автореферат диссертации по технологии продовольственных продуктов, 05.18.10, диссертация на тему:Разработка способа получения растворимой и иммобилизованной липазы Rhizopus oryzae 14 и ее характеристика

Государственный комитет Российской Федерации по высшему образованию

Московская Государственная Академия пищевых производств

ОЙ .

на правах рукописи

Волошина Татьяна Юрьевна

УДК.: 663.152.331/043.3

Разработка способа получения растворимой и иммобилизованной липазы Шигорт огугае 14 и её характеристика

Специальность 05.18.10,- Технология витаминных, ферментных« белковых препаратов, чая и табака

Автореферат диссертации па сопсстпяе ученом степени кандидата технических наук

Москва 1995

Работа выполнена в Московской Государственной Академии пищевых производств

Научный руководитель: Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор технических наук профессор КХА.Тырсин

кандидат биологических наук А.Ю.Крнвова

доктор химических наук ^ В.П .Варламов

кандидат технических наук И.В.Штейн

Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии

Защита состоится ¿¿-¿Ы-Р |995г в 10.00 на заседании

Диссертационного совета K.063JH.04. Московской Государственной Академии пищевых производств по адресу: 125080, Москва, А-80, Волоколамское шоссе, д.11. '

Просим Вас принять участие в заседании Диссертационного совета клк прислать отзыв б двух экземплярах, заверенных печатью учреждения, по вышеуказанному адресу.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке МГАПГТ.

Автореферат разослан 1995г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, к .т.к.

О.И.Тихомирова:

SUMMARY

Lipases catalysed hydrolysis of fats and oils are very important in the radical using in various branchs of the national economy.'

However, in spite cf their perspective and great demand of the manufacture, le lipase production in our country is not arranged yet. ' "

In our research we have realised the cultivation of Rhbopus oryzae 14, Iking into consideration the phisiological particularity of microorganisms using ekwasidinamical model.

We have determined kinetic characteristics of the purified lipase. We have alised the immobilization of enzymes on various carrier types with the aim to use them many times.

We have performed reactions of the transesterification and esterification ing immobilized lipases and created the instollation for the continious 'drolysis process of fats.

It has been shown the possibility of the immobilized lipase using in the ester nthesis.

.....Общая характеристика работы

Актуальность темы. Среди множества направлений в бггатехнологии в стоящее время интенсивно развивается производство микробных

рментов, которые исходят широкое применение в различных отраслях

*

омышяенностн, медицине, шучпо-исспедоватеяьской пратппсе.

Использование ферментных препаратов в промышленности позволяет тененфицкровать ряд процессов: увеличить объем производства, высигь качество, расширить ассортимент. Вместе с тем некоторые расля промышленности, в частности, гидролизное производство, ревенная, мкоезя, жироперерабатывающая промышленность штызают недостаток ассортимента фермезггных препаратов. К :лу ферментов, имеющих большое промышленное значение, откосятся пазы, катализ1груюшне гидролитическое растепление ыасст и жиров.

2 ъ

Однако, несмотря на очевидную перспективность и большую потребность промышленности, производство липаз в настоящее время в нашей стране не налажено.

В связи с этим большое значение и актуальность приобретает выбор и селекция липаз, разработка условий их культивирования, изучение закономерностей их продуцирования и наделения ферментов с целые создания технологии, пригодной для промьшшенной реализации.

Последние годы ученых всего мира особенно привлекает уникальная способность липаз осуществлять не только процессы гидролиза, но •• направленный синтез сложных эфиров в шшроводных средах, а такж процесс згерифякации и перезт^нфикащш масел и киров.

Осуществление таких процессов позволит в дальнейшем получил композиции, редко встречающиеся или вообще не встречающиеся I природе, как, например, жиросахара, а также синтезировать ценны« продукты из деиевош сырья.

Таким.образом, проблема изучения характеристик и биохимически свойств препаратов липолитических ферментов (липаз) и разработка научно-обоснованных режимов их применения в промьшшенносп является гктуалышй в теоретическом и практическом отношении.

Цель и направления исследований. Цель исследований заключалась 1 разработке и оптимизации условий культивирования гриба Шазороз отуга 14, позволяющих учесть физиологические особенности микроорганизма,. целью накопления экстрацеллуларных липолитических ферментов разработке схемы получали высохоочшценного фермента, еп исследовании, иммобилизации на различных типах носителей да многократного практического применения в новых технология: переработки жиров.

