автореферат диссертации по приборостроению, метрологии и информационно-измерительным приборам и системам, 05.11.15, диссертация на тему:Разработка и исследование метода идентификации и количественного определения сложных органических соединений на основе использования комплекса веществ с унифицированными хроматографическими и спектральными параметрами

На правах рукописи

Кулябина Елена Валериевна

РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДА ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЛОЖНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОСНОВЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КОМПЛЕКСА ВЕЩЕСТВ С УНИФИЦИРОВАННЫМИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ И СПЕКТРАЛЬНЫМИ ПАРАМЕТРАМИ

Специальность 05.11.15 - Метрология и метрологическое обеспечение

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

31 ОКТ 2013

Москва-2013

005536319

Работа выполнена в Федеральном Государственном унитарном предприятии «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической службы» (ФГУП «ВНИИМС») Научный руководитель: Рутенберг Ольга Липовна

кандидат химических наук

Научный консультант: Барам Григорий Иосифович

доктор химических наук

Официальные оппоненты: Крылов Анатолий Иванович

доктор химических наук, руководитель лаборатории аналитического контроля объектов окружающей среды ФГУП «ВНИИМ им. Д.И. Менделеева»

Носырев Александр Евгеньевич

кандидат технических наук, доцент кафедры аналитической токсикологии, фармацевтической химии и фармакогнозии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России

Ведущая организация: Федеральное Государственное унитарное предприятие

«Всероссийский научно-исследовательский институт оптико-физических измерений» (ФГУП «ВНИИОФИ»)

Защита диссертации состоится 28 ноября 2013 года в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д308.001.01 в ФГУП «ВНИИМС» по адресу: 119361, г. Москва, ул. Озерная, д. 46

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ВНИИМС». Автореферат разослан « 25 » октября 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д308.001.01 доктор технических наук, профессор

Лысенко Валерий Григорьевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

В настоящее время метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) широко применяется для идентификации и определения содержания сложных органических соединений

- в биотехнологиях для исследования биологических объектов;

- в пищевой промышленности для определения состава и содержания пищевых добавок, консервантов, красителей, вводимых в детское питание, напитки, в молочные продукты;

- в фармацевтике для подтверждения соответствия действительного количества вещества регламентированному в нормативных документах;

- в медицине - для определения в биологических жидкостях допингов (актуально для спортсменов), наркотических веществ, алкоголя (при освидетельствовании водителей);

- в судебно-медицинской экспертизе для идентификации токсинов при определении причины отравления;

- в области охраны окружающей среды для мониторинга содержания загрязняющих веществ в выбросах промышленных предприятий, водоемах, почвах и других объектах, прогнозирования состояния окружающей среды, предотвращения её загрязнения.

Для решения перечисленных задач существует большое количество хроматографиче-ских методик измерений содержания веществ с использованием жидкостных хроматографов с различными детекторами, колонками, сорбентами. Самым распространенным вариантом ВЭЖХ в последние 15-20 лет является обращенно-фазовая жидкостная хроматография с детектированием по поглощению ультрафиолетового излучения.

Аналитические задачи, решаемые методом ВЭЖХ, можно разделить на два типа.

1. Определение одного или нескольких веществ на хроматографе, предварительно отградуированном по стандартным образцам этого вещества (веществ).

2. Определение одного или нескольких веществ из большой группы соединений, любое из которых может присутствовать в пробе, используя для идентификации веществ информацию, собранную и систематизированную в заранее сформированную базу данных (БД).

Решение аналитических задач первого типа - традиционных задач - связано с некоторой громоздкостью хроматографической процедуры. Причина того, что ВЭЖХ-анализ является весьма трудоемким и медленным заключается в том, что практически всегда при переходе от анализа одного вещества к другому хроматограф надо существенно перестраивать: заменять колонку и элюенты, изменять режимы работы насосов и детектора.

Задачи метрологического обеспечения традиционных хроматографических измерений сформулированы и в значительной степени решены. Хроматографы являются индивидуально градуируемыми средствами измерений. Метрологические характеристики для них при выпуске из производства нормируют в соответствии с МИ 137-77 по типовым веществам в регламентированных производителем приборов условиях. В этих же условиях хроматографы поверяют в соответствии с ГОСТ 8.772-2011.

При использовании хроматографов для решения конкретной аналитической задачи метрологические характеристики устанавливают при аттестации методики измерений в соответствии с ГОСТ 8.563-09 в условиях эксплуатации с использованием образцов для градуировки, предусмотренных методикой. Повышение точности таких измерений связано с уменьшением погрешности градуировки, увеличением числа градуировочных растворов и уменьшением временного периода между градуировками. Трудоемкость и стоимость таких анализов при этом ещё больше увеличивается. При отсутствии стандартных образцов или их недоступности выполнять анализ сложных органических веществ традиционным методом ВЭЖХ в большинстве случаев невозможно..

Решение задач второго типа стало возможным в результате интенсивного развития различных разделов ВЭЖХ в конце 70-х годов прошлого столетия, когда возникли предпосылки к проведению анализа больших групп веществ в рамках одной методики, и появилась возможность идентификации веществ с использованием баз данных.

Суть таких методик, называемых скрининговыми, заключается в быстром анализе большого числа веществ и их «просеивании» с целью выявления небольшого набора предварительно известных возможных веществ-кандидатов. Такие методики измерений предполагают отказ от традиционных способов градуировки за счет того, что параметры хроматографа контролируют с использованием смеси веществ - маркеров, выполняющей функции стандартного образца. В этом случае необходимы иные средства и методы метрологического обеспечения, чем для традиционных методик. Это связано с тем, что при определении количественного содержания вещества в пробе по традиционной методике, отсутствует необходимость идентифицировать вещество, т.к. прибор отградуирован по этому веществу. При использовании скрининговых методик анализа с применением баз данных основная задача состоит в достоверной идентификации, которая невозможна без выполнения точных измерений и контроля метрологических характеристик и параметров хроматографа. Это касается всех составляющих хроматографической системы: детектора, насоса, состава подвижной фазы, колонки, инжектора.

Для решения таких задач необходимо усовершенствование существующих методов и разработка новых средств метрологического обеспечения хроматографа, контроля хромато-

4

графических и спектральных параметров, позволяющих сократить трудоемкость и длительность хроматографического процесса; разработка методик оценки достоверности идентификации и количественного определения веществ с использованием хроматографических баз данных.

Цель и основные задачи работы

Целью диссертационной работы является разработка и метрологические исследования метода идентификации и количественного определения органических соединений с применением высокоэффективного жидкостного хроматографа с УФ детектором, разработка процедуры контроля параметров хроматографа с использованием комплекса веществ с унифицированными хроматографическими и спектральными параметрами.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие научные задачи.

1. Выбрать параметры хроматографа, влияющие на показатели точности измерений, на достоверность идентификации и количественное определение органических соединений.

2. Выбрать на основании экспериментальных исследований вещества-маркеры, позволяющие наиболее эффективного контролировать хроматографические и спектральные параметры хроматографа: свободный объем колонки, точность настройки длины волны УФ детектора, отклонение градиента элюирования от заданной формы, линейность детектора, отклонение состава элюента от заданного.

