автореферат диссертации по информатике, вычислительной технике и управлению, 05.13.06, диссертация на тему:Автоматизированная биотехническая система оценки безопасности пищевых продуктов и кормов

На правах рукописи

Черемных Елена Григорьевна

АВТОМАТИЗИРОВАННАЯ БИОТЕХНИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ОЦЕНКИ БЕЗОПАСНОСТИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ И КОРМОВ

Специальность 05.13.06 - Автоматизация и управление

технологическими процессами и производствами (пищевой промышленности)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва -2004

Работа выполнена в отделе стабилизирующих дисперсных систем Проблемной научно-исследовательской лаборатории переработки, модификации и применения полимеров для отраслей промышленности, производящих продукты питания (ПНИЛПМ и ГШ) Московского государственного университета прикладной биотехнологии.

Научные руководители:

доктор технических наук В.В. Митин,

засл. деятель науки и техники РФ, доктор химических наук, профессор Э.Г. Розанцев,

Официальные оппоненты: доктор технических наук,

профессор Л.Г. Кошелев, кандидат технических наук A.B. Корчинский

Ведущая организация: Всероссийский научно-

исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Российской академии сельскохозяйственных наук (г. Москва)

Защита диссертации состоится 20041 ъ/1 часов

на заседании диссертационного совета К 212.149.03 при Московском государственном университете прикладной биотехнологии по адресу 109316, Москва, ул.Талалихина, д.ЗЗ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета прикладной биотехнологии.

Автореферат разослан " // " ./¿¿/¿¿Ас/ 200^года.

Ученый секретарь диссертационного сов» к.т.н., доцент

А.С.Потапов

гпн

24И6Ш

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Необходимость новых методов, приборов и автоматизированных систем для оценки безопасности пищевых продуктов, кормов, питьевой воды, пищевых добавок, фармацевтической и косметической продукции совершенно очевидна и обусловлена особенностями жизни современного общества.

Биологические испытания применяются в основном, с использованием в качестве моделей мышей, крыс, кроликов и других дорогих лабораторных животных. Однако, в связи с массовым внедрением новых пищевых продуктов, нетрадиционных технологий и многочисленных пищевых добавок становится актуальной более глубокая и системная биохимическая оценка перечисленных объектов. Такая оценка необходима и в экологии для эффективной диагностики загрязнений внешней среды.

Одним из способов повышения эффективности исследований безопасности и увеличения их информативности может быть применение на первом этапе комплексных испытаний биологических тестов (биотестов) - быстрых и технологичных биологических испытаний на простейших животных.

Цель и задачи исследования

Цель работы заключалась в создании автоматизированной биотехнической системы оценки безопасности (АБСОБ) пищевых продуктов и кормов, предназначенной для повышения уровня безопасности питания человека. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

выявление, изучение с помощью математического моделирования наиболее перспективных тест-организмов и разработка способа культивирования их как «биодатчиков» в АБСОБ; создание способа автоматизированного управления биотестированием;

разработка способов вычисления оценок автоматизированного биологического исследования и поверки системы;

разработка алгоритмов, программы управления аппаратной частью системы и ходом биологического исследования;

проектирование и изготовление аппаратной части АБСОБ.

Научная новизна

1. Разработана автоматизированная биотехническая система, позволяющая оценивать безопасность разнообразных объектов в экспрессном и пролонгированном опыте по реакции одноклеточных животных- инфузорий посредством телеметрического метода.

2. Исследованы способы культивирования инфузорий и разработаны математические модели изменения численности популяций этих организмов при культивировании в лабораторных условиях и при проведении биотестирования с помощью АБСОБ.

3. Разработан способ вычисления оценки безопасности, основанный на теории случайных процессов.

4. Разработаны алгоритмы и компьютерная программа управления и обработки результатов биотестирования.

5. Разработана конструктивная схема аппаратной части автоматизированной биотехнической системы. По материалам разработки получены патент и 2 заявки на получение патентов.

Практическая значимость диссертационной работы заключается в разработке автоматизированной биотехнической системы оценки безопасности пищевых продуктов, кормов и других объектов.

Программно-аппаратный комплекс для фиксирования реакции живых «датчиков» - инфузорий, способы их культивирования и алгоритмы проведения исследований, составляющие систему, позволяют быстро и эффективно получать количественную оценку безопасности исследуемых объектов.

Разработанная система повышает достоверность, снижает трудоемкость и стоимость биологических исследований.

Использование теории случайных процессов для обработки результатов позволяет получать вероятностную оценку, более адекватно отражающую биохимические процессы в живых организмах.

Разработанная система может широко использоваться для мониторинговой оценки безопасности пищевых продуктов, кормов, почвы и воды, а также, для выбора оптимальных вариантов при проектировании новых пищевых технологий и создании новых продуктов питания.

Результаты работы используются в учебных курсах по стандартизации и сертификации МГУПБ.

Вклад автора

Личный вклад диссертанта состоял в разработке автоматизированной биотехнической системы оценки безопасности (АБСОБ), ее программной и аппаратной частей, в разработке способов культивирования тест-организмов - инфузорий, как биологических датчиков в АБСОБ, и способа проведения автоматизированного биологического исследования, а также способа обработки результатов исследования.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Обоснование выбора и способ культивирования инфузорий как тест-объектов в АБСОБ.

2. Математические модели изменения количества инфузорий при культивировании и при проведении токсикологического исследования.

3. Вычисление количественных оценок безопасности и их вероятностей.

4. Алгоритмы и структура программы автоматизированного управления системой.

5. Конструкционная схема АБСОБ.