В задачи исследований входило:

1. Оптимизация температурного режима процесса культивирования гриба ПЬпорих огу:ае 14 с цепью получения препарата липазы.

2. Разработка способов выделения липазы из культур альной жидкости Ктюрю огу:ае 14 и получение ферментных препаратов с различной ст епенью очистки.

3. Изучение структуры и кинетических. характеристик липазы.

4. Иммобилизация липазы химическими и физическими методами на различных носителях.

5. Сравнительное изучение свойств нативной и иммобилизованной липазы.

6. Изучение возможностей применения нативной и иммобилизованной липазы в технологии переработки жиров.

Научная новизна. Разработан технологический режим культивирования ЯНпорш отугае 14 - продуцента липазы, позволяющий увеличить выход целевого продукта на 60-65% и сократить время культивирование с 48 до 44ч.

Разработана схема получения "высокоочищепной липазы, полученной кз ЛЫгорю огу:ае14. На основании данных, полученных при определении молекулярной массы и изучении свойств фермента показано, что липаза кМгорхи; агугае 14 обладает субъеднничной структурой.

Показана перспективность использования физических методов иммобилизац1ш липазы на м!шералыгом носителе по сравнешпо с химическими методами.

Осуществлен процесс зтерификации и переэтерпфикашш шфов с г'спользое.'ч:::»; иммобилизованной лилазы.

Показана возможность синтеза восков - аналогов пчелиного и спермацета с применением липазы.

Прагсппгеааш згсчгагость.

1. В результате лабораторных и опьгтно-промышленаых исследований разработан технологический режим получения липазы при культивировании Ши-орш огу:аг 14.

По разработанному технологическому режиму на Приволжском биохимическом заводе в промышленных условиях., осуществлен процесс культивирования Ютор-м огу:ае 14 с целью накопления липолитических ферментов и получен препарат липазы "Липоризин ГЗХ".

2. Разработана технологическая схема выделения липазы из культуральной жидкости Шгорю огугае 14 с различной степенью очистки, согласно которым в Институте фитопатологии (г.Голицино) в опытно-промышленных условиях получены препараты липазы ПОХ к Г20Х.

3. Создана лабораторная установка для осуществления процесса иммобилизации липазы на минеральный носитель с расчитшшым диаметром пор.

4. Создана и апробирована в лабораторных и полупроизводственных условиях,. пилотная установка для гидролиза.лилидного сырья на основе иммобилизованной липазы. Показана возможность осуществления на этой же установке реагций этерификадии и переэтерификации жиров, а также получения воск02.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на российско-германской научной конференции МГАПП (декабрь 1994г.), на международной научно-технической конференции "Прикладная биотехнология па пороге XX 1-го века" (Москва, март 1995г.), на международной конференции "Научно-технический прогресс в перерабатывающих областях АПК" (Москва, май 1995г.).

Публикация. Результаты исследований наиболее полно отражены в опубликованных 9 печатных работах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзорз литературы, экспериментальной части и приложений.

5абота изложена на 171 странице основного текста, включает 30 таблиц и >9 рисунков. Список литературы включает 123 источника.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Рассмотрены современные направления в исследованиях структуры, >сновных . свойств липолитических ферментов (липаз), а та юте их фактическое применение в некоторых отраслях промышленности.

Обобщены данные научно-технической литературы о структуре истинного центра липаз, механизме их действия и наиболее характерных фоцессах, катализируемых этой группой ферментов. Приведены »временные направления применения липаз в биоорганическом синтезе, гехнологии переработки жиров и других отраслях промышленности.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Работу проводили в лабораторных условиях, кафедры "Технология киров и биоорганического синтеза" Московской Государственной Академии пищевых производств, лаборатории по иммобилизации ферментов АО "Биотехнология", кафедры органической химии и химии ?ефтн Государственной Академии нефти и.газа ии. Губкина, лаборатории гдерных исследований института металлургии, Всесоюзного научно-¡сследовательского института прикладной биохимии, кафедры зиотехнологии Университета Хоеяхайм (Штуптарт, Германия).

Производственные испытания осуществляли в условиях Приволжского Зоохимического завода. Института фитопатологии г. Голицино, И ооновского мыловаренного завода.