3. Разработать процедуру приготовления и аттестации тестовой смеси на основе выбранных веществ-маркеров.

4. Разработать процедуру контроля хроматографических и спектральных параметров хроматографа с использованием тестовой смеси веществ с унифицированными параметрами.

5. Разработать методику идентификации и количественного определения органических веществ с применением высокоэффективного жидкостного хроматографа с УФ детектором.

6. Разработать процедуру оценки достоверности идентификации.

Методы и средства исследований

Экспериментальные исследования выполнены методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Для приготовления и аттестации тестовой смеси использован гравиметрический метод.

Аттестация методики измерений массовой концентрации УФ-поглощающих веществ выполнена по результатам межлабораторного эксперимента.

Методы математической статистики и теории вероятностей применены для оценки достоверности идентификации.

Научная новизна работы заключается в следующем.

1. Впервые обоснован на основании экспериментальных исследований выбор веществ-маркеров для контроля хроматографических и спектральных параметров хроматографа: свободного объема колонки, точности настройки длины волны УФ детектора, отклонения градиента элюирования от заданной формы, линейности детектора, отклонения состава элюента от заданного.

2. Разработана процедура приготовления и аттестации «тестовой смеси БД-2012» на основе выбранных веществ-маркеров.

3. Разработана процедура контроля хроматографических и спектральных параметров хроматографа с использованием тестовой смеси веществ с унифицированными параметрами.

4. Разработана методика идентификации и количественного определения УФ-поглощающих веществ методом жидкостной хроматографии.

5. Впервые оценена достоверность идентификации веществ, проведенной в соответствии с разработанной процедурой.

Практическая значимость работы

- Разработана методика идентификации и измерения массовой концентрации органических веществ.

- Разработанная методика приготовления и аттестации тестовой смеси веществ с унифицированными хроматографическими и спектральными параметрами для контроля параметров хроматографа, внедрена на предприятиях и в организациях г. Москвы, г. Новосибирска, г. Якутска, что подтверждается соответствующими актами о внедрении.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Выбранные в результате проведенных исследований параметры хроматографа, обеспечивают достоверность идентификации и количественного определения органических соединений.

2. Выбранные на основе экспериментальных исследований вещества-маркеры и разработанная на их основе тестовая смесь позволяют наиболее эффективно контролировать конкретные параметры хроматографа.

3. Разработанная методика идентификации и количественного определения содержания органических веществ дает возможность проводить количественное определение идентифицированных веществ без применения традиционной градуировки.

4. Проведенная оценка достоверности идентификации показывает достаточность значений объема удерживания и спектральных отношений для идентификации веществ.

Реализация и внедрение результатов исследований

Результаты работы получены в рамках:

- НИР «Экспериментальные исследования метода идентификации веществ для создания хроматографических баз данных», 2008 г.;

- НИР «Исследование и анализ измерительных возможностей эталонных (высокоточных) методов измерений массовой (молярной) доли и массовой (молярной) концентрации компонентов в жидких и твердых веществах и материалах, положенных в основу разрабатываемого государственного первичного эталона единиц характеризующих содержание биологически активных компонентов в растворах на основе жидкостной хроматографии», 2010 г. и ряде других работ.

- Подготовлены документы для утверждения ГСО состава тестовой смеси «БД-2012».

Аттестованная тестовая смесь «БД 2012» внедрена в 4-ех метрологических службах

предприятий (НП «Фармгильдия», г. Москва, ЗАО ИХ «ЭкоНова», г. Новосибирск, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологических проблем криолитозоны Сибирского отделения РАН, г. Якутск, ООО «Нордэласт», г. Якутск).

Апробация работы

Основные результаты работы доложены и обсуждены на 3 конференциях и семинарах:

- III Международной научно-практической конференции "Обеспечение единства измерений физико-химических и оптико-физических величин", г. Киев, 2008;

- Международной научно-практической конференции "Метрология-2009", г. Минск,

2009,

- Второй Всероссийской научно-практической конференции «Роль метрологических служб в решении задач метрологического обеспечения», г. Казань, 2013,

- На семинарах «Первого МГМУ им. И.М. Сеченова», ФГУП «ВНИИОФИ», ФГУП «ВНИИМС».

Публикации

По основным результатам выполненных исследований опубликовано 4 статьи, тезисы двух докладов.

Структура и объем диссертации

Диссертация содержит аналитический обзор современного состояния исследуемой проблемы, теоретическую часть, включающую обоснование выбора основных параметров хроматографа, влияющих на идентификацию и количественное определение органических соединений, обоснование на основе теоретических и экспериментальных исследований вы-

7

бора веществ - компонентов тестовой смеси, теоретическую разработку и экспериментальное подтверждение повышения достоверности идентификации веществ.

Общий объем диссертационной работы 140 страниц, в том числе 23 рисунка, 18 таблиц, 1 приложение. Работа состоит из введения, семи глав, заключения, приложения, списка литературы из 97 наименований.

Содержание работы

Во Введении обоснована актуальность работы, сформулирована цель и задачи диссертации, показана научная новизна, сформулированы основные научные положения и результаты, выносимые на защиту.

В первой главе представлен обзор и анализ современного состояния существующих методов идентификации, метрологического обеспечения и количественного определения содержания органических соединений с помощью ВЭЖХ и хроматографических баз данных.

Традиционный метод идентификации и количественного определения веществ, осуществляемый с помощью ВЭЖХ, основан на принципе - каждому анализируемому веществу - своя методика анализа. Применяя такой подход, определяют одно вещество или смесь известных веществ на хроматографе, предварительно отградуированном по стандартным образцам этих веществ. Периодичность градуировки зависит от требований к стабильности параметров хроматографа при проведении конкретного анализа, устанавливают её при разработке и аттестации методики измерений таким образом, чтобы изменения градуировочной характеристики были незначимы на фоне погрешности измерений. Отклонение градуировочной характеристики от установленной проверяют, применяя процедуру контроля её стабильности.

При анализе веществ, стандартные образцы которых дороги, труднодоступны или требуют специальных лицензий для проведения работ (например - стандартные образцы сильнодействующих лекарственных препаратов, токсичных веществ, наркотиков), задача идентификации и количественного определения при помощи традиционного подхода становится практически неосуществимой.

Для идентификации таких веществ существует другой оптимальный для ее решения метод анализа - определение большой группы веществ по одной методике. Этот принцип заключается в анализе одного или нескольких веществ из большой группы соединений, любое из которых может присутствовать в пробе, используя для идентификации веществ информацию, собранную и систематизированную в заранее сформированную базу данных.

Значения метрологических характеристик для большинства приведенных в литературе БД неизвестны. Впервые идентификационные параметры веществ с установленными метрологическими характеристиками внесены в БД ВЭЖХ УФ, разработанной Г.И. Барамом и

8

др. в 2003 г. Метрологические характеристики получены по результатам межлабораторного эксперимента с использованием стандартных образцов состава и аттестованных смесей.

Информация об оценке достоверности идентификации в отношении опубликованных баз данных отсутствует. Исследования показали необходимость оценки достоверности идентификации при выполнении измерений содержания компонентов в сложных смесях.