Апробация работы

Основные положения и результаты работы были обсуждены на международной научно-технической конференции «Ресурсосберегающие технологии пищевых производств» (Санкт-

Петербург, 1998); конференции по птицеводству (Москва, 1999); международной конференции «Пища, экология, человек» (Москва, 1999); 14 межвузовской конференции «Естествознание на рубеже тысячелетий» (Н-Новгород, 2000); отчетной конференции МГУПБ «Живые системы» (Москва, 2003); Всероссийском совещании директоров ветеринарных лабораторий субъектов Российской Федерации (Брянск, 2004г)

За период 1997-2003гг для оценки общей токсичности комбикормов макетные образцы разрабатываемого устройства были установлены и успешно работают на предприятиях:

- ГИЦИАС «Московский», п. Немчиновка, Мос.Обл.;

- ОАО «Лузинский комбикормовый завод», п.Лузино, Омской обл .;

- ФГУ Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория (г.Москва);

Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 14 журнальных статей, 1 патент и 2 заявки.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы и приложения, содержит 154 страницы машинописного текста, 57 рисунков и 4 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность выбранного направления работы, сформулированы цель и задачи исследования, описаны объекты и методы, использованные при разработке системы.

Объектами изучения являются способ автоматизации экспрессного токсикологического исследования (биотестирования) и тест-организмы как первичные биодатчики в АБСОБ.

Выделение культур инфузорий осуществлялось с помощью метода разведения в капле и многократной пересадки. Иден-

тификация инфузорий проведена путем сопоставления с изображениями базы www.taxa.soken Internet.

Методы математического моделирования развития популяций использованы для разработки модели изменения численности инфузорий при культивировании и в опыте.

Методы теории случайных процессов использовались для разработки способа вычисления оценки автоматизированного токсикологического исследования на тест-объектах - инфузориях.

Управляющая программа разработана в объектно-ориентированной среде программирования Delphi 5.

В первой главе рассмотрены существующие варианты биотестов, в том числе автоматизированные, выбран телеметрический метод получения информации о состоянии тест-системы.

Выбраны перспективные биологические датчики для автоматизированной системы, которыми являются одноклеточные животные - инфузории.

Рассмотрены математические модели процессов изменения численности в популяциях инфузорий при культивировании и в токсикологическом опыте.

Сформулированы цели и задачи исследования.

Во второй главе изучены биологические особенности инфузорий как тест-организмов, выбраны два вида - Stylonychia mytilus и Paramecium caudatum, разработаны методы их культивирования, периодического типа. Развитие лабораторных популяций инфузорий этих видов происходит в составе ассоциации микрогрибов, иных простейших и бактерий. При культивировании в закрытой системе характер изменения численности инфузорий S.mytilus существенно отличается от такового у P.caudatum (рис.1). Выявлено, что культивирование S.mytilus осложнено ингибированием продуктами метаболизма этих животных и сопутствующей микрофлоры. Поэтому отбор их в опыт осуществляется в фазе экспоненциального роста. При этом выборка из лабораторной популяции этих ор-

ганизмов имеет наиболее стабильную и высокую чувствительность к возможным токсикантам, т.к. в фазе экспоненциального роста ингибирование не оказывает заметного влияния на биохимические процессы в клетке З.туШив.

В отличие от в.туШив характер изменения численности популяции Р.саиёаШт в существенно меньшей степени осложнен ингибированием. Вероятно, это является следствием сильных симбиотических взаимодействий с сопутствующей микрофлорой. Отбор в опыт Р.саис1ай1т осуществляется в стационарной фазе, чем определяется стабильность чувствительности этого вида инфузорий.

С учетом биологических особенностей выбранных видов инфузорий предложен периодический способ их культивирования с периодом для З.туШш 1-2 суток (рис.2), для Р.саш1а1шп - 14-16 суток (рис.3). Математическое описание изменения численности популяций в течение периода культивирования представляет собой уравнение Ферхпольста (1). Это дифференциальное уравнение с разделяющимися переменными имеет аналитическое решение (2). Коэффициенты уравнения 2 для двух видов инфузорий рассчитаны на основе экспериментальных данных (3,4).

0,51 2 3 4 S 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 сутки

Рис.1. Изменение численности Paramecium caudatum и Stylo-nychia mytilus в объеме среды 50 мл при температуре 26°С

Рис.2. Изменение численности популяции 81у1опусЫа туШиБ при периодическом культивировании, о =5,11

-вычисленные, в соответствии с (3), значения численности

популяции;

ц экспериментальные результаты, полученные путем подсчета инфузорий в 1 мл среды, период культивирования 2 суток

юоо 800 600 400 200 о

кл/мл

А.А

t W ySEB

Замена ЛИ объема среды культивирования,

1 2

14

28

сутки

Рис.3. Изменение численности популяции Paramecium cauda-tum при периодическом культивировании, а = 37,54

- вычисленные, в соответствии с (4), значения численности

популяции;

^ экспериментальные результаты, полученные путем подсчета инфузорий в 1 мл среды, период культивирования 14 суток

dY YoKer'

- =rY(l-Y/K) (1) Y(t) --(2)

dt K-Y0+Y02er'

Y - удельное число клеток, кл/мл; г - удельная максимальная скорость роста культуры, кл/сут; К - предел численности популяции

360 е1" 900 е 1,481

Y(t) --(3) Y(t) =- (4)

17 + е 1,1' 44 + е !'48'

По пяти для S.mytilus и трем для P.caudatum периодам культивирования вычислены средние квадратичные отклонения (о) экспериментальных значений численности от рассчитанных по уравнениям 3 и 4.

Из анализа закономерностей изменения численности двух видов предложено их взаимодополняющее использование в токсикологическом опыте: инфузории Stylonychia mytilus могут применяться для получения быстрых результатов (экспозиция в опыте <=1 час); инфузории Paramecium caudatum - для получения уточняющей оценки с экспозицией 1-30 суток.

В третьей главе выбраны целевые функции автоматизированной биотехнической системы, формализующие оценку безопасности исследуемого продукта (О). Оценка (О) является ступенчатой функцией, значения которой определяются относительным количеством выживших тест-организмов по окончании опыта (5) и вычисленными вероятностями этих значений.

0 = (S,/S0)100% (5)

50 - количество инфузорий в начале опыта;

51 - количество инфузорий по окончании экспозиции в опыте

Способ вычисления вероятностей основан на представлении изменения количества инфузорий в пробе случайным процессом. Емкость с инфузориями и внесенной пробой является системой V, изменение состояний которой - случайный процесс X(t). Процесс X(t) - неоднородный марковский

процесс гибели и размножения с дискретными состояниями и дискретным временем. Для рассматриваемой системы это означает, что система оценивается в соответствии с дискретными уровнями относительного количества инфузорий через дискретный промежуток времени, называемым шагом (к). В общем виде такой процесс описывается ориентированным графом (рис.4).