2.1. Объекты и методы исследований

В работе использссали штамм мукорового гриба КкЬоргк огугае И, юлученного из коллекции микроорганизмов кафедры "Технолопш жиров

и биоорпаничеосого синтеза". Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов № ВКМП 14-14.

Сырьем для приготовления питательной среды служили соевая мука, кукурузный крахмал, кукурузный экстракт, олеиновая кислота.

Культивирование проводили глубинным способом в ферментерах объёмом 100 и 250 л и в колбах на качалках ( п=200 об/мин) в течение 44 ч при температуре 28°С.

В работе использовались общепринятые и специальные методы исследований. Липазную активность определяли модифицированным методом Ota, Yamada, и рН-статическим методом. Содержание сухих веществ определили рефрактометрическим методом.

Анализ состава жир пых кислот проводили методом газо-жидксслюй хроматографии. Разделение лишвдов осуществляли методом адсорбционной хроматографии в тонком слое и методом высохоэфективной жидкостной хроматографии.

• Определение белка проводили методом Лоури, по Къельдалю, Хартри и Бредфорду.

Высокоочищекнын ферментный препарат получали методом

г

гельфильтрации, ионообменной хроматографии и с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

Планирование экспериментов осуществляли с использованием квазидинамического моделирования управления по температуре. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили общепринятыми методами.

2.2. Результаты исследований и их анализ.

, Для разработки условий культивировали RJdzopus oryzae 14 с целью накопления 'дшюлитичесхих ферментов осуществлена оптимизация

процесса культивирования, учитывающая физиологические особенности микроорганизма.

2.2.1. Оптимизация температурного режима процесса куль'птнровашш гриба ЮгЬорю огугае 14 с целью накопления липолиточеских ферментов.

Нами была изучена чувствительность культуры ЯШориз огу:ае 14 к изменению температуры в процессе культивирования. Из данных литературы известно, что для грибов температурный оптимум для их роста и образования ферментов находится в довольно широком интервале температур от 20 до 45° С. Однако, эти пределы могут быть значительно сужены, если говорить об определенном микроорганизме и каком-либо конкретном ферменте. Так в нашем случае для /Упгорг« отугае 14 диапазон благоприятных температур, обеспечивающий стабильный рост культуры, лежит в пределах от 25 до 35° С. Именно эти температуры были выбраны нами в наших опытах. Результаты этих экспериментов представлены на рис 1.

Из рисунка видно, что рост биомассы и накопление фермента в культур альмой жидкости находится в большой зависимости ' от этого параметра. Наивысшие значения по образованию экзолипазы наблюдались во всех опытах только при температурах около 28°С, понижение температуры - или, особенно, ее повышение приводит к снижению биосшггеткческой способности.

Так, при повышении температуры культивирования на 1°С уровень биосинтеза липазы при 30°С упал на 23%, а повышение температуры среды на 5СС (до 34° С) подавляет ферментообразовапис в 3 раза, при этом обсолютная величина по активности липазы в культуральной хашеости составляет 550-370 ед/мл.

Такая резкая -реакция гриба' на температуру и послужила основанием для проведения специального исследования и оптимизации

1-биомасса, 2-липазная активность

Рис1. Влияние темпфатуры культивирования на рост и накопление биомассы Rhizopus oryzae 14.

процесса по этому параметру на всей протяженности культивирования микроорганизма, т.е; определения опытным путём наиболее благоприятного для микроорганизма температурного профиля в процессе ферментации. ,

Для определения оптимального температурного профиля культивирования, обеспечивающего максимально возможный в наших условиях синтез и секрецию липазы, использовали метод квазидинамического моделирования управления по темпфатуре. Выбор этого метода был связан с тем, что хвазндинаиическая интегральная модель позволяет не только сократить количество опытов в эксперименте по сравнению с полным факторным экспериментом, но и учитывает физиологические особенности микроорганизма.

Вид модели заранее определен и представляет собой линейный функционал, описывающий влияние управляемой пфеменной T(t), в

данном случае это изменение температуры культивирования, на выходной показатель А ( активность липазы ) в" некоторой малой области исходного режима при Т(г)=29°С.

В результате осуществления программы оптимизации получен температурный профиль культивирования продуцента, представленный в табл. I.

Таблица! .Температурный профиль по культивированию Rhizopus отугае 14.