Результаты аналитического обзора показали, что для успешной идентификации и количественного определения широкого круга сложных органических веществ с применением БД без проведения традиционной градуировки хроматографа по образцам в течение анализа необходимо выбрать параметры хроматографа, изменения которых влияют на достоверность идентификации и количественного определения, разработать процедуру и средства контроля стабильности этих параметров.

Метод идентификации с применением тестовой смеси и БД принципиально впервые был предложен Барамом Г.И. в 2003 г. В данной работе впервые обоснован по результатам экспериментальных исследований выбор веществ-маркеров для контроля метрологических характеристик хроматографа, его хроматографических и спектральных параметров, разработаны процедуры, реализующие метрологическое обеспечение высокоэффективных жидкостных хроматографов, используемых для идентификации и количественного определения органических соединений, впервые оценена достоверность идентификации, проводимой в соответствии с приведенным методом.

Во второй главе диссертационной работы обоснован выбор параметров хроматографа, влияющих на показатели точности измерений, на достоверность идентификации и количественное определение органических веществ.

Основным идентификационным признаком вещества является время или объем удерживания вещества (/я или Значение показателя повторяемости определения значений /я для современных хроматографов составляет (0,02-0,05) мин.

Показатели точности результатов определения времени (объема) удерживания вещества зависят от целого ряда влияющих факторов: свободного объема колонки, типа и партии адсорбента. При замене колонки, которая неизбежна после выработки её ресурса, параметры удерживания изменяются.

При небольшом числе идентифицируемых веществ их определение успешно осуществляется с использованием времен удерживания. Если количество веществ более 25, то необходимо использовать другие идентификационные признаки.

Такими признаками являются нормированные спектры этих веществ, т.е. значения

спектральных отношений при определенных длинах волн, которые приводят в табличном

или векторном виде. Значение спектрального отношения не зависит от содержания вещества,

9

и это обстоятельство позволяет не только идентифицировать вещество по набору его спектральных отношений, но и оценивать с их помощью гомогенность пика. При работе с БД ВЭЖХ-УФ процедура контроля должна быть быстрой и охватывать весь набор параметров, влияющих на показатели точности измерений. Задача усложняется, когда работа с БД ВЭЖХ-УФ допускает использование нескольких близких по характеристикам детекторов], или детекторов одного типа, но произведенных в разные годы

Проведенный анализ процесса хроматографирования вещества от отбора и ввода пробы в хроматограф до детектирования, показал, что наибольшее влияние на достоверность идентификации и показатели точности измерений оказывают:

- качество упаковки колонки, использование адсорбентов из разных партий, влияющие на изменение свободного объема колонки и форму пика (наличие асимметрии пика);

- работа инжектора, который влияет на точность дозирования образца;

- сдвиг настройки длин волн монохроматора УФ детектора;

- нелинейность детектора;

- работа насосов, сбои в которой ведут к установлению градиента формы, отличающейся от заданной, что приводит к сдвигу времени и объема удерживания вещества;

- изменение состава подвижной фазы, и связанное с ним неправильное определение веществ, чувствительных к изменению кислотности элюента (рН);

- работа смесителя, сбои в которой становятся причиной искажения пиков с невозможностью их последующей идентификации и обработки.

Анализ хроматограммы вещества совместно с его спектром дает разностороннюю информацию о функционировании всех узлов хроматографа. Например, по времени и объему удерживания можно судить о свободном объеме колонки, точности формирования градиента задаваемого профиля и функционировании насосов, работе инжектора, скорости потока элюента. По асимметрии пика можно судить о качестве набивки колонки, работе насосов и смесителя. В свою очередь, спектральные характеристики вещества дают информацию о точности настройки длин волн детектора, изменении значения рН элюента.

Таким образом, работу основных частей хроматографа можно оценивать при хрома-тографировании вещества или смеси веществ-маркеров, обладающих свойствами, которые существенно реагируют на изменения параметров хроматографа.

В третьей главе приведены результаты экспериментальных исследований большой группы органических и неорганических веществ (36), выполненных автором, с целью выбора веществ - маркеров контролируемых параметров хроматографа, приведенных в главе 2, и создания на их основе тестовой смеси.

Предварительную идентификацию анализируемых компонентов при определении соединений с помощью БД ВЭЖХ УФ выполняют по объему удерживания.

Использование абсолютного значения объема удерживания вещества предполагает постоянство (с известными допусками) размеров применяемых хроматографических колонок, одной из основных характеристик которых является свободный (мертвый) объем (Га)- Vo ~ часть объема колонки, не занятая сорбентом.

Для выбора вещества-маркера свободного объема колонки исследовали водные растворы солей KBr, KJ, KNCh, KSCN с использованием для определения свободного объёма колонки пикнометрического, весового и хроматографического метода.

а) Пикнометрический метод предполагает поочередное взвешивание колонки, заполненной растворителями с различной плотностью.

б) Весовой метод заключается в определении массы подвижной фазы, находящейся в колонке.

в) Хроматографический метод состоит в измерении объема удерживания «неудержи-ваемых» (несорбирующихся) веществ.

При использовании хроматографического метода измерения V0 учитывали основную особенность хроматографов типа Милихром А-02, заключающуюся в вводе пробы в колонку после остановки потока и сброса давления, и связанную с этим необходимость учета сжимаемости подвижной фазы. Эффект сжимаемости влияет на формирование постоянной объемной скорости элюента и приводит к тому, что вычисляемые по хроматограмме объемы удерживания веществ (VR =F» TR>) оказываются завышенными на объем сжатия подвижной фазы при изменении давления от атмосферного до рабочего, соответствующего заданной скорости потока. Учитывая, что значение оптического поглощения йодид-аниона (рис.1) больше, чем роданид-аниона, что позволяет снизить его содержание в пробе по сравнению с содержанием роданид-аниона в несколько раз, в качестве маркера свободного объема выбран йодид-анион.

Рисунок 1. Нормированные УФ-спектры водных растворов КВг, К1, А7Л93 и К8СЫ.

Показателем качества упаковки колонки является асимметрия пика, ее контроль необходим для точного определения объема удерживания вещества.

Превышение установленного значения асимметрии пика свидетельствует о старении колонки, т.е. об изменении её характеристик. В качестве вещества - маркера асимметрии пика выбрано УФ- поглощающее вещество - орто-нитроанилин.

Для контроля работы инжектора целесообразно использовать вещество-маркер, площадь пика которого вычисляется с минимальной погрешностью. Для выбора вещества-маркера проводили хроматографирование кофеина, мета-нитроанилина, орто-нитроанилина и пирена, измеряли площадь пика каждого вещества и оценивали погрешность измерения площади пика. Хроматографирование проводили в условиях воспроизводимости. В качестве вещества-маркера выбран орто-нитроанилин.

Установку длины волны монохроматора УФ детектора можно контролировать по ряду растворов веществ, спектры которых наиболее чувствительны к изменению настройки монохроматора. Для исследований выбрали дезоксирибоаденозин, дезоксири-богуанозин, дезоксирибоцитозин, тимидин, уридин, урацил, бензол, бифенил, антрацен, пирен, о-нитроанилин, а также полистирол в виде плёнки с толщиной в несколько микрометров. Спектры исследованных веществ-кандидатов в маркеры, получены в условиях повторяемости и внутрилабораторной прецизионности. Примеры спектров показаны на рисунке 2.