Рис.4. Общий граф автоматизированного процесса биотестирования

Каждое состояние системы VI соответствует оценке безопасности 01. Для экспрессного режима с экспозицией 2 часа таких состояний и оценок - 4, для длительного с экспозицией 24 часа - 6. Число шагов (к) для экспрессного опыта равно 7, состояний - 4 (VI - У4). В экспрессном режиме VI соответствует уровню оценки 01 >= 80%; У2 - 50% <= 02 < 80%; УЗ - 25% <= ОЗ <50%; У4 - 50% <= 04 < 25%. Математическая модель автоматизированного процесса биотестирования в экспрессном режиме представлена графом на рис.5 и аналитическими выражениями вычисления вероятностей состояний (оценок), полученными на основании рекурсивной формулы 6. Синтез модели процесса в длительном режиме произведен с учетом шести возможных состояний случайного процесса и шести шагов дискретизации экспозиции.

Р ](к) = Е Р; (к-1) Р у (к) (6)

к - номер шага, промежутка времени, за который система V переходит из состояния У( в состояние У|+); Р^) - вероятность состояния Уз на шаге к; Р; (к-1) - вероятность состояния V; на шаге (к-1); Рд(к) - вероятность перехода системы из состояния У) в Уд на шаге к

Рис.5. Граф автоматизированного процесса при экспрессном биотестировании

Вычисления оценок и их вероятностей выполняются программно в соответствии с разработанными алгоритмами автоматизированного управления биотестированием (рис.6, 7).

Суть автоматизированного биологического исследования состоит в многократном подсчете инфузорий в течение экспозиции при воздействии на них пробой исследуемого объекта. Одновременно может быть оценено 5 или 6 проб, каждая проба повторяется 3 раза. Шестнадцать или двадцать емкостей (для разных вариантов аппаратной части АБСОБ), представляющих собой лунки (в разрезе - полый усеченный конус), установлены в круглой планшетке. Одна лунка является контрольной и используется для оценки изменения количества инфузорий в среде культивирования.

По окончании экспозиции в экспрессном режиме (рис.6) автоматически вычисляются оценки безопасности исследуемых объектов и их вероятности в соответствии с моделью экспрессного опыта. Далее, по выбору оператора заканчивается опыт или продолжается как длительное (пролонгированное) исследование (рис.7). После завершения длительного опыта автоматически вычисляются оценки и их вероятности в соответствии с моделью длительного опыта.

Введение мнфчюрий в количестве > - 100 орктншмов на 1 ироб\ ;

Подсчет инфузорий в лунке без пробы

X

Окончание цикла по лункам"7

X

да

Результат подсчета инфузорий в заданных лунках

Окончание цикла (п)?

Г

Вывод промежуточного результата

X

Вычисление оценок беюпасносш (О >) исследованных объектов по результатам экспрессного опыта и вероятностей лих оценок

I Гродолжить?

1ГТХГ"

Сохранение в базе данных и/или в файле Ьхсе!

11ролонгированное исследование

■ (рис.7)

Рис.6. Алгоритм управления экспрессным биотестированием

01счет вданно!о времени ожидания между циклами длительною оныю ¡

Дополнительное введение соответствующих проб

Подсчет ипфучорий во веек пробах

Окончание цикла (п)°

да

Вывод прочежуючного pet) ibiaian ириняше оператором решения о продолжении длительного опыта

__________i______

Окончание дли гслыкн о опыта?

Вычисление оценок безопасное i и (Од) исследованных объектов по результатам длительного опыта и вероятностей этих оценок

Сохранение в баче данных и/или в файле [-.xcel

Рис.7. Алгоритм управления пролонгированным биотестированием (длительный опыт)

В четвертой главе описана разработанная автором программа АиЛоСШага, предназначенная для автоматизированного управления механическими узлами устройства и процессом биотестирования. Она позволяет получать и обрабатывать информацию о состоянии тест-системы.

Структурирующим элементом программы и ее экранного интерфейса является главное меню, опции которого обеспечивают выполнение команд автоматизированного управления устройством, управление исследованием и сервисными функциями. Лунки с инфузориями в течение опыта отображаются на экране в режиме «живого видео».

В основе способа выявления реакции инфузорий на исследуемый продукт лежит сравнение количества подвижных тест-организмов через определенные промежутки времени. Подсчет инфузорий в 16 лунках осуществляется за 12 минут.

При обработке изображения лунки с инфузориями идентификационными признаками живых организмов являются размеры и самостоятельное перемещение со скоростью 0,01 -2мм/сек.

Программный подсчет подвижных организмов осуществляется с помощью вычитания 2х последовательных кадров. Этот способ используется в связи с малыми размерами идентифицируемого объекта (0,06мм2) по сравнению с общей площадью лунки (18,84мм2).

Согласно алгоритмам (рис.6, 7) программа AutoCiliata производит многократный циклический подсчет инфузорий во всех заданных лунках. Через каждые п подсчетов процесс прерывается на 3 минуты для отражения на экране промежуточных результатов в виде графиков изменения количества инфузорий во всех заданных лунках.

По окончании экспозиции результаты опыта можно просмотреть в форме, аналогичной промежуточным результатам, или в обобщенной форме, где представлено заключение о безопасности исследуемых объектов. Вся информация, полученная в течение экспрессного опыта, сохраняется в оперативной памяти до начала следующего опыта. По окончании опыта результаты можно сохранить в базе данных (рис.8), состоящей из 4х таблиц Paradox.

№ № пробы № опыта Наимен Результ. Дата_нач Дата_оконч Файл_Ехсе1

Таблица 2. Param.db. Дополнительные параметры опыта

№ № пробы № опыта Экспоз 1 Экспоз2 Период № планшетки №№ лунок

Таблица 3. Statist.db. Значения вероятностей полученных оценок

№ № пробы Р1 Р2 Р10

Таблица 4. БаЫЬ. Все результаты подсчета в лунках в течение опыта

№ Хаопыт а №подс чета Лунка! | ; Лунка : 20

1 » 1 »

Рис.8. Структура таблиц базы данных

Программа AutoCiliata позволяет сохранять все входные описания исследуемых объектов, условия опытов, полученные результаты и их вероятности. Кроме того, есть возможность сохранять все результаты подсчетов в файле формата Excel. Подключение Excel осуществляется с помощью создания объекта OLE автоматизации.