Температурный Длительность Активность Биомасса СВ

профиль,°С роста,ч. - липазы, сухая, г/л биомассы,%

ед/мл

т.-с я

2«

Л 25 -

II П А ««

БрС!М,Ч 44. 2600 32.6 10.6

Таким образом, в заключении из проделанной работы можно сказать, что использование разработанного температурного профиля при культивировании Шгаориз отугае 14 позволяет получить увеличение выхода целевого продукта на 60-65% (таблЛ).

Нами были проведены расчеты коэффициента вариации СУ воспроизводимости результатов выхода культивирования в случае исходного и опытного варианта ведения процесса с измененным температурным профиле*:.

СУ пя =43-5%;. СУ опьгг =25%.

Таблица Z Сопоставление средних величин по липазосбразованию для исходного и оптимизированного температурного режимов культивирования ЛЫ-орш огу:ае 14.

Показатели Исходный режим Оптимизированный режим

48 ч 44 ч

Статистические показатели Средн. знач. Диспф-сия АС Средн., знач. Дисперсия ДС

1650 11236 106 210 2600 24336 156 32<

Активность липазы, ед/мл 1650 2500

Коэф. вариации, % 43.5 25

Такие данные по воспроизводимости опытов позволяют утверждать, что применение температурного профиля при ферментации позволяет повысить стабильность культуры и значительно увеличить выход фермента в культуральную среду.

Немаловажным является и фаю: сокращения, цикла.. развитая продуцента с 48 до 44 часов, в условиях многотоннажного производства это сулит значительную экономию электроэнергии и трудовых затрат.

По разработанному наш режиму на Приволжском биохимическом заводе был успешно осуществлен процесс культивирования /?Аш>риз огугае 14 с целью накопления липолитических ферментов и получен препарат липазы "Липоризнн ГЗХ".

2.22. Получение высокоочшцеппош фермептя.

Очистку липазы осуществляли по схеме, представленной на рис.2.

Исходными препаратами служили препараты "Липоризип ГЗХ и Г1 ОХ". Результаты очистки представлены в таблице 3.

Таблица 3. Показатели очистки препарата "Липоризин ГЗХ"

Очищенный препарат Активность ед/мг белка Степень очистки Выход, %

Исходный препарат 14.8 I 92

Диадгаованный препарат 19.7 1-3 98

Препарат, лереосавдешши ацетоном 72.6 5 83

Фермент после анионообменной хроматографии 150 10 ■ - 75 '

Фермент после гелъфильтрации 193 13 56

Фермент после электрофореза 355 24 15

2.2.3. Определение субъединичной структуры фермента.

Результаты БОБ-электрофореза в полиахриламидном геле показали, что имеется 3 полосы белка, сответствующие молекулярной массе 14.0 кЭ, 19.8 кЭ и 23.5 кО, причем 1-я фракция не обладает липазнон активноспо, а 2-я и 3-я - 106 и 203 ед/мг белка соответственно (табл.4). Результаты МАТГУЕ-электрофореза показали наличие 1-й фракции белка с молекулярной массой 47.3 кО. ,

Это позволяет предположить, что молекула белка содержит 3 :убьедшшцы, которые в отдельности проявляют активность до 60% от збщеи активности и только в совокупности дают активность 100%, что, юзможно, связано с аллостеричесгаш эффектом.

Препарат фермента ГЗХ

| О садок на утилизацию

Растворение с добавлением тритопа-Х-100, центрифугирование, _диализ

| Раствор фермента"

Осаждение и фракционирование ацетоном \

Водно- ацетоновая смесь ра ректификацию ¡Осажденный фермент |

Растворение стригоном-Х-100 и последовательная анионообменная хроматография, катионнообмеиная хроматография, геныЪитлтаимя \

- Очищенный ферментативный препарат

Электрофорез|-

|Элюция | | Растворы индивидуальных белков |

Индивидуальные белки и _субъедишщы

Рис 2. Схема очистки липазы.

Таблица 4. Молекулярная масса и активность фракций.

№ фракции Молекулярная масса, кЭ Активность, ед/мг белка

1 14.0 не активна

2 19.8 106

3 23.5 213

Общая активность, ея/мг белка 355

2.2.4. Изучение кинетических характеристик.

Таблица 5. Кинетические свойства нативной и иммобилизованной липазы.