Длина волны, им Длина волны, нм

Рисунок 2. Спектры кандидатов в маркеры точности установки длины волны детектора.

Точность установки длины волны оценивали, измеряя оптическую плотность на крутых склонах спектра в двух точках, расположенных справа и слева относительно максимума. В этих точках наблюдается наибольшее отклонение настройки монохроматора от установленного ранее (например, при выпуске хроматографа из производства), что обеспечивает максимальную «чувствительность» оценки. Под «чувствительностью» подразумевали уровень восприимчивости вещества к изменению параметров хроматографа. Чтобы исключить погрешность, связанную с измерением абсолютной оптической плотности, спектр нормировали к одной длине волны. Для количественного определения чувствительности на всех записанных нормированных спектрах выбирали короткие участки с наибольшим наклоном, которые имели вид линейной зависимости вида у=ах+Ь. Эти отрезки прямых параллельно сдвигали влево и вправо так, как это произошло бы при изменении настройки монохроматора на +1 и - 1 нм (у.|=ах+Ь.1 и у+|=ах+Ь+1). Мерой «чувствительности» данного участка спектра к изменению установки длины волны является разность Д=|Ь+1-Ь.1| (рисунок 3).

1.0

< ОА о.а

0.0

4 J б

1 2 ] У

1 у-О.СМвх-10.433

2 у—0.0-««х-10.481 J >-0.04 8х-10.529

4.у.0.1201**2Р.7»в

5.y--0.1202x*29.878 «у- -0.1202х»И>.9»9

2 2!

130 ZU 240

Длима каш, км

241

|«0 210 МО 250 270 200 JI0 330 »50 Длина волны, км

Рисунок 3. Определение изменений спектральных отношений пнрена ("чувствительно-

сти")

Анализ полученных результатов показал, что веществом, наиболее подходящим для контроля установки длины волны является пирен. спектр которого «чувствителен» к изменению установки длины волны. Важным качеством пирена является покрытие широкого диапазона спектра.

Для выбора вещества-маркера линейного диапазона детектора исследовали зависимость оптической плотности растворов кофеина от его массовой концентрации при различных длинах волн.

Кофеин является наиболее подходящим для контроля линейного диапазона УФ детектора веществом-маркером, т.к. даже при небольших концентрациях кофеина в пробе легко зарегистрировать нелинейность детектора (рисунок 4).

Массой» иниаиграим »о»««~а, »ныл

Рисунок 4. Линейный диапазон УФ детектора

Влияние сбоев в работе насосов на выходной сигнал хроматографа исследовали с применением растворов уркдина и пирена.

Рисунок 5 Форма выходного сигнала вещества-маркера при работе насосов в соответствии с заданным алгоритмом формирования подвижной фазы (а) и при сбое (б)

При сбое в работе насосов ("передавливании" растворов) в начальный момент хроматографии в результате сжимаемости жидкости состав подвижной фазы искажается, и вещество-маркер уридин или пирен выходит на хроматограмме, как показано на рисунке 5, в виде двойного пика. В качестве маркера выбран пирен, так как он уже признан выше маркером для контроля установки длины волны.

Выбор и поддержание постоянным значения рН элюента имеет важное значение, так как при изменении рН существенно изменяются времена удерживания и спектральные характеристики ионизованных и неионизированных форм анализируемых кислот и оснований. Для выбора вещества- маркера для контроля рН элюента исследовали вещества, константы ионизации (Ко) которых находятся в интервале (10'2-¡- 10"4) моль/л, т.к. согласно разработанным ранее методикам для хроматографов «Милихром А-02» начальное значение рН составляет 2,3 ([Н+] ~ 5-Ю"3 моль/л). Были исследованы спектральные характеристики мета-нитроанилина, бензойной кислоты, 2-хлор-5-нитробензойной кислоты, лора-нитробензойной кислоты, орто-нитробензойной кислоты, салициловой кислоты (рисунок 6). Кислотность растворов регулировали добавкой ортофосфорной кислоты.

Для выбора вещества-маркера, записывали спектры веществ в растворах с различными значениями рН (1,5; 2,0; 2,5; 3,0 и 3,5). Для дальнейшего количественного определения «чувствительности» спектра вещества к изменению рН спектральные отношения исследуемых веществ вычисляли по формуле (1)

RpHi =Amax ¡/Аиэоб.) (I)

где RpHi- спектральное отношение при i-том значении рН (i=l,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5), Amax i, АИзоб - значения оптической плотности в максимуме и в изобестической точке, е.о.п.

15

200 220 240 260 280 300 320 340 360 Длина волны, нм

2-хлор-5-нитробензойная кислота

А, е.о.п. 2.5

2,0

1.5

1.0

0,5

0.0

рН 3,5

-1-1-1-1-1-1-1-1

200 220 240 260 280 300 320 340 350 Длина волны, нм

л<ета-Нитроанилин

200 220 240 260 280 300 320 340 3 Длина волны,нм

Бензойная кислота

А, е.о.п.

200 220 240 260 260 300 320 340 3 Длина волны, нм

орлзо-Нитробензойная кислота

200 220 240 260 280 300 320 340 360 210 230 250 270 290 310 330 350

Длина волны, нм Длина волны, нм

парл-Нитробензойная кислота Салициловая кислота

Рисунок 6. Спектры исследованных веществ при разных значениях рН элюента. Растворитель: (вода с добавкой НзРО^ацетонитрил) в соотношении [75:25].

«Чувствительность» спектра вещества к изменению рН раствора оценивали, сравнивая полученные спектральные отношения при разных значениях рН. Абсолютное значение

разности спектральных отношений (Дп) рассчитывали по формуле (2):

16

Дп =|К-рНп - КрН(п+1)| , (2)

где -ЯрНп и Крн(п+1) - значения спектральных отношений для двух последующих значений рН, вычисленные по формуле (1), п - порядковый номер.

В результате проведенных исследований в качестве маркера для контроля значения рН подвижной фазы выбран мета-нитроанилин, как вещество, спектральные отношения которого наиболее «чувствительны» к изменению рН.

Работа смесителя контролируется для своевременного обнаружения сбоев в его работе, которые становятся причиной искажения пиков и невозможностью их последующей идентификации и обработки результатов анализа.

Были исследованы 4 вещества: нафталин, бифенил, пирен и антрацен. На рисунке 7 приведены хроматограммы смеси этих веществ.

Время, мин

Рисунок 7. Хроматограммы смеси нафталина, бифенила, пирена и антрацена при использовании активного смесителя с выключенным электромагнитом.

Проведенные эксперименты показали, что в случае сбоя в работе активного смесителя все исследованные вещества выходят в виде пиков искаженной формы, которые не поддаются обработке и идентификации. В качестве маркера работы смесителя выбран пирен, так как он уже признан маркером по проверке настройки детектора и функционирования насосов.

Четвертая глава посвящена разработке и исследованию тестовой смеси веществ - БД-2012, предназначенной для контроля основных параметров хроматографа.

На основе экспериментальных исследований, изложенных в главе 3, выбраны вещества, наиболее чувствительные к минимальным изменениям контролируемых параметров хроматографа: йодид калия, пирен, орто-Нитроанилин, л/еота-Нитроанилин, кофеин.