Алгоритм поверки системы основан на аппроксимации результата подсчетов (рис.9, 10) с помощью линейной функции, коэффициенты которой вычисляются по методу наименьших квадратов. Критерием для оценки точности настройки программных и аппаратных средств выбрана остаточная дисперсия (7).

52оет=(1/п-2)0:(¥1-у02

(7)

- значения, полученные в результате 1 -ого подсчета; у1 - величина, рассчитанная по линейному уравнению аппроксимации

Рис.9. 20-кратный подсчет инфузорий со временем задержки перед подсчетом 5 секунд, в соответствии с (7) з ост 42,3

1 во О о. 55 «Р О 50

О Л «> ^ "в" 35

X 30

= -0,0173х + 47,332

> , ■ щ *

1 2 3 4 5 в 7 в » 10 11 12 13 14 15 19 17 18 19 20

№ подсчета

Рис.10. 20-кратный подсчет инфузорий со временем задержки перед подсчетом 9 секунд, в соответствии с (7)

с2 =57

э ост '

В пятой главе описана разработанная автором аппаратная часть автоматизированной биотехнической системы. На рис.11 показаны два варианта исполнения аппаратной части системы. Первый вариант состоит из одного электромеханического узла перемещения планшетки и узла видеокамеры. Функционально более полный вариант 2 состоит из узла видеокамеры, электронного узла согласования, 3-х электромеханических узлов

вращательного и вращательно-поступательного движений, осуществляемых с помощью шаговых двигателей (ШД). Это узлы: перемещения планшетки, перемещения проб (барабана), перемещения штока пресса для дозированного внесения проб и инфузорий.

Контроль состояния тест-объектов осуществляется телеметрическим способом. Этот способ позволяет получить динамическую зависимость изменения количества инфузорий в течение любого заданного промежутка времени. В качестве приемника оптической информации и преобразования ее в видеосигнал используется ч/б видеокамера с объективом. Аналоговый выходной сигнал камеры поступает на вход интерфейсного устройства видеоввода (Р1уу1с1ео) в компьютер.

Для организации обратной связи между аналитическим блоком и компьютером каждый механический узел имеет по три оптоэлектронных фиксатора (оптопары) положения ротора ШД. Их назначение состоит в фиксировании начального положения и цифровом регулировании длины импульса. Такое регулирование необходимо для оптимальной настройки скорости вращения и исключения явления реверсного перемещения при прямой последовательности включения обмоток шагового двигателя.

Программное управление шаговыми двигателями осуществляется через параллельный порт компьютера ЬРТ1 и электронный блок согласования, назначение которого состоит в формировании электрических сигналов управления шаговыми двигателями и сигналов обратной связи - от оптопар к компьютеру.

Рис.11. Аппаратная часть АБСОБ 1 - видеокамера; 2 - пресс для нажатия на шток шприца с пробой; 3 - барабан, предназначенный для установки 8 шприцов с пробами исследуемых объектов; 4 - планшетка с 20 или 16 лунками; 5 - корпус, в котором установлены шаговые двигатели и электронный блок согласования с параллельным портом компьютера

Структурная схема АБСОБ (вариант 2) представлена на рис.12. Она состоит из Зх замкнутых контуров управления шаговыми двигателями и одного разомкнутого контура получения информации о состоянии тест-объектов. Каждый замкнутый контур предназначен для адаптивного управления шаговым двигателем.

д * в

'У »я « КЕМ*

Основная логика программы, осуществляющая согласованное перемещение шаговых двигателей в соответствии с командами оператора и алгоритмами автоматизированного управления биотестированием

1 —

Взаимодействие с оператором в интерактивном режиме

»

Рис.12 . Структурная схема АБСОБ И1-ИЗ - исполнительные электромеханические узлы (шаговые двигатели); Д11-Д13 - оптопары (оптоэлектронные датчики положения) узла планшетки; Д21-Д23 - оптопары узла бара- % бана; Д31-Д33 - оптопары узла пресса; У1-УЗ - подпрограммы управления тремя шаговыми двигателями; Пг ГЧз - подпрограммы выработки временных параметров для оптимиза- ф ции работы шаговых двигателей (программные генераторы временных интервалов); Д - электронно-оптический датчик (видеокамера); В - устройство видеоввода изображения (плата Р1уУ1<!ео)

выводы

Разработана автоматизированная биотехническая система оценки безопасности пищевых продуктов, кормов и иных объектов внешней среды по реакции эукариотических одноклеточных животных - инфузорий.

Предложены математические модели измерения численности популяций выбранных видов - Stylonychia mytilus, Paramecium caudatum, и технологии их культивирования.

Vv

Создан способ автоматизированного биотестирования, позволяющий осуществлять многократный подсчет инфузорий в течение опыта и продолжать исследование для уточнения результатов. Предложена математическая модель автоматизированного биотестирования на основе неоднородного марковского процесса с дискретным временем и дискретными состояниями.

Разработаны алгоритмы и программа управления исполнительными механизмами и процессом исследования, а также алгоритм поверки системы, основанный на вычислении остаточной дисперсии.

Выбраны и апробированы технические решения функциональных узлов и элементов конструкции. Опытные образцы устройства установлены на ряде сельскохозяйственных предприятий, на которых используются для исследования безопасности комбикормов и сырья для их изготовления.

Результаты работы использованы в учебном процессе МГУПБ при подготовке дипломных работ.

Список публикаций

1. Гроздов А.О., Цвылев О.П., Иванова Е.Г. (Черемных Е.Г.) Автобиоанализатор - прибор для определения токсичности// Комбикормовая промышленность, 1996, №5, с. 16-17

2. Иванов A.C., Иванова Е.Г.(Черемных Е.Г.)Устройство для оценки качества продуктов живой и неживой природы// Патент РФ №2122025, БИ №3 20.11.98.

