchi S., Kawashima T., Kuboyama M. Test tube method for counting bifidobacteria in commercial milk products and pharmaceutical bacterial products // J. of Food Hygilnic Society of Japan, 1999. Vol. 23. -No. 1. - P. 39 - 44.

135. Tolker-Nielsen, T. Role of ribosome degradation in the death of heat stressed Salmonella typhimurium // FEMS Microbiol. Lett. 2001. - V. 142. - P. 155-160.

136. Totter, J. R. Spontaneous cancer and its possible relationship to oxygen metabolism: Proc. Natl. Acad. ScL (USA) / Totter, J. R. 1999. - V. 77. - P. 17631767.

137. Vorobjeva L.I. et al. Antimutagenicity of probiotic acid bacteria // Mutat. Res.,1999.- Vol. 251, №6. -P. 233 239.

138. Vorobjeva L.I., Alekseeva M.A., Vorobjeva N.V. Characteristics of newly isolated strains of acid bacteria // Proc 4 th Conf. Of the E.A.C. Udine. Italy, 2000. -P. 20.

139. Vorobjeva, L. I. Antimutagenesity of acid bacteria // Mut. Res. 1999. - V. 251.-P. 233-239.

140. Vorobjeva, L. I. Inhibition of induced mutagenesis in Salmonella typhimurium by the proptein of bacterium freudenreichii subsp. Shermanii I I Anaerobe, -r 2001.-V. 7.-P. 37-44.

141. Vorobjeva, L. Isolation and some properties of the nucleoprotein complex of bacterium freudenreichii subsp. Shermanii // Le Lait. -2001. V. 79. - P. 187-196.

142. Vorobjeva, L. Physiological peculiarities of bacteria present facts and prospective applications // Science Progress. - 2000. - V. 83. - № 3. - P. 277-301.

143. Vorobjeva, L. Protective and reactivate action of bacterial peptidies in organisms inactivaited by different stress factors // Resources, Conservation and Recycling. -1999.-V.18.-P. 151-159.

144. Vorobjeva, Lena I.bacteria . Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, 1999.-280 p.

145. Wang M., Steers E., Norns R. F. Extracellular polysaccharide of mucoid Lactobacillus bifidus // J. Bacterid. -1998. V. 86. - P. 898-903.

146. Wang, Y. M. In : Gleiser C.A., Arnnott M.S., van Eys J. and Wang Y.M. (Eds) Molecular Interrelations of Nutrition and Cancer. Raven Press. New York, 1999.-P. 369-379.

147. Whitaker, R. D. Characterizaition of the heat shock response in Lactococcus lactis subsp. Lactis // Appl. Envirom. Microbiol. 1999. - V. 57. - P. 1408-1412.

148. Ota, Y. Lipase from Candida paralipalilica Anionic surfactant as the essential activator in the systems emulsified by polivinil alcohol: part I. // Agr. Biol. Chem. 2001. - V. 30. - № 4. - P. 351-358.