Смесь на основе выбранных веществ приготовлена гравиметрическим методом и аттестована по процедуре приготовления. Характеристики смеси приведены в таблице 1. Хро-матограмма тестовой смеси показана на рис.8.

Таблица 1

Наименование компонента Массовая концентрация, мг/мл Границы относительной погрешности, % (Р=0,95)

Калия иодид 0,2 ±1,2

Пирен 0,2 ±1,0

Кофеин 2,2 ±0,8

мета-Нитроанилин 0,2 ± 1,2

орто-Нитроанилин 0,2 ±1,1

Растворитель: смесь ацетонитрила с водой с объемной долей ацетонитрила 50 %

Время, мин

Рисунок 8. Хроматограмма тестовой смеси БД-2012

Спектральные и хроматографические параметры, воспроизводимые компонентами смеси БД-2012, и их назначение приведены в таблице 2.

Таблица 2

Вещество Наименование параметра X Контролируемые характеристики хроматографа

Калия иодид Объем удерживания, мкл Свободный объем колонки

Кофеин Спектральное отношение §2б0/5280 Линейный диапазон детектора

.мета-Нитроанилин Спектральное отношение 8260/8230 Качество элюента А

Пирен Спектральное отношение Б220/8210 Точность настройки детекто-

Спектральное отношение 8230/Б210 ра во всем диапазоне длин волн

Спектральное отношение 5240/82|0

Спектральное отношение 5250/82|0

Спектральное отношение 3260/32|0

Спектральное отношение Б280/8210

Спектральное отношение 5300/82Ш

Объем удерживания, мкл Работа смесителя

Отклонение градиента от заданной формы

орто-Нитроанилин Площадь пика, 32]0 Точность дозирования образца

Асимметрия пика, Аю% Нарушения в упаковке колонки

Спектральные характеристики компонентов смеси установлены на основании закона Бугера-Ламберта-Бера; хроматографические (объемы удерживания, высоты, удельные площади и коэффициенты асимметрии пиков) определены на хроматографе «Милихром А-02» экспериментально на колонке заполненной сорбентом С18, типа БД-2003, элюент "А" - раствор перхлората лития 0,2М LiC104-0,005M НСЮ4 Элюент "Б" - 100 % ацетонитрил.

Метрологические характеристики спектральных и хроматографических параметров оценены по результатам межлабораторного эксперимента.

Пятая глава посвящена разработке методики идентификации и количественного определения УФ-поглощающих веществ методом жидкостной хроматографии.

Измерения выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой с УФ-детектированием на 8 длинах волн. Режимные параметры хроматографа устанавливают и контролируют по аттестованной тестовой смеси «БД-2012», заменяя, таким образом, процедуру традиционной градуировки.

Процедура контроля работы хроматографа заключается в воспроизведении на нем хроматографических и спектральных параметров компонентов аттестованной смеси «БД-2012» в установленных для них пределах.

Программа автоматически рассчитывает расхождения между полученными экспериментальными значениями хроматографических и спектральных параметров (X,) и соответствующими параметрами, установленными для аттестованной тестовой смеси «БД-2012»

{Хщ БД-2012)'

Полученные расхождения не должны превышать значение предела воспроизводимости (/?,), установленное для каждого параметра смеси «БД-2012».

^,20,2 (3)

Если условие (3) выполняется, то характеристики хроматографа находятся в заданных пределах, и прибор готов для проведения измерений.

После проведения серии анализов пробы повторяют анализ смеси «БД-2012» . Если для смеси «БД-2012» выполняется условие

¡^-пи-гон -^".ойт-201г| '200 1-^(167-2012 + -^-/ои-гоа)

¿12012. (4)

то переходят к обработке результатов измерений хроматографических и спектральных параметров компонентов анализируемых проб.

Если условие (4) не выполняется, то результаты анализов серии исследуемых образцов считаются непригодными для обработки; требуется настройка режимных параметров хроматографа в соответствии с руководством по эксплуатации хроматографа и методикой измерений.

По хроматограмме вычисляют объем удерживания, спектральные отношения, высоту, площадь и коэффициент асимметрии пика исследуемого вещества. Проводят идентификацию и расчет массовой концентрации, используя аттестованную тестовую смесь «БД 2012». Метрологические характеристики методики установлены по результатам межлабораторного эксперимента и приведены в таблице 3.

Таблица 3

№ п/ п Наименование параметра X Диапазон измерении Показатель точности (границы погрешности измерений) при Р=0,95 Предел повторяемости, (п=2, Р=0,95) Предел воспроизводимости, (т=2, Р=0,95)

относит., 5,% абсолют. Д относит., г, % абсолют. гябс ОТНОСИТ., абсолют. Кабс

1 Массовая концентрация, мг/мл 0,2 ±8 4 8

2 Удельная площадь пика ^ю* е.о.п.-мкл мг/мл 125-1250 ±4 3 5

3 Объем удерживания Ук, мкл 150-4300 ±7 4 8

4 Спектральное отношение Б,/ ^210 0,10-1,00 св. 1,0010,0 ±4 ±0,03 4 0,02 8 0,03

5 Площадь пика 52|0, е.о.п.-мкл 25-250 ±3 3 5

Шестая глава посвящена оценке достоверности идентификации.

Важным аспектом идентификации является выбор меры подобия или различия между измеренным параметром и находящимся в базе данных.

Мерой различия для рассматриваемого случая является сдвиг (невязка) Дх(/,у) между измеренным средним значением характеристики и средним значением этой характеристики в базе данных, т.е.

(5)

Идентификация считается результативной, если разница между измеренным значением характеристики и приведенным в БД будет не больше некоторого критерия (в нашем случае - допуска на это значение), то есть выполняется условие

Д ,(1,])<с1(1,]). (6)

Условие (6) является необходимым, но не достаточным для однозначной идентификации.

При проведении идентификации формулируют статистические гипотезы Я0 (нулевая гипотеза) и Я, (альтернативная гипотеза). Нулевая гипотеза Н0 заключается в утверждении об отсутствии вещества в пробе. Гипотеза Н, - вещество в пробе присутствует.

Необходимо отметить, что приведенные выше понятия и определения известны.

Гипотеза #0 (нулевая гипотеза) заключается в утверждении, что рассматриваемое-вещество в пробе отсутствует. Это означает, что в этом случае должно выполняться неравенство (7)

Лф(0,у)-^>0. (7)

Гипотеза //, (альтернативная гипотеза) предполагает наличие вещества в пробе. Условие присутствия вещества выражается неравенством (8)

Дч>(0,Л-^<0. (8)

Для выяснения, какая из двух гипотез реализуется, предлагается использовать критерий Стьюдента.

Если вычисленное по экспериментальным данным значение квантиля 7(0, у') оказывается меньше табличного р, т.е. выполняется условие (9)

40. Л (9)

то соответствующая гипотеза отвергается, альтернативная - принимается.