№ Свойства Нативная липаза Иммобилизованная липаза

1 Оптимум температуры,°С 37 . 45

2 Диапазон термостабильно-сга,°С (г = 1 -2 ч) 25-50 30-65

3 Оптимум рН 7.0 7.0

4 Диапазон рН стабильности, {1= ¡-2ч) 6.0-8.0 5.0-9.0 '

5 Кта (моль/л) 1.91 5.8

6 Период полуинактиваци и при Т=36°,ч 36 82

7 Энергия активации, Дж/моль 12 10.2

8 Энергия инактивации, Дж/моль' 86 224

о

Очищенный нами препарат липазы в нативной и иммобилизованном состоянии был охарактеризован кинетически (табл.5). Для нативной липазы определены константа Михаэлиса, равная 1.91 мол/л, период

полуинастивации - 36 ч, энергия активации - 12 Дж/моль, энергия активации реакции инактивации - 86 Дж/моль, а также для иммобилизованной липазы константа Михаэлиса, равная 5.8 мол/л, период полуинактивации-82ч, энергия активации- 10.2 Дж/моль, энергия активации реакции инактивации - 226 Дзк/моль.

Увеличение энергии активации реакции инактивации и уменьшение энергии активации этого процесса наряду с приведенными выше полупериодами инактивации иммобилизованной липазы при Т=36° С, указывает на стабильность гетерогенных биокатализаторов, и, как следствие этого, на возможность их эффективного практического применения.

Имеются данные по определению константы Михаэлиса для панкреатической липазы, которая была равна Кт=2.18 ымоль/л и константы Михаэлиса для липазы СеоШскит ссвиМит, которая равна Кт = 0.62 ммоль/л.

Т.о. полученная нами Кт для липазы ЯЫгорш отугае 14 близка по своему значению к константе Михаэлиса для истинных липаз. Проведенные кинетические исследования изучаемого фермента позволяют отнести егоклипазам(КФ.3.1.1.3.).

223. Иммобилизация липазы на различных типах носителей.

Существует по меньшей мере четыре области, в которых могут найти применение ферменты, а именно: промышленность, охрана окружающей среды, различные анализы и производство лекарственных препаратов. Их широкому применению препятствует недостаточная стабильность этих биологически активных веществ, а также сложность выделения последних из готовых продуктов. Недостаточная стабильность в ряде случаев может быть с успехом преодолена использованием так называемых иммобилизованных ферментов.

2.2.5.1. Иммобилизация химическими методами

Нами исследован процесс иммобилизации липазы на 13 типах ноаггелей, результата которого представлены в табл.7.

По результатам исследований можно заключить, что наиболее подходящим носителем для нашего типа липазы являются эпоксисилихром," эпоксисиликагель и аминосилохром. При иммобилизации фермента при Т=20"С и рН7.0 использование вышеназванных носителей позволили получить препараты с активностью 26.0, 26.1 и 10.7 ел/ мг носителя , соответственно.

2.23.2. Иммобилизация фтичес:сими методами.

Использование иммобилизованных ферментов особенно эффективней когда носитель инертен и стабилен и легко выводится из реакционной смеси. К таким носителям относятся пористое стекло, алюмосиликат и хромосорб. Их преимущества очевидны : жесткость каркаса, структура которого не зависит от* природы растворителя, устойчивость к микробному заражению, возможность регенерации и стерилизации, простота в работе, и, наконец, дешевизна.

Связывание липолитических ферментов с такими носителями методом физической иммобилизации особенно заманчиво, учитывая сложность строения и специфику активного центра липаз.

Сорбщш лппазы на алюмосиликате.

Иммобилизацию проводили четырьмя способами. Первый способ-иммобилизация путем сорбции на алюмосиликат при различных температурных режимах и значениях рН. Второй способ- иммобилшация аналогично первому способу с последующей фиксацией фермента на алюмосиликате с ислользованнем'Электронного и у-излучения. Третий способ - иммобилизация фермента на алюмосиликат с заданным размером пор последнего. Четвертый способ - иммобилизация липазы

Таблица 7. Показатели иммобилизации липазы химическими методами.

Носитель Группа Белок, мг/г носителя Ими. белок! начальный белок Активность ИММ. лип. сд/мг.нос.