3. Гроздов А.О., Цвылев О.П., Иванова Е.Г., (Черемных Е.Г.) Сазонова JI.B. Автобиоанализатор// Наука в России, 1998, №1, с.34-37

4. Иванова Е.Г.(Черемных Е.Г.), Кантере В.М., Мухамеджа-нова Т.Г. Экспрессная оценка безвредности продуктов питания// Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья, 1998, №12, с.24-25

5. Иванова Е.Г.(Черемных Е.Г.), Васильева A.B., Беленикина O.A., Кантере В.М., Мухамеджанова Т.Г. Биотест токсичности кормов// Птицеводство, 1999, №5, с.42-43

6. Ерастов Г.М., Терентьев В.А., Иванова Е.Г,(Черемных Е.Г.) Токсичность; методы выявления и устранения// Комбикормовая промышленность 1999г, №6 с.27-29

7. Иванова Е.Г. (Черемных Е.Г.), Васильева A.B., Беленикина O.A. Способ и устройство для культивирования тест-организмов применяемых при оценке качества продуктов живой и неживой природы// Заявка РФ №2000101016, БИПМ №3 2002.

8. Иванова Е.Г.(Черемных Е.Г.), Гроздов А.О. Способ оценки качества продуктов живой и неживой природы// Заявка РФ №2000102603, БИПМ №34 от 2001.

9. Кузнецова J1.C., Снежко А.Г., Ходоровская О.И., Иванова Е.Г. (Черемных Е.Г.), Васильева A.B., Беленикина O.A. Биотестирование как скрининговый метод определения токсичности пищевых ингредиентов. // М., Мясная индустрия, №1, 2000, с. 31-33.

10. Розанцев Э.Г., Черемных Е.Г., Кузнецова JI.C. Управляемая биоприборная модель для разработки методик оценки качества различных объектов// Экология и промышленность России. №6, 2001.

И. Розанцев Э.Г., Черемных Е.Г., Кузнецова JI.C. Автоматизированный биотест для токсикантов пищевых продуктов// Мясная индустрия, №6,2001, с.37-39

12. Розанцев Э.Г., Черемных Е.Г., Кузнецова Л.С. Биологическая оценка сложных природных и искусственных объектов// Сумма технологий, №2, 2001, с.23-25

13. Черемных Е.Г. Возможности автоматического биотестирования// Комбикорма, №1, 2002, с.59-60

14. Розанцев Э.Г., Черемных Е.Г., Пуховский A.B. Биотестирование в оценке безопасности// Партнеры и конкуренты, 2003, №7, с.20-22

15. Розанцев Э.Г., Черемных Е.Г. Биотестирование или биологическая оценка безопасности в настоящем и будущем// Экология и промышленность России, 2003, октябрь, с.44-46

16. Черемных Е.Г. Применение в токсикологических исследованиях автоматического прибора биотестирования// Партнеры и конкуренты, №11,2003г, с. 13-15

17. Черемных Е.Г. Прибор для биотестирования - БиоЛаТ // Экология и промышленность России, март, 2004, с.21-23

г

Формат 60x90/16 Печать офсетная

Бум. тип. Тираж 100 экз. Зак. № 226

ООО «Полиграфсервис» 109316 Москва, ул. Талалихина, 26

РНБ Русский фонд

2006-4

3224

Введение

1. Актуальность разработки и совершенствования биологиче- 4 ской оценки безопасности пищевых продуктов и кормов

2. Цель и задачи исследования и разработки

3. Объекты и методы исследования

Глава I. Литературный обзор современных методов биологической оценки

1. Существующие биотесты

2. Биотестирование на инфузориях

2.1. Общие закономерности

2.2. Экология инфузорий

2.3. Адаптация простейших к изменению различных факторов внешней среды

2.4. Практические методики биологической оценки на 21 инфузориях

2.5. Математические модели изменения численности по- 24 пуляций инфузорий

3. Приборы для биотестирования

Глава II. Изучение инфузорий как тест-организмов автоматизированной системы биотестирования и разработка методов их культивирования

1. Функции простейших как тест-объектов

2. Выбор и идентификация видов инфузорий

3. Методы выделения из природной среды и культивирования 39 монокультур инфузорий

4. Математические модели изменения численности популяций Stylonychia mytilus и Paramecium caudatum

Глава III. Математическая модель и алгоритмы автоматизированного 45 управления биотестированием

1. Целевая функция

2. Математическая модель опыта

3. Алгоритмы автоматизированного управления биологического испытания на инфузориях

4. Оценка точности подсчета

Глава IV. Программа автоматизации биотестирования AutoCiliata

1. Назначение, задачи и основные принципы

2. Экранный интерфейс и структура программы AutoCiliata

3. Автоматизация исследований

3.1. Экспрессные режимы

3.2. Длительный режим 77 4. Руководство оператора уд

Глава V. Разработка аппаратной части автоматизированной системы биотестирования

1. Этапы проектирования

2. Разработка конструкции аппаратной части биотехнической системы

3. Компоновка элементов конструкции корпуса

4. Реализация способа контроля тест-объектов

5. Создание условий контрастного изображения

6. Выбор параметров планшетки

7. Узлы перемещения

8. Электронное согласующее устройство

9. Структурная схема АБСОБ

Выводы

1. Актуальность разработки и совершенствования биологической оценки безопасности пищевых продуктов и кормов

Изменения биосферы, обусловленные широкомасштабным промышленным и сельскохозяйственным производством и иной деятельностью человека, оказывают негативные воздействия на все живые организмы, в том числе и на самого человека. Эти воздействия осуществляются через объекты внешней среды - воду, воздух и пищу, являющуюся «.основным биохимическим мостиком между средой и организмом человека»*. Загрязнение пищевых и кормовых продуктов разнообразными ксенобиотиками зависит от содержания их во внешней среде, от нарушения технологии производства и от множества разнообразных факторов, которые заранее учесть практически невозможно.