Допуск на значения спектральных отношений базового вещества выбирают равным 2с(0) = 0,02. Поскольку теперь сравнение идет по средним значениям спектральных отношений и невязок, то удвоенное значение СКО, определяющее допуск, будет равно

2СТ(0) = <1 = 0,0075 т/ЛГ = 7

В предположении, что реализуется гипотеза Н0 (вещество в пробе отсутствует, и переменная Дс/,(0,_/)-£/ положительна), для коэффициентов Стьюдента получаем /0 (0,1) = 1,9875, /0 (0,2) = 2,6395, /„ (0,3) = 2,6292.

Табличное значение „ = 2,4470.

Сравнивая вычисленные значения коэффициентов Стьюдента с табличными (условие (9)), можно заключить, что для веществ 2 и 3 гипотеза Я0 справедлива (эти вещества в пробе отсутствуют), а для вещества 1 эта гипотеза должна быть отвергнута, т.е. оно может быть идентифицировано как пирен. При этом уровень значимости а (значение ошибки 1го рода, т.е. вероятность ложной идентификации) оказывается равным 0,05, а соответствующая вероятность идентификации р = 0,95.

Аналогичный результат получается и при анализе пробы в рамках гипотезы Я,. Таким образом, первое вещество может и в этом случае идентифицироваться как пирен. Для остальных двух веществ гипотеза Я, должна быть отвергнута, т.е. с вероятностью 0,95 их нельзя отождествлять с пиреном.

В седьмой главе приводится процедура корректировки базы данных.

Процедура позволяет учитывать небольшие флуктуации значений параметров хроматографа, которые возникают вследствие старения колонки, и как следствие, вызывают изменение свободного объема колонки; старения лампы - источника УФ излучения, и связанный с ней сдвиг настройки длин волн монохроматора и т.п. явления. Процедура дает возможность использовать для целей идентификации и количественного определения пригодный хроматограф с несколько изменившимися параметрами без дорогостоящей замены основных узлов. Процедура позволяет корректно сравнивать результаты, полученные на различных приборах одного типа, и переносить БД на эти приборы без потери достоверности идентификации.

Параметр, изменения которого необходимо учитывать, свободный объем колонки, который может измениться вследствие старения колонки.

Многочисленные исследования дают основания утверждать, что каждое вещество будет выходить из колонки со временем удерживания, отличным от указанного в нескорректированной БД. Зависеть это изменение будет не только от значения свободного объема, но и от природы взаимодействия аналита с сильным компонентом подвижной фазы. Поэтому корректировка БД при старении колонки возможна, но требует проведения дополнительных исследований для каждого анализируемого вещества.

К параметрам хроматографов, изменения которых можно учесть более простым способом относится длина оптического пути измерительной ячейки детектора.

Согласно закону Бугера-Ламберта-Бера оптическая плотность поглощающего вещества прямо пропорциональна длине оптического пути, концентрации вещества и его экс-тинкции.

На хроматограмме значению оптической плотности соответствует высота хромато-графического пика. Поэтому по изменению высоты пика можно учесть изменившееся значение длины оптического пути и пересчитать спектральные отношения всех веществ, входящих в БД.

Это дает возможность применять для целей идентификации хроматограф со значениями параметров, отличных от внесенных в базу данных. Если значение спектральных отношений тестового вещества будет выходить за нормированные пределы, алгоритм позволит учесть эти изменения и скорректированную БД использовать для идентификации и количественного определения анализируемого вещества.

Применение данной процедуры дает возможность переноса БД на приборы одного типа без потери достоверности идентификации.

В Заключении приведены основные выводы и результаты работы.

1. В результате проведенных исследований выбраны параметры хроматографа, влияющие на показатели точности измерений, контроль которых обеспечивает достоверность идентификации и количественного определения органических соединений:

- свободный объем и качество упаковки колонки;

- точное дозирование образца инжектором;

- настройка длин волн монохроматора УФ детектора;

- линейность детектора;

- бесперебойная работа насосов;

- состав подвижной фазы;

- бесперебойная работа смесителя.

2. Выбраны вещества, позволяющие наиболее эффективно контролировать конкретные параметры хроматографа: йодид калия, пирен, орто-Нитроанилин, же/яа-Нитроанилин, кофеин.

3. Разработана тестовая смесь на основе веществ-маркеров с унифицированными характеристиками для контроля изменений параметров хроматографа.

4. Разработана методика идентификации и количественного определения содержания органических веществ без применения традиционной градуировки. Методика включает в себя проведение контроля параметров хроматографа по тестовой смеси с последующим анализом вещества, его идентификацией по БД-2012 и количественным определением его содержания.

5. Для достоверной идентификации веществ в рамках БД-2012 достаточно иметь значения объема удерживания анализируемого вещества и его спектральные отношения или их интегральную характеристику.

6. Разработанная процедура введения поправок в БД-2012 позволяет учитывать изменения параметров хроматографа и переносить базу данных на другие приборы без потери достоверности идентификации.

Основные положения диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Г.И.Барам, И.Н.Азарова, ЗАО Эконова, Новосибирск, Е.В.Кулябина, О.Л.Рутенберг, ФГУП "ВНИИМС", Москва, Метрологическое обеспечение баз данных. Исследование и выбор веществ-маркеров для контроля мертвого объема хроматографической колонки. Материалы III Международной научно-практической конференции "Обеспечение единства измерений физико-химических и оптико-физических величин" г. Киев, 2008.

2. Г.И.Барам, И.Н.Азарова, Л.А. Кожанова, ЗАО Эконова, Новосибирск, Е.В.Кулябина, О.Л.Рутенберг, ФГУП "ВНИИМС", Москва, Метрологическое обеспечение баз данных. Исследование и выбор веществ-маркеров для контроля погрешности установки длины волны спектрофотометрического детектора УФ-диапазона хроматографической системы. Материалы Международной научно-практической конференции "Метрология-2009", г. Минск, 2009.

3. Г.И.Барам, И.Н.Азарова, ЗАО Институт хроматографии "ЭкоНова", г.Новосибирск, Е.В.Кулябина, ОЛ.Рутенберг, ФГУП "Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической службы", г. Москва, Метрологическое обеспечение баз данных ВЭЖХ-УФ. Исследование и выбор веществ-маркеров для контроля свободного объема хроматографической колонки, "Заводская лаборатория", № 2,2010 г. (том 76), стр.66-70.

4. Г.И.Барам, И.Н.Азарова, Е.В.Кулябина, ОЛ.Рутенберг, Разработка методов исследования комплекса веществ с унифицированными хроматографическими характеристиками и созда-

24

ние базы данных, необходимых для идентификации сложных органических веществ. Исследование и выбор веществ-маркеров для контроля значения рН элюента, "Законодательная и прикладная метрология" № 1 (107), 2010 г., стр. 13-17.

5. Ю.А. Кудеяров, Е.В. Кулябина, О.Л. Рутенберг, Применение критерия Стьюдента для определения достоверности идентификации веществ при хроматографическом анализе, "Законодательная и прикладная метрология", № 3,2013 г. С. 44-48.

6. Е.В. Кулябина. Тестовая смесь, как средство метрологического обеспечения высокоэффективных жидкостных хроматографов, "Приборы", № ю, 2013, С.52-54.