CN.Br-сефароза ^СИ-Вг 2.1 14 1.3

Эпоксисе-фароза —сн-сн ч / о 33.6 67 1.2

Аминосеф-ароза -к=сн-(сн2)Гс.н 2.4 24 2.8

Карбокси-сефароза N=C=N-R 0

Полиакри-ламид Г—сн-сн- 1 [ сонн22 ]п 116 58 14.2

Аминоси-лохром -ссн2)-ын2 21 62 10.7

Эпоксиси-лохром о 4Л 19 26.0

щс- силохром 2 . Н- " 0

Диальдегид силохром -к? 4.4 26 4.2

о- Аминофе- нилсило- хром -р ■ ын 2 23 17.5 ч 1.9

р-Амино- фенилсило- хром '-О». 43 30 1.3

Эпоксисн-пикагепь —(СН )-о-сн-сн 2 з \ / О 0.4 13 26.1

БН- силохром -(СН )-БН ' 23 4.9 37 0

Алюмосиликат Фяз.адсорбция с "пришивкой" гпу-таровым альдегидом 63 18 5.3

на сульфокатиоките типа "Фталосоро", полученном на основе алюмосиликата (табл.б). I

Таблица 6. Показатели процесса иммобилизации физическими методами.

Метод физической иммобилизации Количество связанного белка, мкг/г носителя Активность, ед/мг носителя Кратность использован ия

Сорбция на алюмосиликате 80 50 .3

Сорбция на алюмосиликате с обработкой ' электронами и у-нзлучением 80 47 10

Сорбция на алюмосиликате с заданным диаметром пор, 60-80 А 118 64 53

Сорбция на сульфокатиониге -типа "Фталосорб" 480 • 27 - - з-

Сорбция на "Фгалосорбе" (несульфиро-ванном) 160 63 3

По результатам проделанной работы сделано заключение о том, что наиболее перспективным носителем для липазы является алюмосиликат с

о

диаметром пор 60-80 А, "позволяющий получить иммобилизованный фермент с активностью 64 ея/мг носителя. Кратность использования иммобилизованной таким образом липазы равна 53 раза, что в 21 раз превышает кратность использования липазы, иммобилизованной химическими методами, что, вероятно, связано с конформационными изменениями активного цешра липазы, происходящими при иммобилизации.

18 , -

6. Изучение условий применения липаз в некоторых областях промышленности.

6.1. Реакции гцдролша.

Полученный нами в промышленных условиях препарат липазы из гриба Шг'иориз отуюе 14 наряду с высокой липолкгической активностью 750 ООО ед/г препарата был иммобилизован на . гранулированном алюмосиликате, что расширяло возможности - применения данного фермента. -

Использование в качестве носителя для иммобилизации липазы твердых сорбентов позволяет в перспективе рассчитывать на ведение непрерывного процесса, в частности, гидролиза.

В лабораторных условиях нами получека иммобилизованная липаза на носителе с размером пор 60-80 А, который позволяет удерживать липазу в потоке реакционной смеси в количествах, необходимых для работы реакционной колонны. Непрерывность работы реакционной колонны обеспечивалась с помощью перистальтического насоса.

В течение 4 ч непрерывной работы установки в замкнутом цикле под действием иммобилизованных липаз гидролизуеггся до 30% ТАГ соевого масла (рис_3). Продолжение процесса позволяет гвдролизовать до 70% ТАГ. ; /

Изменение скорости накопления свободных ЖК при гидролизе эмульсии соевого масла в присутствии липазы не косит прямопропорциональной зависимости, как показано на рис. 4. Другими словами, скорость образования свободных жирных кислот со временем проведения процесса падает, что по-видимому связано не только с кинетическими параметрами ферментно-субстратного комплекса, но и с позиционной стереоспецифичностью действия фермента. В проведенных

1 -Изменение количества ТАГ,% 2-Измененне количества ЖК,%

Рис. 3. Изменение состава ТАГ и свободных ЖК в процессе ферментативного гидролиза эмульсии соевого масла.

ранее работах показано, что наибольшее сродство липаза Rhizopus oryzac 14 проявляет к пиролизу эфирных связен, образованных в положениях 1 и 3 глицеринового остатка.

Косвенным подтверждением вышеизложенного положения может служить и то, что максимальная степень гидролиза ТАГ не превышала 70%. Следовательно, для осуществления полного гидролиза необходимо создание ферментативного комплекса липаз с различной специфичностью. Априори возможно предложить использование . ферментативного комплекса, составленного из липазы, полученной путем культивирования микроскопического гриба Rhizopus oryzae 14 и бактериальной липазы Pseudomonas aeruginosa.