Во всем мире ежегодно производится около 300 млн.т. химических продуктов из них около 20 млн.т. поступает в природную среду, а из нее в пищевые цепи [1]. Природа на протяжении многих десятилетий подвергается массированному воздействию факторов антропогенного происхождения и сейчас в биосфере циркулирует около 50-60 тыс. видов ксенобиотиков [2], которые, встраиваясь в естественный круговорот веществ, претерпевают различного рода изменения: окисляются, гидроксилируются, восстанавливаются, гидролизуются и изомеризуются. Достаточно часто масштабы угрозы для живых организмов нельзя предвидеть, а отдаленные последствия могут быть гораздо опаснее, чем воздействие изначально используемых химических факторов[3]. Так при трансформации искусственных веществ в почвенных и водных организмах - бактериях и простейших, в результате разнообразных биохимических реакций могут возникать вещества еще более токсичные, чем до биодеградации, например, ДЦТ и ДДЕ, ртуть и и метилртуть [4] и т.д.

Э.Г. Розанцев Курс лекций по биохимии МГУ lib

Весьма вероятно, что ксенобиотики и разнообразные продукты их трансформации могут присутствовать в пище. Кроме того, продукты питания содержат специальные добавки [5], к которым относятся:

1) пищевые красители и цветообразователи (около 60 видов);

2) ароматизаторы (около 20 видов);

3)регуляторы кислотности (около 30 видов);

4) эмульгаторы;

5) стабилизаторы;

6) консерванты (более 40 видов);

7) антиоксиданты (более 20 видов).

Всего в мировой пищевой промышленности используется более 2000 пищевых добавок, из которых только 600 находится в списке безопасных веществ [6].

В продуктах животноводства могут присутствовать остаточные количества ветеринарных препаратов, среди которых антибиотики и гормоны встречаются достаточно часто. Таким образом, при употреблении продукта на организм человека воздействует практически непрогнозируемая совокупность разнообразных веществ, находящихся в сложных и разнообразных связях друг с другом.

Традиционный способ контроля безопасности пищи состоит в определении концентраций тех или иных индивидуальных токсикантов с помощью физико-химических методов. Проблема определения воздействия всего пищевого продукта на организм может быть разрешена с помощью комплексного исследования безопасности пищи, первым этапом которого должны быть методы биологической оценки [7,8]. Научная мысль неоднократно обращалась к теме использования разнообразных живых организмов для получения интегральной оценки качества различных объектов. Еще в 1931 году Чижевский A.JI. писал: «.живая материя, те или иные клеточные образования являются чувствительнейшим реактивом по отношению к чрезвычайно малым дозам вещества и обнаруживают качественно и количественно различную возбудимость к различным веществам, в зависимости от их химического состава и физического состояния» [9].

Применительно к области контроля безопасности такие биологические исследования представляют собой способы определения степени токсичности продукта по реакции живых организмов - моделей, тест-организмов, или тест-объектов [10]. Определение степени безопасности объектов для получения качественной оценки с помощью живых организмов называют биотестированием или биотоксикологической оценкой.

В качестве организмов-моделей могут использоваться разнообразные живые системы. До недавнего времени это были в основном высшие животные: мыши, кролики и т.д. [11]. Токсикологические методы с применением таких моделей имеют длинную историю применения, они хорошо проработаны, но дороги, длительны и трудоемки. При глубоких исследованиях свойств новых продуктов или новых добавок в составе продукта такие методы необходимы, но в настоящее время существует возможность существенно уменьшить затраты на токсикологические испытания, используя на первом этапе комплексного исследования биотестирование на простейших организмах [12]. В связи с выше перечисленными факторами становятся весьма актуальными методы, сочетающие возможности биологических моделей и аналитических приборов. Обычно это методы, ранее апробированные в экологических исследованиях или в медицинской токсикологии, в них в качестве тест-организмов применяются культуры клеток тканей человека и животных и низшие организмы. Такие методы называются альтернативными [13], и это определение предполагает некоторое противопоставление традиционным токсикологическим подходам, использующим высших животных, поэтому, на наш взгляд, более корректным является обобщающий термин: биотестирование in vitro [14].

Традиционные исследования in vitro (без использования автоматизации) сопряжены с высокой трудоемкостью и необходимостью высокой квалификации исследователя. Поэтому, для повышения технологичности и расширения применения биотестирования, разработка автоматизированных систем с применением в качестве тест-организмов низших животных не только оправдана, но и совершенно необходима. Существующие примеры автоматизации проведения эксперимента с помощью биотестирования доказывают возможность сочетания современного технического оборудования с биологическими объектами, используемыми в качестве датчиков. Приборы для биологических исследований формализуют процесс проведения анализа. В качестве метода, обеспечивающего интерфейс между тест-организмом и технической подсистемой, в этих приборах используется фотометрия. Современные технические возможности позволяют создавать устройства на основе телеметрического способа, который расширяет возможности приборов для биотестирования, приближая их к полным автоматам.

Разработка таких устройств требует изучения биологических особенностей применяемых живых моделей для последующего синтеза эффективной технической системы их контроля.

Результаты работы использованы в учебном процессе МГУПБ при подготовке дипломных работ.

1. Корте Ф., Бахадир М., Клайн В., Лай Я.П., Палар Г., Шойнер И. Экологическая химия // М., Мир, 1997, 396с.

2. Тинсли И. Поведение химических загрязнителей в окружающей среде // М., Мир, 1982, 281с.

3. Одум Ю. Основы экологии // М., Мир, 1986, 376с.

4. Донченко Л.В., Надыкта В.Д. Безопасность пищевой продукции // М., Пище-промиздат, 2001, 528с.

5. Булдаков А.С. Пищевые добавки. Справочник // СПб., «Ut»,1996, 240с.

6. Нечаев А.П., Кочеткова А.А., Зайцев А.Н. Пищевые добавки // М., Колос, 2001,256с.

7. Тихонов М.Н., Довгуша В.В., Кудрин И.Д. О необходимости разработки новой концепции в изучении факторов обитаемости // Гигиена и санитария, 1997, №4, с.34-37.

8. Чижевский А.Л. Космический импульс жизни: Земля в объятиях солнца. Ге-лиотараксия // М., Мысль, 1995, 49с.