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УНИТАРНОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

МЕТРОЛОГИЧЕСКОЙ СЛУЖБЫ»

04201365377

На правах рукописи

Кулябина Елена Валериевна Разработка и исследование метода идентификации и количественного определения сложных органических соединений на основе использования комплекса веществ с унифицированными хроматографическими и спектральными параметрами

Специальность 05.11.15 «Метрология и метрологическое обеспечение»

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель кандидат химических наук Рутенберг Ольга Липовна

Научный консультант доктор химических наук Барам Григорий Иосифович

Москва, 2013

Содержание

Введение 4

Глава 1. Литературный обзор и анализ современных методов 11 идентификации, состояния метрологического обеспечения количественного определения содержания сложных органических соединений с помощью ВЭЖХ и хроматографических баз данных

Глава 2. Определение параметров хроматографа, вносящих 32 доминирующие вклады в погрешность определения содержания анализируемого вещества в пробе

Глава 3. Результаты теоретических и экспериментальных исследований 41 веществ - кандидатов в компоненты тестовой смеси

3.1. Выбор вещества-маркера свободного объема 41 хроматографической колонки

3.2. Выбор вещества-маркера качества упаковки колонки 45

3.3. Выбор вещества для контроля инжектора 46

3.4. Выбор вещества-маркера точности установки длин волн УФ 47 детектора

3.5. Выбор маркера линейного диапазона детектора 55

3.6. Выбор вещества-маркера работы насосов 57

3.7. Контроль значения рН элюента и обоснование выбора вещества 59 маркера

3.8. Выбор вещества для контроля работы смесителя 67

Глава 4. Исследование тестовой смеси веществ «БД-2012»

69

Глава 5. Разработка и аттестация методики идентификации и 77 количественного определения УФ поглощающих веществ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

5.1. Методика идентификации и количественного определения УФ 77 поглощающих веществ

5.2. Источники ошибок идентификации и минимизация их влияния 82 путем применения тестовой смеси

Глава 6. Оценка достоверности идентификации 85

6.1. Теоретические аспекты идентификации 85

6.2. Определение вероятностей ошибок первого и второго рода 88

6.3. Определение достоверности идентификации по эксперимен- 97 тальным данным

6.4. Применение критерия Стьюдента для определения 101 статистических оценок интегральной характеристики набора спектральных отношений

Глава 7. Процедура корректировки базы данных 108

Заключение 115

Литература 118

Приложение. Методика приготовления аттестованной смеси «БД- 129 2012» и установления спектральных и хроматографических параметров, воспроизводимых компонентами смеси

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) широко применяется для идентификации и определения содержания сложных органических соединений

- в биотехнологиях для исследования биологических объектов;

- в пищевой промышленности для определения состава и содержания пищевых добавок, консервантов, красителей, вводимых в детское питание, напитки, в молочные продукты;

- в фармацевтике для подтверждения соответствия действительного количества вещества регламентированному в нормативных документах;

- в медицине - для определения в биологических жидкостях допингов (актуально для спортсменов), наркотических веществ, алкоголя (при освидетельствовании водителей);

- в судебно-медицинской экспертизе для идентификации токсинов при определении причины отравления;

- в области охраны окружающей среды для мониторинга содержания загрязняющих веществ в выбросах промышленных предприятий, водоемах, почвах и других объектах, прогнозирования состояния окружающей среды, предотвращения её загрязнения.

Для решения перечисленных задач существует большое количество хроматографических методик измерений содержания веществ с использованием жидкостных хроматографов с различными детекторами, колонками, сорбентами. Самым распространенным вариантом ВЭЖХ в последние 15-20 лет является обращено-фазовая жидкостная хроматография с детектированием по поглощению ультрафиолетового излучения.

Разработкой метрологического обеспечения высокоэффективной жидкостной хроматографии занимались отечественные ученые, такие как

Г.И. Барам, С.С. Барсегян, В.И. Вершинин, И.Г. Зенкевич, Ш.Р. Фаткудинова и др.

Аналитические задачи, решаемые методом ВЭЖХ, можно разделить на два типа.

1. Определение одного или нескольких веществ на хроматографе, предварительно отградуированном по стандартным образцам этого вещества (веществ).

2. Определение одного или нескольких веществ из большой группы соединений, любое из которых может присутствовать в пробе, используя для идентификации веществ информацию, собранную и систематизированную в заранее сформированную базу данных (БД).

Решение аналитических задач первого типа - традиционных задач -связано с некоторой громоздкостью хроматографической процедуры. Причина того, что ВЭЖХ-анализ является весьма трудоемким и медленным заключается в том, что практически всегда при переходе от анализа одного вещества к другому хроматограф надо существенно перестраивать: заменять колонку и элюенты, изменять режимы работы насосов и детектора.

Задачи метрологического обеспечения традиционных хроматографических измерений сформулированы и в значительной степени решены. Хроматографы являются индивидуально градуируемыми средствами измерений. Метрологические характеристики для них при выпуске из производства нормируют в соответствии с МИ 137-77 по типовым веществам в регламентированных производителем приборов условиях. В этих же условиях хроматографы поверяют в соответствии с ГОСТ 8.772-2011.

При использовании хроматографов для решения конкретной аналитической задачи метрологические характеристики устанавливают при аттестации методики измерений в соответствии с ГОСТ 8.563-09 в условиях эксплуатации с использованием образцов для градуировки, предусмотренных методикой. Повышение точности таких измерений связано с уменьшением

погрешности градуировки, увеличением числа градуировочных растворов и уменьшением временного периода между градуировками. Трудоемкость и стоимость таких анализов при этом ещё больше увеличивается. При отсутствии стандартных образцов или их недоступности выполнять анализ сложных органических веществ традиционным методом ВЭЖХ в большинстве случаев невозможно.

Решение задач второго типа стало возможным в результате интенсивного развития различных разделов ВЭЖХ в конце 70-х годов прошлого столетия, когда возникли предпосылки к проведению анализа больших групп веществ в рамках одной методики, и появилась возможность идентификации веществ с использованием баз данных.

Суть таких методик, называемых скрининговыми, заключается в быстром анализе большого числа веществ и их «просеивании» с целью выявления небольшого набора предварительно известных возможных веществ-кандидатов. Такие методики предполагают отказ от традиционных способов градуировки за счет того, что параметры хроматографа контролируют с использованием смеси веществ - маркеров, выполняющей функции стандартного образца. В этом случае необходимы иные средства и методы метрологического обеспечения, чем для традиционных методик. Это связано с тем, что при определении количественного содержания вещества в пробе по традиционной методике, отсутствует необходимость идентифицировать вещество, т.к. прибор отградуирован по этому веществу. При использовании скрининговых методик анализа с применением баз данных основная задача состоит в достоверной идентификации, которая невозможна без контроля параметров хроматографа. Это касается всех составляющих хроматографической системы: детектора, насоса, состава подвижной фазы, колонки, инжектора.

Для решения таких задач необходимо усовершенствование существующих методов и разработка новых средства контроля метрологических характеристик хроматографов, его спектральных

параметров, позволяющих сократить трудоемкость и длительность хроматографического процесса; разработка методик определения достоверности идентификации и количественного определения веществ с использованием хроматографических баз данных.