О 1 2 3 4 5 6.7 « 9 кч

Рис.4. Изменение скорости накопления свободных ЖК в процессе ферментативного гидролиза ТАГ с использованием липазы.

2-2.6.2. Реакции этерифшсации.

1

Для двух видов гидродаз, таких как протеолитические и липолитические ферменты, показана возможность протекания энзикатичеекой реакции как в сторону гидролиза, так и в сторону синтеза, т.е. реакции зтерификации.

Особый интерес вызывает использование липазы для получения продуктов с заданными свойствами и ацилглицеринсвыи составом, например , заменителя масла какао. Помимо этого метод ферментативной этерифшсации безопасен и экологически чист, не вызывает накопления г жире транс-изомеров.

Нами была предпринята попытка осуществления процесса этерифшсации и переэтерификации растительного затра с использованием липазы, полученной в результате культивирования КШориз огуюг 14.

2.2.63. Получение носков.

Показана возможность синтеза восков - аналогов природных типа пчелиного воска и спермацета. Осуществлен синтез восков в микроводной среде в гексане . В реакции принимали участие жирные кислоты с числом атомов углерода в цепи С)б- С]§ и жирные спирты с числом атомов углерода в цепи С| 2- С]6. Процесс проходил в течении 15-20 ч при Т=30°С с количественным выходом.

2.2.6.4. Реакции переэтерификации.

По данным Б.Уатапака и Т.Тапака наиболее эффективным методом иммобилизации липолитических ферментов с целью осуществления реакции переэтерификации является способ с использованием адсорбции на' алюмосиликате, покрытом тонким слоем глицерина. Предварительная иммобилизация глицерина на алюмосиликате позволяет создать благоприятные условия для связи матрицы с липазой. Учитывая схожесть механизма действия и пр1гроды липазы, описанной этими авторами, и нашего объекта исследования нами была предпринята попытка воспроизвести предлагаемый способ.

Исследованы реакции переэтерификации - ашшглицеринов с использованием липазы, адсорбированной в тонком слое глицерина на алюмосиликате. Способность липазы осуществлять реакцшо переэтерификации была показана с помощью изменения жирнокислотного состава в триппшеринах до и после реакции. В качестве модельной системы использовали следующую смесь: ТАГ, выделенные из рафинированного соевого масла известного жирнокислотного состава и техническую стеариновую кислоту ( по данным ВЖХ образец содержит стеариновой кислоты - 70%, пальмитиновой кислоты - 25%, примеси ненасыщенных жирных кислот - 5%).

Анализ жирнокислотного состава адилглицеринов проводили после

г

их выделения методом -тонкослойной хрохштографии и с помощью газожндкостнон хроматографии.

• На рис. 5.' представлены изменения жирнокислотного состава адилглицеринов до и после ферментативной реакции.

процессе ферментативной реакции происходит количественное изменение состава ЖК в ТАГ, как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения их в реакционной смеси.

Рка5. Изменение содержания жирных кислот до и после ферментативной реакции. ( Разрешающая способность метода 1-3% в зависимости от химической формулы гзгрпой кислоты.)

[5?- до реайщи

- после реакции

Результатами газожидкостной хроматографии было показано увеличение в составе ацилглицеринов содержания стеариновой кислоты (С!8:0) на 9%, пальмитиновой кислоты (С 16:0) на 13%, смеси ненасыщенных жирных кислот на 4.5%. Одновременно снизилось содержание линолевой кислоты (С 18:3) на 10%, олеиновой кислоты (С18:1) на 7%, М1гристиновон кислоты (С 14:0) на 3%.

Таким образом, была продемонстрирована возможность применения иммобилизованных липаз для процесса переэтерификации.

ВЫВОДЫ.

1. Разработаны условия культивирования ЮгЬорт огугае 14, позволяющие учесть физиологические особенности микроорганизма.

I

Опытным путем с использованием квазидинамического управлеши по температуре, определен оптимальный профиль культивирования, обеспечивающий максимально возможное в наших условиях накопление лтаазы. На Приволжском биохимическом заводе использовать разработанного температурного профиля позволило увеличить выход • целевого продукта на 60-65%, сократить время культивирования до 44 ч, а также повысить стабильность культуры.

2. Разработаны технологические режимы производства "Липоризина" различной степени очистки, по которым наработаны опытные партии ферментного препарата.