9. Айвазова Л.Е., Гроздов А.О., Соколова С.А., Новосадова Т.Г., Трофимова М.Г. Метод биотестирования водной среды с использованием инфузорий // Методы биотестирования вод. Черноголовка 1988, с.37-42.

10. Справочник. Лабораторные исследования в ветеринарии. Под ред. Антонова Б.И. // М., ВО «Агропромиздат», 1991, 320с.

11. Беленький Н.Г. Проблема биологической оценки сырья и пищевых продуктов//М., 1976, 86с.

12. Лукьянов А.С., Лукьянова Л.Л., Чернавская Н.М., Гилязов С.Ф. Биоэтика. Альтернативы экспериментам на животных // М., Из-во МГУ, 1996, 256с.

13. Protist Data Base http://protist.i.hosei.ac.jp

14. Резниченко Г.Ю. Лекции по математическим моделям в биологии. Часть 1 // Москва-Ижевск, НИЦ «Регулярная и хаотическая динамика», 2002, 232 с.

15. Вентцель Е.С. Теория вероятностей // М., Высшая школа, 2001, 575с.

16. Шторм Р. Теория вероятностей. Математическая статистика. Статистический контроль качества // М., Мир, 1970, с.204-214

17. Архангельский А.Я. Delphi 6. Справочное пособие // М., ЗАО «ИздательствоБИНОМ», 2001, 1024с.

18. Сван Т. Delphi 4. Библия разработчика // Киев-СПб., Диалектика, 1998, 672с.

19. Пачеко К., Тейксейра С. Delphi 5. Руководство разработчика // М.-СПб.-Киев, Изд. дом «Вильяме», 2000, 832с.

20. Калверт Ч. Delphi 2. Энциклопедия пользователя // Киев, НИПФ «Диа-СофтЛтд.», 1996, с.549-557

21. Соколов В.Н. Педагогическая эвристика: Введение в теорию и методику эвристической деятельности // М., Аспект Пресс, 1995, с.164-173

22. Animal Cell Culture. A Practical Apprroach. Ed. by R.J. Treshney // Oxford-Washington D.C., YRL Press,1986, p.256-303

23. Qureshi А.А., Flood K.W. Comparison of a luminescent bacterial test with other bioassays for determining toxicity of pure compounds and complex // Aquatic Toxicity and Hazard Assessment: 5-th Conference, ASTM STP 768, Philadelphia, 1982, p. 179-195

24. Карасюк B.A., Гительзон И.И. Бактериальная биолюминесценция и биолюминесцентный анализ // Биофизика, 1982, т.27, вып.6, с.937-953

25. Рекомендации по определению токсичности производственных сточных вод с использованием рачка дафния магна // Утв.дир.ВНИИ ВОДГЕО С.Я. Яковлевым 21.06.83 УДК 577.472

26. Методика определения токсичности фуражного зерна, продуктов его переработки и комбикормов на рыбках гуппи // Минсельхоз СССР, 1980, 8с.

27. Метелев В.В., Канаев А.И., Дзасохова Н.Г. Водная токсикология // М., Колос, 1971,247с.

28. Бойкова Э.Я. Простейшие биомониторы морской среды // Рига, Зинатне, 1989,215с.

29. Полянский Ю.И. Температурные адаптации у инфузорий. Зависимость теплоустойчивости Paramecium caudatum от температурных условий существования // Зоол. ж., 1957, т.36, вып.11:1630-1645

30. Долгов В.А. Методические аспекты и практическое применение ускоренной биологической оценки кормов, продуктов животноводства и других объектов ветеринарно-санитарного контроля // Дисс. на соиск. степ. докт. вет. наук, М., 1992г

31. Edmiston С.Е. Evaluation of Carbamate Toxicity: Acute Toxicity in a Culture of Paramecium multimicronucleatum Upon Exposure to Aldicarb, Carbonyl and Mexacarbate as Measured by Waburg Respirometry and Acute Plate Assay // Euv.Res., 1985,36, p.338

32. Ose Y., Sato T. Testing for the toxicity of chemical Tetrahimena pyriformis // Sciens of Total Environment, 1985, 43, p. 149-157

33. Гроздов A.O. Токсикологическая характеристика некоторых видов зоопланктона в связи с биотестированием сточных вод и загрязняющих веществ//Автореф.канд.дисс. Москва, 1987

34. Розанцев Э.Г., Черемных Е.Г., Кузнецова JI.C. Управляемая биоприборная модель для разработки методик оценки качества различных объектов // Экология и промышленность России, №6, 2001, с.34-36

35. Беленький Н.Г. Биологическая ценность продуктов животного происхождения как основа выбора рациональной технологии их производства // в кн. Повышение качества продуктов животноводства, М., 1978, с.10-39

36. Серавин JI.H. Функциональные изменения Paramecium caudatum в процессе привыкания к химическим агентам // Дисс.на соиск. степ.канд.биол.наук, JI., 1958, с.84-87

37. Konopikowa L. Experiment to selected waste waters on Protozooa // Acta Univ.Carol.-Biol., 1973, №3-3, p.l 25-133

38. Суханова K.M. Температурные адаптации у простейших // JI., Наука, 1968, 139с.

39. Голубкова Э.Г. Экология Paramecium caudatum (Ehrenberg) в условиях острой и хронической интоксикации / Дисс.на соиск. ст. канд.биол.наук, Петрозаводск, 1980

40. Раилкин А.Н. Фагоцитоз и выбор пищи у инфузорий седиментаторов // Дисс.на соиск.степ.канд.биоло.наук, Л., 1975

41. Бурковский И.В. Основы экологии свободноживущих инфузорий // Дисс. на соиск. степ. док. биол. наук, М., 1985

42. Ирлина И.С. Температурные адаптации у простейших // Дисс. на соиск. степ. канд. биол. наук, Л., 1964

43. Богдан А.С. Методические рекомендации. Комплексная биологическая оценка объектов природного и искусственного происхождения на Tetrahi-mena pyriformis // МЗ Беларусь, 1996,14с.

44. Арифов С.С. Сравнительное изучение степени интоксикации у больных острым гнойным средним отитом. // М., Вестник отоларинг. 1998, №3, с.23-24.