Цель и основные задачи работы

Целью диссертационной работы является разработка и метрологические исследования метода идентификации и количественного определения органических соединений с применением высокоэффективного жидкостного хроматографа с УФ детектором, разработка процедуры контроля параметров хроматографа с использованием комплекса веществ с унифицированными хроматографическими и спектральными параметрами.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие научные задачи.

1. Выбрать параметры хроматографа, влияющие на достоверность идентификации и количественное определение органических соединений.

2. Выбрать на основании экспериментальных исследований вещества-маркеры, позволяющие наиболее эффективного контролировать хроматографические и спектральные параметры хроматографа: свободный объем колонки, точность настройки длины волны УФ детектора, отклонение градиента элюирования от заданной формы, линейность детектора, отклонение состава элюента от заданного.

3. Разработать процедуру приготовления и аттестации тестовой смеси на основе выбранных веществ-маркеров.

4. Разработать процедуру контроля хроматографических и спектральных параметров хроматографа с использованием тестовой смеси веществ с унифицированными параметрами.

5. Разработать методику идентификации и количественного определения органических веществ с применением высокоэффективного жидкостного хроматографа с УФ детектором.

6. Разработать процедуру оценки достоверности идентификации.

Методы и средства исследований

Экспериментальные исследования выполнены методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Для приготовления и аттестации тестовой смеси использован гравиметрический метод.

Аттестация методики измерений массовой концентрации УФ-поглощающих веществ выполнена по результатам межлабораторного эксперимента.

Методы математической статистики и теории вероятностей применены для оценки достоверности идентификации.

Научная новизна работы заключается в следующем.

1. Впервые обоснован на основании экспериментальных исследований выбор веществ-маркеров для контроля хроматографических и спектральных параметров хроматографа: свободного объема колонки, точности настройки длины волны УФ детектора, отклонения градиента элюирования от заданной формы, линейности детектора, отклонения состава элюента от заданного.

2. Разработана процедура приготовления и аттестации «тестовой смеси БД-2012» на основе выбранных веществ-маркеров.

3. Разработана процедура контроля хроматографических и спектральных параметров хроматографа с использованием тестовой смеси веществ с унифицированными параметрами.

4. Разработана методика идентификации и количественного определения

УФ-поглощающих веществ методом жидкостной хроматографии.

5. Впервые оценена достоверность идентификации веществ, проведенной

в соответствии с разработанной процедурой.

Практическая значимость работы

- Разработана методика идентификации и измерения массовой концентрации органических веществ.

- Разработанная методика приготовления и аттестации тестовой смеси веществ с унифицированными хроматографическими и спектральными параметрами для контроля параметров хроматографа, внедрена на предприятиях и в организациях г. Москвы, г. Новосибирска, г. Якутска, что подтверждается соответствующими актами о внедрении (НП «Фармгильдия», г. Москва, ЗАО ИХ «ЭкоНова», г. Новосибирск, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологических проблем криолитозоны Сибирского отделения РАН, г. Якутск, ООО «Нордэласт», г. Якутск).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Выбранные в результате проведенных исследований параметры хроматографа, обеспечивают достоверность идентификации и количественного определения органических соединений.

2. Выбранные на основе экспериментальных исследований вещества-маркеры и разработанная на их основе тестовая смесь позволяют наиболее эффективно контролировать конкретные параметры хроматографа.

3. Разработанная методика идентификации и количественного определения содержания органических веществ дает возможность проводить количественное определение идентифицированных веществ без применения традиционной градуировки.

4. Проведенная оценка достоверности идентификации показывает достаточность значений объема удерживания и спектральных отношений для идентификации веществ.

Глава 1

Литературный обзор и анализ современного состояния существующих методов идентификации, метрологического обеспечения и количественного определения содержания органических соединений с помощью ВЭЖХ и хроматографических баз данных

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) как метод химического анализа появилась 40 лет назад и быстро заняла в аналитической химии ведущее место [1-3]. Это произошло благодаря нескольким причинам. Метод ВЭЖХ пригоден для определения веществ в очень большом диапазоне молярных масс - от нескольких единиц до десятков миллионов. Почти все разделения можно проводить при температуре, близкой к комнатной, что позволяет применять этот метод для анализа нестабильных при повышенных температурах веществ, в частности физиологических жидкостей, биологически активных веществ и биополимеров. Эффективность разделения ВЭЖХ существенно превосходит эффективность газовой хроматографии, скорость разделения методом ВЭЖХ также достаточно высока (несколько минут для разделения сложной смеси); ВЭЖХ дает возможность выделять в мягких условиях чистые вещества из сложной смеси с возможностью последующего исследования другими физико-химическими методами [4].

Таким образом, ВЭЖХ в отличие от других аналитических методов (газовой хроматографии, капиллярного электрофореза) может применяться для анализа практически всех соединений: летучих и нелетучих, низко- и высокомолекулярных, несущих заряд и незаряженных, термостабильных и термолабильных.

Существует большое количество хроматографических методик измерений содержания веществ с использованием жидкостных хроматографов с различными детекторами, колонками, сорбентами. В

последние 15-20 лет самым распространенным вариантом ВЭЖХ является обращено-фазовая жидкостная хроматография (неподвижная фаза менее полярна, чем подвижная) с детектированием по поглощению ультрафиолетового излучения.

В пользу использования УФ-спектрофотометрического детектирования в комплексе с ВЭЖХ говорит тот факт, что результатом исследований сферы и диапазона применения этого метода анализа появилось практическое доказательство его высокой селективности, вполне сравнимой с селективностью методов ГХ-МС и ЖХ-МС-МС [5-7]. Учитывая тот факт, что хроматографы с УФ-спектрометрическими детекторами существенно проще, надежнее и дешевле хроматографов с МС-детекторами, можно заключить, что применение ВЭЖХ-УФ как направление развития аналитической химии будет только расширяться и совершенствоваться.

Для современных аналитических ВЭЖХ систем характерны следующие параметры [8 - 10]:

• диаметр зерна адсорбента -(3 + 5) мкм;

• основа адсорбента - сферический объемно-пористый силикагель;

• размер пор адсорбента - (10 - 30) нм;

• площадь поверхности адсорбента - (200 400) м2/г;

• прививаемый к силикагелю радикал - октадецил (С 18);

• диаметр хроматографической колонки (3,0 - 4,6) мм;

• длина колонки - (100 150) мм;

• долговечность колонки - до 1000 и более анализов;

• давление - (8 15) МПа;

• тип насоса - двухплунжерный;

• детектор - спектрофотометр (работающий в диапазоне (190 - 360) или (190-800) нм)

Потребительские свойства современной ВЭЖХ можно свести к таким характеристикам как:

• продолжительность анализа - (20 - 40) мин;

• пиковая емкость колонки - (50 100) пиков;

• чувствительность анализа - 1 нг/пик.

Как и другие инструментальные методы химического анализа, ВЭЖХ развивается, и главным направлением развития является движение в сторону повышения эффективности. Термин "высокая эффективность метода" является весьма условным, т.к. четкую границу между "низкой", "высокой" и "сверхвысокой" эффективностью провести трудно, хотя такие типы жидкостной хроматографии существуют с терминологической точки зрения вполне официально. Мерой эффективности можно считать скорость выполнения анализа. Так, при низкой эффективности скорость анализ