3. С использованием методов ультрафильтр ации, ионообменной хроматографии, гель-фильтрации, электрофореза разработана схема выделения липазы из культуральнон жидкости Якиорю огугае 14 и получен высокоочищенный ферментный препарат с выходом 15% и удельной аклгвностыо 355 ед/мг белка.

4. Показано,что в составе липазы Шшорш огугае 14 присутствуют три индивидуальных бетка, отличающиеся

молекулярной массой ( 14.0, 19.8 и 23.5 kD ) и ферментативной активностью.

5. Проведена иммобилизация фермента химическими и физическими методами. Показана перспективность использования методов физической иммобилизации на минеральных ноаггеллх для промышленного использования.

6. Проведено сравнительное изучение свойств и кинетических характеристик нативной и иммобилизованной лгшазы. На основании того, что энергия активации реакции пк?ктизацки иммобилизованной липазы в 2.6 раза выше энергии активации реакции инактивации нативной липазы, а период полуинаггсвации иммобилизованной липазы составляет 82 ч, сделано заключение о повышении стабильности липазы после её связывания с носителем и преимуществах практического применения.

7. Создана лабораторная установка на основе липазы,

-

иммобилизованной на алюмосиликате с размером пор 60-80 А для осуществления непрерывного гидролиза растительных жиров.

8. Подтверждена концепция об участии липазы в реакциях . этерификации и перезтерификации жиров in vitro. Установлено, что под действием липазы, выделенной из Rhizopus oryzae 14 происходит изменение жирнокислотного состава ТАГ соевого масла при внесении стеариновой кислоты в сторону увеличения содержания в их составе насыщенных жирных кислот при одновременном снижении уровня ненасыщенных жирных кислот.

Спасок работ по теме диссертации:

1.А.Ю. Кривова, Т.Ю.Волошина, С.В.Мещеряков, Ю.А. Тырсин. Перезтерификация жиров с применением иммобилизованной липазы на минеральном носителе. Известия Вузов, Краснодар, 1993, №1, с.84.

2. Т.Ю .Волошина, Г.Ботпшгер, Ю.А.Тнрсин, А.Ю. Кривова. //

Прикладная биотехнология на пороге XX 1-го века : Научда-

технич. кон<Ь.: Тез. докл.. Москва. 13-15 маша 1995 г.

3. А.Ю. Кривова, Т.Ю.Волошина, С.В.Мещеряков, Ю.А. Тьтрсин. Иммобилизация липазы физическими методами и ее свойства.// Прикладная биохимия и микробиология, 1995г., (в печати).

4. Т.Ю.Волошина, Г.Ботгингер, Л.А.Нахапегтяи, Н.С.Головина, А.Ю.Крнвова ,КХА .Тырсин. Иммобилизация липазы химическими методами и ее свойстваЛ Прикладная биохимия и микробиология, 1995 г., ( в печати).

5. Т.Ю.Волошина, А.Ю. Кривова. Новые аспекты применения препарата "Липоризин ГЗХ"У/ Научно-технический прогресс в перерабатывающих отраслях АПК: Научно-технич. конф.:Тез,док., Москва, 16-18 мая 1995 г.

6. А.Ю. Кривова, Т.Ю.Волошина, С.В.Мещеряков, Ю-А. Тырсин. Некоторые аспекты иммобилизации липолитических ферментов.// 4 Научно-технический прогресс в перерабатывающих отраслях АПК: Научко-технич. конф.:Тез.док., Москва, 16-18 мая 1995 г.

7. А.Ю. КриЕова, Т.Ю.Волошина. Субъедшшчная структура и свойства липазы микробного происхождения. И Научпо-технический

ч

прогресс в перерабатывающих отраслях АПК: Научно-технич. конф.:Тезлок., Москва, 1ё-18 мая 1'995г."

8. Т.Ю.Волошина, А.Ю. Кривова. Влияние ионов металлов на активность нзтивной. и иммобилизованной липазы_//Научно-техшлескнн прогресс в перерабатывающих отраслях АПК: Научно-технич. конф.:Тез.док\, Москва, 16-18 мая 1995 г.

9. Т.Ю.Волошина, А.Ю. Кривова. Оптимизация условий культивирования липаз Мгкориз оту1ае 14. I! Научно-технический прогресс в перерабатывающих отраслях АПК: Научно-технич. конф.:Тездотс., Москва, 16-18 мая 1995 г.