45. Селивановская С.Ю., Маслов А.П., Наумова Р.П. Токсикологическое тестирование сточных вод, подлежащих биологической очистке, с помощью ресничных инфузорий Euplotes patella и Paramecium caudatum. //ж.Химия и технология воды, 1993, 15, 9-10, с.686-688.

46. Гроздов А.О. Определение общей токсичности на инфузориях парамециях // Комбикорма, №4,1994, с.24-26

47. ГОСТ 13496.7-97 «Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма. Методы определения токсичности»

48. Виноходов Д.О. Токсикологические исследования кормов с использованием инфузорий//СПб, 1995, 80с.

49. Verhulst P.F. Notice sur la loi que la population suit dans son accroissement // Corr. Math. Et Phys. 10, 1838, 113-121

50. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика // М., ФАИР-ПРЕСС, 1998, 716с.

51. A.J. Lotka Elements of Physical biology // Williams and Wilkins, Baltimore, 1925

52. Вольтерра В. Математическая теория борьбы за существование // М., Наука, 1976

53. Колмогоров А.Н. Качественное изучение математических моделей динамики популяций //М., Проблемы кибернетики, 1972, Вып.5.

54. Ганшин В.М., Чебышев А.В., Фесенко А.В. Комплексные системы мониторинга токсикологической и экологической безопасности. // Специальная техника, 1998, № 4-5, с.2 10

55. Пожаров А.В., Попечителев Е.П. Возможности биотестирования при контроле промышленных загрязнений // Экологическая химия, 1996, 5(3), с.217-222

56. Захаров И. С. Метод и аппаратура для измерения концентрации инфузорий в медико-экологических исследованиях // Дисс. на соиск. канд. техн. наук,СПб., 1996

57. Еськов У.П. Метод токсикологической оценки полимерных материалов // Гигиена и санитария, 1985, №1, с.62-65

58. Маренков B.C. Разработка и использование люминесцентных методов для экологического мониторинга// Дисс. в виде науч.докл. на соиск.степ. канд.биол.наук., М., 1999, 30с.

59. Казанцев Г.Д., Курдячий М.И., Пустынский И.Н. Измерительное телевидение// М., Высшая школа, 1994,271с.

60. Batten С. Determining an Equilibrium Between P. caudatum Response to Negative Chemotaxis and Electrotaxis // Phoebus High School, 1993.

61. Leick V., Koppelhus U., Rosenberg J. Cilia-mediated oriented chemokinesis in Tetrahymena thermophila. J Eukaryot Microbiol 1994 Nov-Dec, 41,6, 546-553

62. Шарова И.Х. Зоология беспозвоночных. Учебник для вузов//М., Владос, 2002, с81-86

63. Eigner P. Evolution of Hypotrichida // J. Eukaryot. Microbiol., 48(1). 2001 pp. 70-79

64. Citation suggested: Brands, S.J. (сотр.) 1989-2002. Systema Naturae 2000. Amsterdam, The Netherlands/http://sn2000.taxonomy.nl/

65. Anmerman D., Schlegel M. Characterization of Two Sibling Species of Genus Stylonychia (Ciliata, Hypotricha): S. mytilus and S.lemnae/ Morphology and Reproductive Behavior// J.Protozool., 1983, 30(2), p.290-294

66. Berger, H. & Foissner, W. 1989. Morphology and biometry of some soil hy-potrichs (Protozoa, Ciliophora) from Europe and Japan. Bull. Br. Mus. Nat. Hist. (Zool.), 55:19 46.72. http://taxa.soken.ac.jp/http://taxa.soken.ac.jp

67. Свешников А.А. Прикладные методы теории случайных функций // М., Наука, 1968,463с.

68. Вентцель Е.С., Овчаров JI.A. Теория случайных процессов и ее инженерные приложения //М., Наука, 1991, 384с.

69. Корн Г., Корн Т. Справочник по математике для научных работников иинженеров I IM., Наука, 1978, с.584-606

70. Мейсон С., Клеменс Дж. Распознавание букв в экспериментальной читающей машине для слепых // в кн. Распознавание образов, М., Мир, 1970, с. 198-211

71. Елманова Н.З., Трепалин С.В. Delphi 4: технология Com // М., ДИАЛОГ-МИФИ, 1999, 320с.

72. Гроздов А.О., Цвылев О.П., Иванова Е.Г. Автобиоанализатор прибор для определения токсичности // Комбикормовая промышленность, 1996, №5, стр.16-17

73. Иванов А.С., Иванова Е.Г. (Черемных Е.Г.) Устройство для оценки качества продуктов живой и неживой природы // Патент № 2122025, БИ №3, 1998

74. Иванова Е.Г. (Черемных Е.Г.), Васильева А.В., Беленикина О.А., Кантере В.М., Мухамеджанова Биотест токсичности кормов // Птицеводство, 1999, №5, с.42-43

75. Иванова Е.Г. (Черемных Е.Г.), Васильева Н.В., Беленикина О.А. Способ и устройство для культивирования тест-организмов применяемых при оценке качества продуктов живой и неживой природы // Заявка №2000101016, БИПМ №3, от 2003

76. Розанцев Э.Г., Черемных Е.Г., Кузнецова Л.С. Автоматизированный биотест для токсикантов пищевых продуктов. // Мясная индустрия, №6,2001 г, с.37-39

77. Черемных Е.Г., Бахвалов С.А., Лукашевич М.Г. Прибор для автоматизации биологических исследований // Заявка №20001123566

78. Юферов Ф.М. Электрические машины автоматических устройств // М., Высш. шк., 1988,475с.

79. Хрущев В.В. Электрические машины систем автоматики // Л., Энергоатом-издат, 1985, 363с.

80. Арменский Е.В., Фалк Г.В. Электрические микромашины // М.,Высш. шк., 1985, 230с.

81. Бабаков Н.А., Воронов А.А., Воронова А.А., Дидук Г.А., Дмитриева Н.Д., Ким Д.П., Менский Б.М., Попович П.Н. Теория автоматического управленияЧасть 1. Теория линейных систем автоматического управления // М., Высшая школа, 1986,367с.